Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Простая колонка для Ni 2+ - аффинной хроматографии . Образец и последующие буферы вручную заливаются в колонку.

Полигистидин-тег представляет собой аминокислотный мотив в белках , которые , как правило , состоит из по меньшей мере шести гистидина ( Его ) остатки, часто на N- или С-конце белка. Он также известен как гекса-гистидин-тег , 6xHis-тег , His6-тег под названием HIS TAG (серийный номер товарного знака США 74242707) и чаще всего как His-Tag . Тег был изобретен компанией Roche [1], хотя использование гистидинов и их векторов распространяется компанией Qiagen . Различные наборы для очистки белков, меченных гистидином, доступны от Qiagen., Sugma , Thermo Scientific , GE Healthcare , Macherey-Nagel, Cube Biotech , Clontech, Bio-Rad , [Bio-Works ] и другие.

Использование тега для академических пользователей не ограничивалось; однако коммерческие пользователи должны были выплачивать роялти компании «Рош». Срок действия первоначального патента истек 11 февраля 2003 г., и теперь он является государственной собственностью; Текущие претензии по роялти основаны на гораздо более узком наборе более поздних патентов. Подходящие последовательности тегов доступны бесплатно для коммерческого использования; например, MK (HQ) 6 можно использовать для усиленной экспрессии в E. coli и удаления метки. Общее количество остатков гистидина может варьироваться в метке от двух до 10 или более остатков His. N- или C-концевые his-метки могут также сопровождаться или предшествовать, соответственно, подходящей аминокислотной последовательностью, которая облегчает удаление полигистидиновой метки с использованием эндопептидаз.. Эта дополнительная последовательность не требуется, если экзопептидазы используются для удаления N-концевых His-меток (например, Qiagen TAGZyme). Кроме того, расщепление экзопептидазой может решить неспецифическое расщепление, наблюдаемое при использовании удаления метки на основе эндопротеазы. Полигистидин метка часто используется для аффинной очистки из генетически модифицированных белков.

Принцип [ править ]

Три вида рентгеновской структуры Ni (NTA) (H 2 O) 2

В общем, белки обладают более или менее способностью координировать ионы металлов на своей поверхности, и можно разделить белки с помощью хроматографии, используя разницу в их сродстве. Это аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов, анонсированная в 1975 году. [2] Последующие исследования показали, что среди аминокислот, составляющих белки, гистидин сильно участвует в координационной связи с ионами металлов. [3]Следовательно, если с помощью генной инженерии к концу белка добавить несколько гистидинов, сродство белка к иону металла значительно возрастет, и основная идея состоит в том, что очистку можно легко провести. Когда белок, имеющий His-метку, приводится в контакт с носителем, на котором иммобилизован ион металла, например никель, в условиях pH 8 или выше, остаток гистидина хелатирует ион металла и связывается с носителем. Поскольку другие белки не связываются с носителем или связываются очень слабо, их можно удалить, промывая носитель подходящим буфером. После этого путем удаления имидазола или подобного из носителя можно выделить белок, имеющий His-метку, с высокой чистотой.

Практический выбор [ править ]

Перевозчик [ править ]

На рынке представлены различные носители, такие как агароза Ni - NTA (никель - нитрилотриуксусная кислота). Он упакован в колонку и используется в сочетании с центрифугированием и магнитной сепарацией в пробирке.

Ионы металлов [ править ]

Как ион металла, медь имеет наивысшее сродство, и сродство уменьшается в порядке убывания никеля, цинка и кобальта [ цитата необходима ] . Никель часто используется для обычных целей, а кобальт используется, когда желательно повысить чистоту очистки.

Метод элюирования [ править ]

Для того, чтобы элюировать His-меченный белок из носителя, существует множество следующих методов, и он будет использоваться надлежащим образом в соответствии с целью. Чтобы избежать денатурации белков, желательно иметь как можно более мягкий раствор, и с этой точки зрения часто используется добавление имидазола.

Конкуренция с аналогами [ править ]

Когда соединение, имеющее структуру, подобную остатку гистидина, добавляется в высокой концентрации, белок конкурирует с координацией иона металла, так что белок отделяется от носителя. Имидазол представляет собой соединение, составляющее боковую цепь гистидина, и часто используется в концентрации 150 мМ или более. Кроме того, в некоторых случаях можно использовать гистидин и гистамин.

