Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

FAST ( метка, активирующая флуоресценцию и смещение абсорбции ) - это небольшая генетически-кодируемая белковая метка.что позволяет получать отчеты о флуоресценции интересующих белков. В отличие от природных флуоресцентных белков и производных, таких как GFP или mCherry, FAST сам по себе не флуоресцирует. Он может избирательно связывать флуорогенный хромофор, полученный из 4-гидроксибензилиден роданина (HBR), который сам по себе не является флуоресцентным, если не связан. После связывания пара молекул проходит через уникальный механизм активации флуорогена, основанный на двух спектроскопических изменениях, увеличении квантового выхода флуоресценции и красном смещении поглощения, что обеспечивает высокую селективность мечения. Система отчетов FAST-fluorogen может использоваться во флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и любых других флуорометрических методах для исследования живого мира: биосенсоров, торговли белками.

FAST, небольшой белок 14 кДа, был сконструирован из фотоактивного желтого белка (PYP) путем направленной эволюции. Об этом впервые сообщили в 2016 году исследователи из Ecole normale supérieure de Paris . [1]

Механизм [ править ]

FAST относится к химико-генетической стратегии специфической маркировки белков. Пептидный домен, называемый «меткой», генетически кодируется для связывания с представляющим интерес белком (путем комбинации их соответствующих генов посредством трансфекции или инфицирования). Этот тег является якорем для добавления синтетического флуоресцентного зонда. [2] Такой химико-генетический подход уже был реализован помимо природных флуоресцентных белков, таких как GFP или их производных, таких как mCherry, в нескольких уже широко используемых системах:

  • с 2003 года SNAP-tag , двухкомпонентная система отчетности, состоящая из пептида 19 кДа, полученного из человеческого фермента, O 6 -метилгуанин-ADN метилтрансферазы, эволюционировала с образованием ковалентных связей с флуоресцентными производными O 6 -бензилгуанина; SNAP-тег позже был преобразован в ортогональный тег, CLIP-тег ;
  • с 2008 года - HaloTag , двухкомпонентная система отчетности, состоящая из пептида 33 кДа, полученного из бактериального фермента, галогеналкандешалогеназы, который может специфически связывать функциональные галогенированные синтетические лиганды, чаще всего флуоресцентные для визуализации клеток ( например , Coumarine, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM, TMR).
Обратимое связывание между FAST и флуорогеном

Было описано несколько версий FAST, отличающихся небольшим количеством мутаций, например , FAST1 (он же Y-FAST), FAST2 (он же iFAST) или димер, td-FAST. [3] Также была разработана версия с расщеплением комплементации для мониторинга белок-белковых взаимодействий, splitFAST. [4] Ряд плазмид, отображающих гены FAST или splitFAST, доступен в Addgene. [5]

Приложения [ править ]

Система отчетов FAST-fluorogen используется во флуоресцентной микроскопии , проточной цитометрии и любых других флуорометрических методах для исследования живого мира, включая биосенсоры и торговлю белками . Сообщалось, что FAST используется для динамической визуализации биопленок из-за его уникальной способности флуоресценции в условиях низкого содержания кислорода. [6] По той же причине он позволяет получать изображения и анализировать анаэробные микроорганизмы, такие как Clostridium , используемых для ферментации биомассы , такой как ферментация ABE . [7] Также сообщалось о FAST для микроскопии живых клеток со сверхвысоким разрешением . [8]

