Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Микрокристаллическа дифракции электронов , или MicroEd , [1] [2] является CryoEM метод , который был разработан Gonen лаборатории в конце 2013 года на Janelia Campus исследования из Медицинского института Говарда Хьюза . MicroED - это форма электронной кристаллографии, в которой тонкие трехмерные кристаллы используются для определения структуры с помощью дифракции электронов .

Метод был разработан для определения структуры белков из нанокристаллов , которые обычно не подходят для дифракции рентгеновских лучей из-за их размера. Кристаллы, размер которых составляет одну миллиардную от размера, необходимого для рентгеновской кристаллографии, могут давать данные высокого качества. [3] Образцы заморожены и гидратированы, как и для всех других методов криоЭМ, но вместо использования просвечивающего электронного микроскопа ( ПЭМ ) в режиме визуализации его используют в режиме дифракции с чрезвычайно низкой электронной экспозицией (обычно <0,01 э - / Å 2 / с). Нанокристалл подвергается воздействию дифрагирующего луча и непрерывно вращается [2]в то время как дифракция снимается на быстрой камере как фильм. [2] Данные MicroED затем обрабатываются с использованием традиционного программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии без необходимости в специализированном программном обеспечении для анализа и уточнения структуры. [4] Важно отметить, что и оборудование, и программное обеспечение, используемое в эксперименте MicroED, являются стандартными и широко доступны.

Развитие [ править ]

Первая успешная демонстрация MicroEd было сообщено в 2013 году в Gonen лаборатории. [1] Структура лизоцима , классического тестируемого белка в рентгеновской кристаллографии . Ранее в 2013 году группа Abrahams независимо сообщила данные трехмерной дифракции электронов с использованием квантового детектора области Medipix на кристаллах лизоцима, но не смогла определить структуру из-за технических ограничений. [5]

Экспериментальная установка [ править ]

Опубликованы подробные протоколы настройки электронного микроскопа и сбора данных. [6]

Инструменты [ править ]

Микроскоп [ править ]

Данные MicroED собираются с помощью просвечивающей электронной (криогенной) микроскопии . Микроскоп должен быть оборудован апертурой для выбранной области, чтобы использовать дифракцию в выбранной области .

Детекторы [ править ]

Для сбора данных дифракции электронов в экспериментах MicroED использовались различные детекторы. Были использованы детекторы, использующие устройства с зарядовой связью (CCD) и комплементарную технологию металл-оксид-полупроводник (CMOS) . С помощью КМОП-детекторов можно интерпретировать индивидуальный счет электронов. [7]

Сбор данных [ править ]

Все еще дифракция [ править ]

Первым доказательством публикации концепции MicroED были кристаллы лизоцима. [1] С одного нанокристалла было собрано до 90 градусов данных с дискретными шагами в 1 градус между кадрами. Каждая дифракционная картина была получена при сверхнизкой мощности дозы ~ 0,01 э - / Å 2 / с. Данные по 3 кристаллам были объединены, чтобы получить структуру с разрешением 2,9 Å с хорошей статистикой уточнения, и они представляют собой первый случай, когда дифракция электронов была успешно использована для определения структуры дозозависимого белка из трехмерных микрокристаллов в криогенных условиях.

Непрерывное вращение сцены [ править ]

Вскоре после проверки принципа работы MicroED была улучшена путем применения непрерывного вращения во время схемы сбора данных. [2] Здесь кристалл медленно вращается в одном направлении, в то время как дифракция записывается на быструю камеру как фильм. Методология похожа на метод вращения в рентгеновской кристаллографии. Это привело к нескольким улучшениям качества данных и позволило обрабатывать данные с помощью стандартного программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии. [2] Преимущества непрерывного вращения MicroED включают уменьшение динамического рассеяния и улучшенную выборку обратного пространства. Непрерывное вращение - стандартный метод сбора данных MicroED с 2014 года.

Обработка данных [ править ]

Опубликованы подробные протоколы обработки данных MicroED. [4] Когда данные MicroED собираются с использованием непрерывного вращения столика, можно использовать стандартное программное обеспечение для кристаллографии .

Различия между MicroED и другими методами дифракции электронов [ править ]

Другие методы дифракции электронов, которые были разработаны для материаловедения для нечувствительных к излучению материалов, таких как неорганические соли, включают автоматизированную дифракционную томографию (ADT) [8] и вращательную дифракцию электронов (RED [9] ). Эти методы существенно отличаются от MicroED: в ADT используются дискретные шаги наклона гониометра для покрытия обратного пространства в сочетании с прецессией луча для заполнения промежутков. [8] ADT использует специализированное оборудование для прецессионной и сканирующей просвечивающей электронной микроскопии для отслеживания кристаллов. [8] КРАСНЫЙ цвет выполняется в ПЭМ, но гониометр наклоняется дискретно, а наклон луча используется для заполнения промежутков. [9]Для обработки данных ADT и RED используется специализированное программное обеспечение. [9] Важно отметить, что ADT и RED были разработаны и испытаны на нечувствительных к радиации неорганических материалах и солях и не были продемонстрированы для использования с белками или чувствительными к излучению органическими материалами, изученными в замороженном гидратированном состоянии.