Снижение pH [ править ]

Когда pH снижается, остаток гистидина протонируется и выходит из носителя, потому что ион металла не может быть скоординирован. Когда никель используется в качестве иона металла, его элюирование составляет около 4, а кобальта - около 6.

Удаление ионов металлов [ править ]

Когда добавляется сильный хелатирующий агент, белок отделяется от носителя, потому что ион металла, иммобилизованный на носителе, теряется. Используется исключительно ЭДТА.

Приложения [ править ]

Очистка белков [ править ]

Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином, экспрессированных в Escherichia coli [4] и других прокариотических системах экспрессии. Бактериальные клетки собирают центрифугированием, и полученный осадок клеток лизируют либо физическими средствами, либо с помощью детергентов и ферментов, таких как лизоцим, или любой их комбинации. На этой стадии сырой лизат содержит рекомбинантный белок среди многих других белков, происходящих от бактериального хозяина. Эту смесь инкубируют с аффинной смолой, содержащей связанный двухвалентный никель или кобальт.ионы, которые коммерчески доступны в различных вариантах. Никель и кобальт обладают схожими свойствами и, поскольку они являются соседними переходными металлами периода 4 ( v. Триада железа ). Эти смолы, как правило, представляют собой сефарозу / агарозу, функционализированную хелатирующим агентом , таким как иминодиуксусная кислота (Ni-IDA) и нитрилотриуксусная кислота (Ni-NTA) для никеля и карбоксиметил-аспартат (Co-CMA) для кобальта, который связывает полигистидиновая метка с микромолярным сродством. Эрнст Хочули и др. соединил в 1987 г. лиганд NTA и ионы никеля с шариками агарозы . [5]Затем смолу промывают фосфатным буфером для удаления белков, которые специфически не взаимодействуют с ионами кобальта или никеля. С помощью методов на основе Ni эффективность промывки можно повысить добавлением 20 мМ имидазола (белки обычно элюируются 150-300 мМ имидазолом). Как правило, смолы на основе никеля обладают более высокой связывающей способностью, а смолы на основе кобальта обладают наивысшей чистотой. Чистоту и количество белка можно оценить с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга . [ необходима цитата ]

Аффинная очистка с использованием полигистидиновой метки обычно приводит к относительно чистому белку, когда рекомбинантный белок экспрессируется в прокариотических организмах. В зависимости от последующих применений, включая очистку белковых комплексов для изучения взаимодействия белков, очистка от высших организмов, таких как дрожжи или другие эукариоты, может потребовать тандемной аффинной очистки [6] с использованием двух меток для получения более высокой чистоты. Альтернативно, одностадийная очистка с использованием иммобилизованных ионов кобальта, а не ионов никеля, обычно дает существенное повышение чистоты и требует более низких концентраций имидазола для элюирования гист-меченного белка.

Мечение полигистидином - это вариант выбора для очистки рекомбинантных белков в денатурирующих условиях, поскольку его способ действия зависит только от первичной структуры белков. Например, даже когда рекомбинантный белок, принудительно экспрессируемый в E. coli, дает тельца включения и не может быть получен в виде растворимого белка, его можно очистить денатурацией с помощью мочевины или гидрохлорида гуанидина. Как правило, для этого метода связывание гистидина титруют с использованием pH вместо связывания имидазола - при высоком pH гистидин связывается с никелем или кобальтом, но при низком pH (~ 6 для кобальта и ~ 4 для никеля) гистидин становится протонируется и конкурирует с ионом металла. Сравните это с очисткой антител и очисткой GST, предварительным условием для которого является правильная (нативная) укладка белков. С другой стороны, говорят, что тег His имеет тенденцию к агрегированию и переводу в нерастворимую форму больше, чем другие теги сродства.

