Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
(а) Флуоресцентные изображения пыльцевого зерна с оптическими срезами . (б) Комбинированное изображение. (c) Комбинированное изображение группы пыльцевых зерен. [1]

Оптическое сечение - это процесс, с помощью которого микроскоп соответствующей конструкции может создавать четкие изображения фокальных плоскостей в глубине толстого образца. Это используется для уменьшения потребности в тонких срезах с использованием таких инструментов, как микротом . Для оптического сечения используется множество различных методов, и несколько методов микроскопии специально разработаны для улучшения качества оптического сечения.

Хорошее оптическое сечение, часто называемое хорошей глубиной или разрешением по оси Z, популярно в современной микроскопии, поскольку оно позволяет выполнять трехмерную реконструкцию образца из изображений, снятых в различных фокальных плоскостях.

Оптическое сечение в традиционных световых микроскопах [ править ]

См. Также: Глубина резкости.

В идеальном микроскопе только свет из фокальной плоскости может достигать детектора (обычно наблюдателя или ПЗС-матрицы ), создавая четкое изображение плоскости образца, на котором фокусируется микроскоп. К сожалению, микроскоп не так уж и специфичен, и свет от источников за пределами фокальной плоскости также достигает детектора; в толстом образце между фокальной плоскостью и линзой объектива может быть значительное количество материала и, следовательно, паразитный сигнал .

Без каких-либо модификаций микроскопа, то есть с помощью простого широкоугольного светового микроскопа , качество оптического сечения регулируется теми же физическими принципами, что и эффект глубины резкости в фотографии . Для объектива с высокой числовой апертурой , эквивалентной широкой диафрагме , глубина резкости мала ( неглубокий фокус ) и дает хорошее оптическое сечение. Объективы с большим увеличением обычно имеют более высокую числовую апертуру (и, следовательно, лучшее оптическое сечение), чем объективы с низким увеличением. Масляные иммерсионные объективы обычно имеют даже большие числовые апертуры, что улучшает оптическое сечение.

Разрешение в направлении глубины (далее «Разрешение г») стандартного широкого поля микроскопа зависит от числовой апертуры и длины волны света и может быть аппроксимировано как:

где λ - длина волны, n - показатель преломления иммерсионной среды линзы объектива и NA - числовая апертура. [2]

Для сравнения, поперечное разрешение можно приблизительно оценить как: [3]

Методы улучшения оптических секций [ править ]

Световая микроскопия [ править ]

Помимо увеличения числовой апертуры, существует несколько методов улучшения оптических срезов в светопольной световой микроскопии. Большинство микроскопов с масляными иммерсионными объективами достигают пределов числовой апертуры, возможных из-за пределов преломления .

Основная статья: дифференциальный интерференционный контраст

Дифференциальный интерференционный контраст (ДИК) обеспечивает умеренное улучшение оптического сечения. В DIC образец эффективно освещается двумя слегка смещенными источниками света, которые затем создают изображение, возникающее из-за разности фаз двух источников. Поскольку смещение в источниках света невелико, единственная разница в фазе возникает из-за материала, близкого к фокальной плоскости.

Флуоресцентная микроскопия [ править ]

Во флуоресцентной микроскопии объекты вне фокальной плоскости мешают изображению, только если они освещены и флуоресцируют. Это добавляет дополнительный способ улучшения оптического сечения, делая освещение специфичным только для фокальной плоскости.

Основная статья: конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия использует точку сканирования или точки света для освещения образца. В сочетании с отверстием в сопряженной фокальной плоскости это действует, чтобы отфильтровать свет от источников за пределами фокальной плоскости, чтобы улучшить оптическое сечение. [4]

Основная статья: Световая листовая флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия на основе световых листов освещает образец возбуждающим светом под углом 90 ° к направлению наблюдения, то есть только фокальная плоскость освещается с помощью лазера, который сфокусирован только в одном направлении (световой лист). [5] Этот метод эффективно уменьшает свет вне фокуса и может, кроме того, привести к небольшому улучшению продольного разрешения по сравнению с эпифлуоресцентной микроскопией.

Основные статьи: микроскопия с двухфотонным возбуждением и многофотонный флуоресцентный микроскоп.

Методы двойного и многофотонного возбуждения используют тот факт, что флуорофоры можно возбуждать не только одним фотоном с правильной энергией, но также несколькими фотонами, которые вместе обеспечивают правильную энергию. Дополнительный зависящий от концентрации эффект, требующий одновременного взаимодействия нескольких фотонов с флуорофором, дает стимуляцию только очень близко к фокальной плоскости. Эти методы обычно используются вместе с конфокальной микроскопией. [6]

Дальнейшие улучшения в оптическом секционировании находятся в стадии активной разработки, в основном они работают с помощью методов, позволяющих обойти дифракционный предел света. Примеры включают однофотонную интерферометрию через две линзы объектива для получения чрезвычайно точной информации о глубине одного флуорофора [7] и микроскопию с трехмерным структурированным освещением . [8]

Оптическое сечение обычных широкоугольных микроскопов можно значительно улучшить с помощью деконволюции , метода обработки изображений для удаления размытия изображения в соответствии с измеренной или вычисленной функцией рассеяния точки . [9]

Клиринговые агенты [ править ]

Оптическое сечение можно улучшить за счет использования очищающих агентов с высоким показателем преломления (> 1,4), таких как бензиловый спирт / бензилбензоат (BABB) или бензиловый эфир [10], которые делают образцы прозрачными и, следовательно, позволяют наблюдать за внутренними структурами. .