Вехи [ править ]

Область действия метода [ править ]

MicroED использовался для определения структуры крупных глобулярных белков, [10] малых белков, [2] пептидов, [11] мембранных белков, [12] органических молекул, [13] [14] и неорганических соединений. [15] Во многих из этих примеров наблюдались водород и заряженные ионы. [11] [12]

Новые структуры α-синуклеина болезни Паркинсона [ править ]

Первые новые структуры, решенные с помощью MicroED, были опубликованы в конце 2015 года. [11] Эти структуры представляли собой пептидные фрагменты, которые образуют токсичное ядро α-синкулеина , белка, ответственного за болезнь Паркинсона, и позволяют понять механизм агрегации токсичных агрегатов. Структуры расшифрованы с разрешением 1,4 Å.

Новая белковая структура R2lox [ править ]

Первая новая структура белка, решенная с помощью MicroED, была опубликована в 2019 году. [16] Белок представляет собой металлофермент R2-подобную лиганд-связывающую оксидазу (R2lox) из Sulfolobus acidocaldarius. Структура была расшифрована с разрешением 3,0 Å путем молекулярной замены с использованием модели 35% идентичности последовательностей, построенной на основе ближайшего гомолога с известной структурой. Эта работа продемонстрировала, что MicroED можно использовать для получения неизвестной структуры белка.

Доступ к образованию и услугам MicroED [ править ]

Чтобы узнать больше о MicroED, можно посетить ежегодный курс MicroED Imaging Center в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе или курс MicroED в Diamond Light Source . Для получения более свежей информации о предстоящих встречах и семинарах, связанных с методами криогенной электронной микроскопии в целом, посетите страницу 3DEM Meetings and Workshops .

Некоторые университеты и компании предлагают услуги MicroED, в том числе MEDIC - Центр микрокристаллической электронной дифракции при Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе и Nanoimaging Services .