Колонки с полигистидиновой меткой задерживают несколько хорошо известных белков в качестве примесей. Одним из них является пептидилпролилизомераза FKBP-типа, которая появляется около 25 кДа (SlyD). Примеси обычно удаляются с помощью вторичной хроматографии или путем экспрессии рекомбинантного белка в штамме E. coli с дефицитом SlyD . [7] В качестве альтернативы, по сравнению со смолами на основе никеля, смолы на основе кобальта имеют меньшее сродство с SlyD из E. coli , но в некоторых случаях это умеренно полезно. [8]

Отделение одного от двух полигистидиновых тегов [ править ]

Белки с разным количеством полигистидиновых меток по-разному элюируются из никелево-сродной смолы. Для белков с одной гексагистидиновой меткой 75 мМ имидазола позволяет элюировать из Ni-NTA, тогда как для белков с двумя гексагистидиновыми метками для элюирования требуется 100 мМ имидазол. [ необходима цитата ] Это поэтапное элюирование можно использовать для выделения определенных белковых ансамблей из смеси, например определенных гетеромультимеров (например, гетеродимера AB из смеси, включающей гомодимеры AA и BB, если только субъединица B имеет полигистидиновую метку). Такой подход был использован при выделении моновалентного стрептавидина . [9]

Анализы связывания [ править ]

Мечение полигистидином может быть использовано для обнаружения белок-белковых взаимодействий таким же образом, как и анализ методом pull-down . Однако этот метод обычно считается менее чувствительным, а также ограничен некоторыми из более привередливых аспектов этого метода. Например, нельзя использовать восстановительные условия, нельзя использовать ЭДТА и многие типы моющих средств. Последние достижения в области двойной поляризационной интерферометрии поддаются ЭДТА и более широкому использованию реагентов, а использование таких сайт-специфичных тегов значительно упрощает прямое измерение связанных конформационных изменений . [ необходима цитата ]

Флуоресцентные метки [ править ]

Также были разработаны метки Hexahistadine CyDye. В них используется ковалентная координация никеля с группами ЭДТА, присоединенными к флуорофорам, для создания красителей, которые присоединяются к полигистидиновой метке. Было показано, что этот метод эффективен для отслеживания миграции и транспортировки белков. Также были недавние открытия, показывающие, что этот метод может быть эффективным для измерения расстояния с помощью флуоресцентной резонансной передачи энергии. [10]

Фторгистидиновые метки [ править ]

Сообщалось о полифторгистидиновой метке для использования в системах трансляции in vitro . [11] В этой системе используется расширенный генетический код, в котором гистидин заменен на 4-фторгистидин. Фторированный аналог включается в пептиды благодаря ослабленной субстратной специфичности гистидин-тРНК-лигазы и снижает общую pK a метки. Это позволяет селективно обогащать пептиды, меченные полифторгистидином, в присутствии сложных смесей традиционных полигистидиновых меток путем изменения pH промывочных буферов.

Добавление полигистидиновых тегов [ править ]

Добавление полигистидиновых тегов . (A) His-метка добавляется путем вставки ДНК, кодирующей интересующий белок, в вектор, который имеет метку, готовую к слиянию на С-конце. (B) His-метка добавляется с использованием праймеров, содержащих метку, после реакции ПЦР метка сливается с N-концом гена.

Наиболее распространенные полигистидиновые метки состоят из шести остатков гистидина (6xHis-метка), которые добавляются на N-конце, которому предшествует метионин, или С-конец перед стоп-кодоном в кодирующей последовательности интересующего белка . Выбор конца, на котором добавляется His-метка, будет зависеть в основном от характеристик белка и методов, выбранных для удаления метки. Некоторые концы скрыты внутри ядра белка, а другие важны для функции или структуры белка. В таких случаях выбор ограничивается другим концом. С другой стороны, большинство доступных экзопептидазможет только удалить His-тег с N-конца; удаление тега с C-конца потребует использования других методов. Важно учитывать, что компьютерное моделирование (с помощью молекулярной динамики) поможет вам выбрать один из вариантов, например, нужно ли переваривать His-тег или создавать его на N- или C-конце. [12]

Есть два способа добавить полигистидины. Самый простой - вставить ДНК, кодирующую белок, в вектор, кодирующий His-метку, так, чтобы она автоматически прикреплялась к одному из его концов (см. Рисунок) . Другой метод заключается в выполнении ПЦР с праймерами, которые имеют повторяющиеся гистидиновые кодоны (CAT или CAC) рядом с кодоном START или STOP в дополнение к нескольким (16 или более) основаниям с одного конца ДНК, кодирующей белок, который нужно маркировать ( см. пример праймера ниже). [ необходима цитата ]

