 | Эта статья поднимает множество проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалить эти сообщения-шаблоны ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения )
|
Белковые методы - это методы, используемые для изучения белков . Существуют экспериментальные методы изучения белков (например, для обнаружения белков, для выделения и очистки белков, а также для характеристики структуры и функции белков, часто требующих предварительной очистки белка). Вычислительные методы обычно используют компьютерные программы для анализа белков. Однако многие экспериментальные методы (например, масс-спектрометрия ) требуют вычислительного анализа исходных данных.
Генетические методы [ править ]
Экспериментальный анализ белков обычно требует экспрессии и очистки белков. Экспрессия достигается путем манипулирования ДНК, кодирующей интересующий белок (белки). Следовательно, для анализа белков обычно требуются методы ДНК, особенно клонирование . Некоторые примеры генетических методов включают концептуальную трансляцию, сайт-направленный мутагенез , использование слитого белка и сопоставление аллелей с болезненными состояниями. Некоторые белки никогда не секвенировались напрямую, однако путем трансляции кодонов из известных последовательностей мРНК в аминокислоты методом, известным как концептуальная трансляция. (См. Генетический код .) Сайт-направленный мутагенезвыборочно вводит мутации, изменяющие структуру белка. Функцию частей белков можно лучше понять, изучив изменение фенотипа в результате этого изменения. Слитые белки получают путем вставки белковых меток, таких как His-tag , для получения модифицированного белка, который легче отслеживать. Примером этого может быть GFP-Snf2H, который состоит из белка, связанного с зеленым флуоресцентным белком с образованием гибридного белка. Путем анализа ДНК аллели могут быть идентифицированы как связанные с болезненными состояниями, например, при расчете баллов LOD .
Извлечение белка из тканей [ править ]
Извлечение белка из тканей с жесткими внеклеточными матрицами (например, образцов биопсии, венозных тканей, хрящей, кожи) часто достигается в лабораторных условиях путем ударного измельчения в жидком азоте. Образцы замораживают в жидком азоте и затем подвергают ударному или механическому измельчению. Поскольку вода в образцах становится очень хрупкой при такой температуре, образцы часто уменьшаются до скопления мелких фрагментов, которые затем можно растворить для экстракции белка. Иногда для этой цели используются устройства из нержавеющей стали, известные как измельчители тканей.
К преимуществам этих устройств можно отнести высокие уровни экстракции белка из небольших ценных образцов, к недостаткам можно отнести низкое перекрестное загрязнение.
Очистка белков [ править ]
- Выделение белка
- Методы хроматографии: ионообменная , эксклюзионная хроматография (или гель-фильтрация) , аффинная хроматография.
- Экстракция и солюбилизация белков
- Концентрирование белковых растворов
- Гель-электрофорез
- Гель-электрофорез в денатурирующих условиях
- Гель-электрофорез в неденатурирующих условиях
- 2D гель-электрофорез
- Электрофокусировка
Обнаружение белков [ править ]
Значительно малый размер макромолекул белка делает идентификацию и количественный анализ образцов неизвестного белка особенно трудными. Для упрощения процесса было разработано несколько надежных методов количественного определения белка. Эти методы включают анализ Варбурга-Кристиана, анализ Лоури и анализ Брэдфорда (все из которых основаны на оптических свойствах макромолекул).
Метод анализа Брэдфорда использует краситель для связывания с белком. Чаще всего используется краситель Кумасси бриллиантовый синий G-250. В отсутствие белка краситель становится красным, но после связывания с белком становится синим. Комплекс краситель-белок максимально поглощает свет на длине волны 595 нанометров и чувствителен к образцам, содержащим от 1 мкг до 60 мкг. В отличие от методов Лоури и Варбурга-Кристиана, анализы Брэдфорда не полагаются на содержание триптофана и тирозина в белках, что позволяет гипотетически быть более точным.
Анализ Лоури аналогичен биуретовому, но в нем используется реагент Фолин, который более точен для количественной оценки. Реагент фолин стабилен только в кислых условиях, и метод подвержен искажению результатов в зависимости от того, сколько триптофана и тирозина присутствует в исследуемом белке. Реагент Folin связывается с триптофаном и тирозином, что означает, что концентрация двух аминокислот влияет на чувствительность метода. Этот метод чувствителен в диапазонах концентраций, как и метод Брэдфорда, но требует незначительного количества белка.