The Twinkle Factory разработала ряд флуорогенов для FAST и его производных, различающихся по длине волны излучения, яркости и сродству с метками. Некоторые из них не проникают, то есть они не могут проходить через клеточные мембраны, следовательно, специфически маркируют мембранные белки или внеклеточные белки, что позволяет, например , контролировать перемещение от синтеза до выделения. [9]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Пламон, Мари-Од; Бийон-Дени, Эммануэль; Маурин, Сильви; Гаурон, Кэрол; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Ши, Цзянь; Керар, Жером; Пан, Буян; Россиньоль, Жюльен; Монкок, Карин (28 декабря 2015 г.). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющая абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo» . Труды Национальной академии наук . 113 (3): 497–502. DOI : 10.1073 / pnas.1513094113 . ISSN  0027-8424 . PMC  4725535 . PMID  26711992 .
  2. ^ Пламон, Мари-Од; Бийон-Дени, Эммануэль; Маурин, Сильви; Гаурон, Кэрол; Pimenta, Frederico M .; Specht, Christian G .; Ши, Цзянь; Керар, Жером; Пан, Буян; Россиньоль, Жюльен; Монкок, Карин (19 января 2016 г.). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющая абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo» . Труды Национальной академии наук . 113 (3): 497–502. Bibcode : 2016PNAS..113..497P . DOI : 10.1073 / pnas.1513094113 . ISSN 0027-8424 . PMC 4725535 . PMID 26711992 .   
  3. ^ Тебо, Элисон G .; Pimenta, Frederico M .; Чжан, Ю; Готье, Арно (2018-10-02). «Улучшенные химико-генетические флуоресцентные маркеры для микроскопии живых клеток» (PDF) . Биохимия . 57 (39): 5648–5653. DOI : 10.1021 / acs.biochem.8b00649 . ISSN 0006-2960 . PMID 30204425 .   
  4. ^ Тебо, Элисон G .; Готье, Арно (14.08.2019). «Авторская поправка: расщепленный флуоресцентный репортер с быстрым и обратимым дополнением» . Nature Communications . 10 (1): 3730. Bibcode : 2019NatCo..10.3730T . DOI : 10.1038 / s41467-019-11689-6 . ISSN 2041-1723 . PMC 6694131 . PMID 31413330 .   
  5. ^ "Addgene: плазмиды лаборатории Арно Готье" . www.addgene.org . Проверено 25 ноября 2019 .
  6. ^ Монмейран, Амори; Томен, Филипп; Жонкьер, Гюго; Сюро, Франк; Ли, Ченге; Пламон, Мари-Од; Дуарш, Карин; Казелла, Жан-Франсуа; Готье, Арно; Генри, Нелли (2018-07-09). «Индуцибельный химико-генетический флуоресцентный маркер FAST превосходит классические флуоресцентные белки в количественной оценке динамики бактериальной биопленки» . Научные отчеты . 8 (1): 10336. Bibcode : 2018NatSR ... 810336M . DOI : 10.1038 / s41598-018-28643-Z . ISSN 2045-2322 . PMC 6037777 . PMID 29985417 .   
  7. ^ Charubin, Камил; Беннетт, Р. Кайл; Быстро, Алан Дж .; Папутсакис, Элефтериос Т. (ноябрь 2018 г.). «Конструирование организмов Clostridium как фабрики микробных клеток: проблемы и возможности». Метаболическая инженерия . 50 : 173–191. DOI : 10.1016 / j.ymben.2018.07.012 . ISSN 1096-7176 . PMID 30055325 .  
  8. ^ Venkatachalapathy, Muthukumaran; Белапуркар, Вивек; Хосе, Мини; Готье, Арно; Наир, Дипак (2019). «Визуализация живых клеток в сверхвысоком разрешении по радиальным колебаниям с использованием меток, связывающих флюорог». Наноразмер . 11 (8): 3626–3632. DOI : 10.1039 / c8nr07809b . ISSN 2040-3364 . PMID 30734810 .  
  9. ^ Ли, Ченге; Мортон, Орелиен; Пламон, Мари-Од; Родригес, Ванесса; Оджар, Изабель; Волович, Мишель; Ле Со, Томас; Перес, Франк; Вриз, Софи; Жюльен, Людовик; Жолио, Ален (20.06.2018). «Флуорогенное исследование переноса белков через мембраны» (PDF) . Биоконъюгатная химия . 29 (6): 1823–1828. DOI : 10.1021 / acs.bioconjchem.8b00180 . ISSN 1043-1802 . PMID 29791141 .