Пример праймера, предназначенного для добавления 6xHis-метки с помощью ПЦР . Восемнадцать оснований, кодирующих шесть гистидинов, вставляются сразу после кодона START или прямо перед кодоном STOP. Рядом с His-тегом необходимо не менее 16 оснований, специфичных для интересующего гена. С 6 His белок будет иметь добавленную молекулярную массу 1 кДа. Часто линкер (такой как гли-гли-гли или гли-сер-гли) помещается между представляющим интерес белком и меткой 6 His, чтобы предотвратить влияние полигистидиновой метки на активность меченного белка. [ необходима цитата ]

Обнаружение [ править ]

Полигистидиновая метка также может использоваться для обнаружения белка с помощью антител против полигистидиновой метки или, альтернативно, путем окрашивания в геле ( SDS-PAGE ) с флуоресцентными зондами, несущими ионы металлов. Это может быть полезно для субклеточной локализации , ELISA , вестерн-блоттинга или других иммуноаналитических методов. [ необходима цитата ]

Иммобилизация [ править ]

Полигистидиновая метка может успешно использоваться для иммобилизации белков на поверхности, например, на микротитровальном планшете с никелевым или кобальтовым покрытием или на матрице белков . [13]

Похожие теги [ править ]

Тег HQ [ править ]

Тег HQ содержит чередующиеся гистидин и глутамин (HQHQHQ).

Тег HN [ править ]

Метка HN содержит чередующиеся гистидин и аспарагин (HNHNHNHNHNHN) и с большей вероятностью будет представлена ​​на поверхности белка, чем метки, содержащие только гистидин. Метка HN связывается с иммобилизованным ионом металла более эффективно, чем метка His. [14]

Тег HAT [ править ]

HAT-метка представляет собой пептидную метку (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK), полученную из куриной лактатдегидрогеназы , и, скорее всего, это растворимый белок без смещения в распределении заряда по сравнению с His-меткой. [15] Расположение гистидинов в теге HAT обеспечивает высокую доступность по сравнению с тегом His, и он эффективно связывается с иммобилизованным ионом металла.

См. Также [ править ]

  • Белковая метка

Ссылки [ править ]

