Парный тег
Теги с парными концами (PET) (иногда «diTags с парными концами» или просто «ditags») представляют собой короткие последовательности на 5 ' и 3' концах фрагмента ДНК , которые достаточно уникальны, чтобы они (теоретически) существовали только вместе . один раз в геноме , что делает последовательность ДНК между ними доступной при поиске (если доступны данные о последовательности полного генома) или при дальнейшем секвенировании (поскольку сайты меток достаточно уникальны, чтобы служить сайтами отжига праймеров ). Метки с парными концами (ПЭТ) существуют в библиотеках ПЭТ с отсутствием промежуточной ДНК, то есть ПЭТ «представляет» более крупный фрагмент геномной или кДНК .состоящим из короткой 5'-линкерной последовательности, короткой 5'-метки последовательности, короткой 3'-метки последовательности и короткой 3'-линкерной последовательности. Концептуально было показано, что 13 пар оснований достаточно для однозначного картирования тегов. [1] Однако более длинные последовательности более практичны для однозначного сопоставления чтений . Эндонуклеазы ( обсуждаемые ниже), используемые для получения ПЭТ, дают более длинные метки (18/20 пар оснований и 25/27 пар оснований), но последовательности из 50–100 пар оснований будут оптимальными как для картирования, так и для экономической эффективности. [1] После извлечения ПЭТ из множества фрагментов ДНК они соединяются (конкатенируются) вместе для эффективного секвенирования. В среднем 20–30 тегов можно секвенировать с помощью метода Сэнгера , который имеет большую длину считывания.[1] Поскольку последовательности тегов короткие, отдельные ПЭТ хорошо подходят для секвенирования следующего поколения, которое имеет короткую длину считывания и более высокую пропускную способность. Основными преимуществами ПЭТ-секвенирования являются его более низкая стоимость за счет секвенирования только коротких фрагментов, обнаружение структурных вариантов в геноме и повышенная специфичность при обратном выравнивании с геномом по сравнению с одиночными метками, которые включают только один конец фрагмента ДНК.
Интересующие фрагменты геномной ДНК или комплементарной ДНК (кДНК) клонируют в плазмидные векторы . Сайты клонирования фланкированы адаптерными последовательностями, которые содержат сайты рестрикции для эндонуклеаз (обсуждается ниже). Вставки лигируют с плазмидными векторами, а затем отдельные векторы трансформируют в E. coli , создавая библиотеку для ПЭТ. Последовательности ПЭТ получают путем очистки плазмиды и расщепления специфичной эндонуклеазой, оставляя две короткие последовательности на концах векторов. Во внутримолекулярных (разбавленных) условиях векторы рециркулируют и лигируют, оставляя в векторе только диметки. Последовательности, уникальные для клона, теперь объединены в пары. В зависимости от секвенирования следующего поколенияС помощью этого метода последовательности ПЭТ могут быть оставлены в единственном числе, димеризованы или объединены в длинные цепочки. [1]
Вместо клонирования адаптеры, содержащие последовательность эндонуклеазы, лигируют с концами фрагментированной геномной ДНК или кДНК. Затем молекулы самоциркулируют и расщепляются эндонуклеазой, высвобождая ПЭТ. [1] Перед секвенированием эти ПЭТ лигируют с адаптерами, к которым отжигаются праймеры ПЦР для амплификации. Преимущество построения библиотеки на основе клонирования состоит в том, что оно сохраняет фрагменты или кДНК нетронутыми для будущего использования. Однако процесс построения намного дольше, чем метод без клонирования. Компании, занимающиеся секвенированием следующего поколения , разработали варианты построения библиотек в соответствии с их технологиями. [1]
В отличие от других эндонуклеаз, эндонуклеазы рестрикции MmeI (тип IIS) и EcoP15I (тип III) сокращаются ниже своих сайтов связывания-мишеней. MmeI разрезает 18/20 пар оснований ниже по течению [2] , а EcoP15I разрезает 25/27 пар оснований ниже по течению. [3] Поскольку эти рестрикционные ферменты связываются со своими целевыми последовательностями, расположенными в адаптерах, они разрезают и высвобождают векторы, которые содержат короткие последовательности фрагмента или кДНК, лигированные с ними, продуцируя ПЭТ.