Другое [ править ]

В несветовых микроскопах оптическое сечение развито недостаточно. [ необходима цитата ]

Рентгеновские и электронные микроскопы обычно имеют большую глубину резкости (плохое оптическое сечение), и поэтому тонкое сечение образцов все еще широко используется.

Хотя подобная физика определяет процесс фокусировки, [11] сканирующие зондовые микроскопы и сканирующие электронные микроскопы обычно не обсуждаются в контексте оптического сечения, поскольку эти микроскопы взаимодействуют только с поверхностью образца.

Микроскопия полного внутреннего отражения - это метод флуоресцентной микроскопии, который намеренно ограничивает наблюдение либо верхней, либо нижней поверхностью образца, но с чрезвычайно высоким разрешением по глубине.

Трехмерное изображение с использованием комбинации фокального сечения и наклона было продемонстрировано теоретически и экспериментально для обеспечения исключительного трехмерного разрешения на больших полях обзора. [12]

Альтернативы [ править ]

Основные альтернативы оптическому секционированию:

  • Тонкие срезы образца, например, используемые в гистологии .
  • Томография , которая особенно хорошо развита для просвечивающей электронной микроскопии .

Ссылки [ править ]

  1. ^ Цянь, Цзя; Лей, Мин; Дэн, Дэн; Яо, Баоли; Чжоу, Син; Ян, Яньлун; Ян, Шаохуэй; Мин, Цзюньвэй; Ю, Сянхуа (2015). «Полноцветная оптическая секционная микроскопия со структурированным освещением» . Научные отчеты . 5 : 14513. Bibcode : 2015NatSR ... 514513Q . DOI : 10.1038 / srep14513 . PMC  4586488 . PMID  26415516 .
  2. ^ Nikon MicroscopyU - Глубина резкости и глубина резкости
  3. ^ Nikon MicroscopyU - Разрешение
  4. ^ Conchello JA, Lichtman JW (декабрь 2005). «Оптическая секционная микроскопия». Nat. Методы . 2 (12): 920–31. DOI : 10.1038 / nmeth815 . PMID 16299477 . 
  5. ^ Huisken, J .; Swoger, J .; Бене, Ф. Дель; Wittbrodt, J .; Стельцер, EH (2004). «Оптическое сечение глубоко внутри живых эмбрионов с помощью микроскопии с селективным освещением». Наука . 305 (5686): 1007–1009. Bibcode : 2004Sci ... 305.1007H . CiteSeerX 10.1.1.456.2250 . DOI : 10.1126 / science.1100035 . PMID 15310904 .  
  6. ^ Gratton Е, Барри NP, Beretta S, Селли A (сентябрь 2001). «Многофотонная флуоресцентная микроскопия» . Методы . 25 (1): 103–10. DOI : 10,1006 / meth.2001.1219 . PMID 11559001 . 
  7. ^ Штенгель G, Гэлбрейт JA, Гэлбрейт CG, и др. (Март 2009 г.). «Интерферометрическая флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения разрешает трехмерную ультраструктуру клеток» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 106 (9): 3125–30. Bibcode : 2009PNAS..106.3125S . DOI : 10.1073 / pnas.0813131106 . PMC 2637278 . PMID 19202073 .  
  8. Перейти ↑ Carlton PM (2008). «Трехмерная структурированная световая микроскопия и ее применение к структуре хромосом» . Chromosome Res . 16 (3): 351–65. DOI : 10.1007 / s10577-008-1231-9 . PMID 18461477 . 
  9. ^ Sibarita JB (2005). «Деконволюционная микроскопия». Adv. Биохим. Англ. Biotechnol . Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии. 95 : 201–43. DOI : 10.1007 / b102215 . ISBN 978-3-540-23698-6. PMID  16080270 .
  10. ^ Беккер, К., Jährling, Н., Saghafi, С., Weiler, Р., & Dodt, HU (2012). «Химическая очистка и обезвоживание GFP, экспрессирующих мозг мышей» . PLOS ONE . 7 (3): e33916. Bibcode : 2012PLoSO ... 733916B . DOI : 10.1371 / journal.pone.0033916 . PMC 3316521 . PMID 22479475 .  CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  11. ↑ Борисевич, А.Ю .; Lupini, AR; Pennycook, SJ (21 февраля 2006 г.). «Глубинное сечение с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа с коррекцией аберраций» . Труды Национальной академии наук . 103 (9): 3044–3048. DOI : 10.1073 / pnas.0507105103 .
  12. ^ Hovden, R; Эрциус, П. (2014). «Преодоление предела Кроутера: сочетание глубинного сечения и наклонной томографии для высококачественных и широкоугольных трехмерных реконструкций». Ультрамикроскопия . 140 : 26–31. arXiv : 1402.0028 . DOI : 10.1016 / j.ultramic.2014.01.013 . PMID 24636875 .