  1. ^ Hochuli, E .; Bannwarth, W .; Döbeli, H .; Gentz, R .; Штюбер, Д. (1988). «Генетический подход к облегчению очистки рекомбинантных белков с новым металлохелатным адсорбентом». Био / Технологии . 6 (11): 1321–5. DOI : 10.1038 / nbt1188-1321 . S2CID  9518666 . ИНИСТ : 7229670 .
  2. ^ Porath, J .; и другие. (1975). «Металлохелатная аффинная хроматография, новый подход к фракционированию белков». Природа . 258 (5536): 598–599. Bibcode : 1975Natur.258..598P . DOI : 10.1038 / 258598a0 . PMID 1678 . S2CID 4271836 .  
  3. ^ Порат, J. (1992). «Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов». Protein Expr. Purif . 3 (4): 263–281. DOI : 10.1016 / 1046-5928 (92) 90001-D . PMID 1422221 . 
  4. ^ Hengen, Пол N (1995). «Очистка слитых белков His-Tag из Escherichia coli». Направления биохимических наук . 20 (7): 285–6. DOI : 10.1016 / S0968-0004 (00) 89045-3 . PMID 7667882 . 
  5. ^ Hochuli, E .; Döbeli, H .; Шахер А. (январь 1987 г.). «Новый металлохелатный адсорбент, селективный в отношении белков и пептидов, содержащих соседние остатки гистидина». Журнал хроматографии A . 411 : 177–184. DOI : 10.1016 / s0021-9673 (00) 93969-4 . ISSN 0021-9673 . PMID 3443622 .  
  6. ^ Гэвин, Энн-Клод; Бёше, Маркус; Краузе, Роланд; Гранди, Паола; Марциох, Мартина; Бауэр, Андреас; Шульц, Йорг; Рик, Дженс М .; Мишон, Энн-Мари; Круциат, Кристина-Мария; Раскаяние, Марита; Хёферт, Кристиан; Шельдер, Малгожата; Браженович, Миро; Раффнер, Хайнц; Мерино, Алехандро; Кляйн, Карин; Худак, Мануэла; Диксон, Дэвид; Руди, Татьяна; Гнау, Фолькер; Баух, Анджела; Бастак, Соня; Хухсе, Беттина; Лейтвейн, Кристина; Эртье, Мари-Анн; Копли, Ричард Р .; Эдельманн, Анджела; Querfurth, Эрих; и другие. (2002). «Функциональная организация протеома дрожжей путем систематического анализа белковых комплексов». Природа . 415 (6868): 141–7. Bibcode : 2002Natur.415..141G . doi :10.1038 / 415141a . PMID  11805826 . S2CID  4425555 .
  7. ^ Андерсен, Каспер Р .; Лекса, Нина Ц .; Шварц, Томас У. (2013). «Оптимизированный штамм экспрессии E. coli LOBSTR устраняет обычные загрязнители из очистки His-tag» (PDF) . Белки: структура, функции и биоинформатика . 81 (11): 1857–61. DOI : 10.1002 / prot.24364 . PMC 4086167 . PMID 23852738 .   
  8. ^ Чен, Сюгуан; Номани, Алиреза; Патель, Никет; Хатефи, Араш (2017). «Производство низкоэкспрессируемых рекомбинантных катионных биополимеров высокой чистоты» . Экспрессия и очистка белков . 134 : 11–17. DOI : 10.1016 / j.pep.2017.03.012 . PMC 5479735 . PMID 28315745 .  
  9. ^ Ховарт, Марк; Chinnapen, Daniel JF; Герроу, Кимберли; Доррестейн, Питер С.; Гранди, Мелани Р.; Kelleher, Neil L; Эль-Хусейни, штат Алабама; Тинг, Алиса Y (2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина» . Природные методы . 3 (4): 267–73. DOI : 10.1038 / nmeth861 . PMC 2576293 . PMID 16554831 .  
  10. ^ Чжао, Чунься; Хеллман, Лэнс М .; Чжань, Синь; Bowman, Willis S .; Уайтхарт, Сидни У .; Фрид, Майкл Г. (2010). «Оптические зонды, специфичные для гексагистидиновой метки, для анализа белков и их взаимодействий» . Аналитическая биохимия . 399 (2): 237–45. DOI : 10.1016 / j.ab.2009.12.028 . PMC 2832190 . PMID 20036207 .  
  11. ^ Кольцо, Кристина М .; Икбал, Эмиль С .; Хакер, Дэвид Э .; Хартман, Мэтью CT; Кропп, Т. Эштон (31 мая 2017 г.). «Генетическое включение 4-фторгистидина в пептиды позволяет проводить селективную аффинную очистку» . Органическая и биомолекулярная химия . 15 (21): 4536–4539. DOI : 10.1039 / C7OB00844A . ISSN 1477-0539 . PMC 6010304 . PMID 28517015 .   
  12. ^ Мендоза-Llerenas, Эдгар Омар; Перес, Дэвид Хавьер; Гомес-Сандовал, Зеферино; Эскаланте-Минаката, Пилар; Ибарра-Джункера, Врани; Разо-Эрнандес, Родриго Саид; Капоцци, Витторио; Руссо, Паскуале; Спано, Джузеппе; Fiocco, Daniela; Осуна-Кастро, Хуан Альберто; Морено, Абель (2016). «Lactobacillus plantarum WCFS1 β-Fructosidase: доказательство наличия открытого воронкообразного канала через каталитический домен с важностью для селективности субстрата». Прикладная биохимия и биотехнология . 180 (6): 1056–1075. DOI : 10.1007 / s12010-016-2152-2 . PMID 27295039 . S2CID 43120601 .  
  13. ^ Лю, И-Чи C; Рибен, Натали; Иверсен, Ларс; Соренсен, Брайан С; Пак, Дживун; Нюгард, Джеспер; Мартинес, Карен Л. (18 июня 2010 г.). «Специфическая и обратимая иммобилизация белков, меченных гистидином, на функционализированных кремниевых нанопроводах». Нанотехнологии . 21 (24): 245105. Bibcode : 2010Nanot..21x5105L . DOI : 10.1088 / 0957-4484 / 21/24/245105 . PMID 20498527 . 
  14. ^ Патент США 7,176,298
  15. ^ Чага, Григорий; Бочкарев, Дмитрий Е .; Джохадзе, Георгий Г .; Хопп, Дженнифер; Нельсон, Пол (1999). «Природная аффинная метка поли-гистидина для очистки рекомбинантных белков на агарозе, сшитой кобальт (II) -карбоксиметиласпартатом». Журнал хроматографии A . 864 (2): 247–256. DOI : 10.1016 / S0021-9673 (99) 01008-0 . PMID 10669292 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Колонка сродства Ni - NTA (Архив Общества белковых исследований № 019 / статья на японском языке)