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Ши, Дан; Nannenga, Brent L; Иаданза, Мэтью Джи; Гонен, Тамир (2013-11-19). «Трехмерная электронная кристаллография микрокристаллов белков» . eLife . 2 : e01345. DOI : 10.7554 / elife.01345 . ISSN  2050-084X . PMC  3831942 . PMID  24252878 .
  2. ^ a b c d e f Nannenga, Brent L; Ши, Дан; Лесли, Эндрю GW; Гонен, Тамир (2014-08-03). «Определение структуры с высоким разрешением путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Методы природы . 11 (9): 927–930. DOI : 10,1038 / Nmeth.3043 . ISSN 1548-7091 . PMC 4149488 . PMID 25086503 .   
  3. ^ де ла Крус, М. Джейсон; Хаттне, Йохан; Ши, Дан; Зайдлер, Пол; Родригес, Хосе; Рейес, Фрэнсис Э; Савая, Майкл Р.; Cascio, Duilio; Вайс, Саймон С (2017). «Структуры с атомным разрешением из фрагментированных кристаллов белка с помощью метода криоЭМ MicroED» . Методы природы . 14 (4): 399–402. DOI : 10.1038 / nmeth.4178 . ISSN 1548-7091 . PMC 5376236 . PMID 28192420 .   
  4. ^ a b Хаттне, Йохан; Рейес, Фрэнсис Э .; Nannenga, Brent L .; Ши, Дан; де ла Крус, М. Джейсон; Лесли, Эндрю GW; Гонен, Тамир (01.07.2015). «Сбор и обработка данных MicroED» . Acta Crystallographica Раздел A . 71 (4): 353–360. DOI : 10.1107 / s2053273315010669 . ISSN 2053-2733 . PMC 4487423 . PMID 26131894 .   
  5. ^ Недерлоф, I .; van Genderen, E .; Li, Y.-W .; Абрахамс, JP (1 июля 2013 г.). «Детектор квантовой площади Medipix позволяет собирать данные дифракции вращательных электронов с субмикронных трехмерных кристаллов белка» . Acta Crystallographica Раздел D . 69 (7): 1223–1230. DOI : 10.1107 / S0907444913009700 . ISSN 0907-4449 . PMC 3689525 . PMID 23793148 .   
  6. ^ Ши, Дан; Nannenga, Brent L; де ла Крус, М. Джейсон; Лю, Цзиньян; Sawtelle, Стивен; Калеро, Гильермо; Рейес, Фрэнсис Э; Хаттне, Йохан; Гонен, Тамир (2016-04-14). «Сборник данных MicroED для кристаллографии макромолекул» . Протоколы природы . 11 (5): 895–904. DOI : 10.1038 / nprot.2016.046 . ISSN 1754-2189 . PMC 5357465 . PMID 27077331 .   
  7. ^ См. Также https://www.gatan.com/ccd-vs-cmos и https://www.gatan.com/techniques/imaging .
  8. ^ a b c Mugnaioli, E .; Горелик, Т .; Колб, У. (2009). « » Неэмпирический «структура раствор на основе данных дифракции электронов , полученных с помощью комбинации автоматизированной дифракционной томографии и методики прецессии». Ультрамикроскопия . 109 (6): 758–765. DOI : 10.1016 / j.ultramic.2009.01.011 . ISSN 0304-3991 . PMID 19269095 .  
  9. ^ a b c Ван, Вэй; Сунь, Цзюньлянь; Су, Джи; Ховмёллер, Свен; Цзоу, Сяодун (15.11.2013). «Трехмерная вращательная электронная дифракция: программное обеспечение RED для автоматизированного сбора и обработки данных» . Журнал прикладной кристаллографии . 46 (6): 1863–1873. DOI : 10.1107 / s0021889813027714 . ISSN 0021-8898 . PMC 3831301 . PMID 24282334 .   
  10. ^ Nannenga, Brent L; Ши, Дан; Хаттне, Йохан; Рейес, Фрэнсис Э; Гонен, Тамир (10.10.2014). «Структура каталазы, определенная MicroED» . eLife . 3 : e03600. DOI : 10.7554 / elife.03600 . ISSN 2050-084X . PMC 4359365 . PMID 25303172 .   
  11. ^ a b c Родригес, штат Джерси; Иванова, М .; Савая, MR; Cascio, D .; Reyes, F .; Ши, Д .; Johnson, L .; Guenther, E .; Сангван, С. (09.09.2015). «Структура MicroED сегмента GVVHGVTTVA из семейного мутанта A53T белка болезни Паркинсона, остатки альфа-синуклеина 47-56». DOI : 10,2210 / pdb4znn / PDB . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  12. ^ a b Liu, S .; Гонен, Т. (12.09.2018). «Структура MicroED ионного канала NaK показывает процесс распределения Na + в фильтре селективности». DOI : 10.2210 / pdb6cpv / PDB . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  13. ^ Галлахер-Джонс, Маркус; Глинн, Калина; Бойер, Дэвид Р .; Martynowycz, Michael W .; Эрнандес, Эвелин; Мяо, Дженнифер; Зи, Чи-Те; Новикова, Ирина В .; Гольдшмидт, Лукаш (2018-01-15). «Крио-ЭМ структура суб-Ангстрема прионной протофибриллы выявляет полярный кламмер» . Структурная и молекулярная биология природы . 25 (2): 131–134. DOI : 10.1038 / s41594-017-0018-0 . ISSN 1545-9993 . PMC 6170007 . PMID 29335561 .   
  14. ^ Джонс, Кристофер; Мартынович, М; Хаттне, Йохан; Фултон, Тайлер Дж .; Штольц, Брайан М .; Родригес, Хосе А .; Нельсон, Осия; Гонен, Тамир (2018). «Метод CryoEM MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул» (PDF) . DOI : 10.26434 / chemrxiv.7215332.v1 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  15. ^ Вергара, Сандра; Lukes, Dylan A .; Martynowycz, Michael W .; Сантьяго, Улисес; Plascencia-Villa, Germán; Weiss, Simon C .; де ла Крус, М. Джейсон; Блэк, Дэвид М .; Альварес, Маркос М. (31.10.2017). «Структура MicroED Au146 (p-MBA) 57 при субатомном разрешении выявляет двойной кластер FCC» . Журнал писем по физической химии . 8 (22): 5523–5530. DOI : 10.1021 / acs.jpclett.7b02621 . ISSN 1948-7185 . PMC 5769702 . PMID 29072840 .   
  16. ^ Сюй, Хунъи; Лебретт, Гюго; Clabbers, Макс ТБ; Чжао, Цзинцзин; Гризе, Джулия Дж .; Цзоу, Сяодун; Хёгбом, Мартин (7 августа 2019 г.). «Решение новой структуры белка R2lox методом дифракции электронов на микрокристаллах» . Наука продвигается . 5 (8): eaax4621. DOI : 10.1126 / sciadv.aax4621 .

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Сведения о MicroED от ThermoFisher Scientific, крупного производителя просвечивающих электронных микроскопов
    • Видеоинтервью о разработке MicroED и его приложений
  • Фон из архива Джанелии на MicroED
  • Справочная информация и публикации о MicroED из лаборатории Гонена