Метод Варбурга-Кристиана проверяет белки в их естественных диапазонах поглощения. Большинство белков очень хорошо поглощают свет с длиной волны 280 нанометров из-за присутствия триптофана и тирозина, но этот метод чувствителен к различным количествам аминокислот, на которых он основан.
Дополнительные методы перечислены ниже, со ссылками на более подробные учетные записи соответствующих методов.
Неспецифические методы, определяющие только общий белок [ править ]
- Поглощение : считайте при 280 или 215 нм. Может быть очень неточным. Обнаружение в диапазоне от 100 мкг / мл до 1 мг / мл. Отношение показаний абсорбции, снятых при 260/280, может указывать на чистоту / загрязнение образца (чистые образцы имеют соотношение <0,8).
- Анализ белка Брэдфорда : обнаружение в диапазоне ~ 1 мг / мл
- Анализы, полученные из биурета :
- Анализ бицинхониновой кислоты (анализ BCA) : обнаружение до 0,5 мкг / мл
- Анализ белка Лоури : обнаружение в диапазоне 0,01–1,0 мг / мл.
- Флуорескамин : определяет количество белков и пептидов в растворе, если в аминокислотах присутствует первичный амин.
- Амидо черный : обнаружение в диапазоне 1-12 мкг / мл.
- Коллоидное золото : обнаружение в диапазоне от 20 до 640 нг / мл.
- Обнаружение азота :
- Метод Кьельдаля : используется в основном для пищевых продуктов и требует окисления материала.
- Метод Дюма : используется в основном для пищевых продуктов и требует сжигания материала.
Конкретные методы, которые могут определять количество одного белка [ править ]
- Спектрометрические методы :
- Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) : метод хроматографии для обнаружения белков или пептидов.
- Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / МС) : может обнаруживать белки в низких концентрациях (от нг / мл до пг / мл) в крови и биологических жидкостях, например, для фармакокинетики .
- Антителозависимые методы:
- Иммуноферментный анализ ( ELISA ): в частности, может обнаруживать белок до пг / мл.
- Иммунопреципитация белка : метод осаждения белкового антигена из раствора с использованием антитела, которое специфически связывается с этим конкретным белком.
- Иммуноэлектрофорез : разделение и характеристика белков на основе электрофореза и реакции с антителами.
- Вестерн-блоттинг : сочетает гель-электрофорез и инкубацию с антителами для обнаружения специфических белков в образце гомогената ткани или экстракта (тип метода иммуноэлектрофореза ).
- Иммуноокрашивание белков
Белковые структуры [ править ]
- Рентгеновская кристаллография
- ЯМР белков
- Криоэлектронная микроскопия
- Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей
- Круговой дихроизм
Взаимодействия с участием белков [ править ]
- Белковый след
Белковые взаимодействия [ править ]
- (Дрожжи) двухгибридная система
- Анализ комплементации белковых фрагментов
- Коиммунопреципитация
- Аффинная очистка и масс-спектрометрия
- Анализ близости лигирования
- Маркировка близости
Взаимодействие белок-ДНК [ править ]
- Чип-на-чипе
- Чип-секвенирование
- DamID
- Микромасштабный термофорез
Взаимодействия белок-РНК [ править ]
- Toeprinting пробирный
- TCP-seq
Вычислительные методы [ править ]
- Молекулярная динамика
- Прогноз структуры белка
- Выравнивание последовательностей белков (сравнение последовательностей, включая BLAST )
- Структурное выравнивание белков
- Онтология белков (см. Онтологию генов )
Другие методы [ править ]
- Водородно-дейтериевый обмен
- Масс-спектрометрии
- Секвенирование белков
- Синтез белка
- Протеомика
- Массовая дактилоскопия пептидов
- Анализ связывания лиганда
- Восточный блоттинг
- Метаболическая маркировка
- Маркировка тяжелых изотопов
- Маркировка радиоактивных изотопов
См. Также [ править ]
- Протоколы CSH
- Текущие протоколы
Библиография [ править ]
- Даниэль М. Боллаг, Майкл Д. Розицки и Стюарт Дж. Эдельштейн. (1996) Protein Methods , 2-е изд., Wiley Publishers. ISBN 0-471-11837-0 .
Ссылки [ править ]
