Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Сайт-направленный мутагенез является молекулярная биология метод , который используется , чтобы сделать конкретные и преднамеренные изменения в последовательности ДНК , о наличии гена и любых продуктов генов . Также называемый сайт-специфическим мутагенезом или олигонуклеотид-направленным мутагенезом , он используется для исследования структуры и биологической активности молекул ДНК , РНК и белков , а также для белковой инженерии .

Сайт-направленный мутагенез - один из важнейших лабораторных методов создания библиотек ДНК путем введения мутаций в последовательности ДНК. Существуют многочисленные способы для достижения сайт-направленного мутагенеза, но с уменьшением затрат на синтез олигонуклеотидов , искусственного синтеза генов в настоящее время иногда используется в качестве альтернативы сайт-направленного мутагенеза. С 2013 года разработка технологии CRISPR / Cas9, основанной на системе защиты от прокариотических вирусов, также позволила редактировать геном , и мутагенез можно было относительно легко выполнять in vivo . [1]

История [ править ]

Ранние попытки мутагенеза с использованием радиации или химических мутагенов не были сайт-специфичными и приводили к случайным мутациям. [2] Аналоги нуклеотидов и других химических веществ были впоследствии использованы для создания локализованных точечных мутаций , [3] примеры таких веществ являются аминопурин , [4] нитрозогуанидин , [5] и бисульфит . [6] Сайт-направленный мутагенез был достигнут в 1974 году в лаборатории Charles Weissmann с использованием нуклеотидного аналога N 4 -гидроксицитидина, который индуцирует переход GC в AT. [7] [8]Однако эти методы мутагенеза ограничены видом мутации, которую они могут достичь, и они не так специфичны, как более поздние методы сайт-направленного мутагенеза.

В 1971 году Клайд Хатчисон и Маршалл Эджелл показали, что можно получить мутанты с небольшими фрагментами фага ϕX174 и рестрикционными нуклеазами . [9] [10] Позднее Хатчисон вместе со своим сотрудником Майклом Смитом в 1978 году разработал более гибкий подход к сайт-направленному мутагенезу с использованием олигонуклеотидов в методе удлинения праймера с помощью ДНК-полимеразы. [11] За его участие в разработке этого процесса Майкл Смит позже разделил Нобелевскую премию по химии в октябре 1993 года с Кэри Б. Маллис , которая изобрела полимеразную цепную реакцию .

Основной механизм [ править ]

Основная процедура требует синтеза короткого праймера ДНК. Этот синтетический праймер содержит желаемую мутацию и комплементарен матричной ДНК вокруг сайта мутации, поэтому он может гибридизоваться с ДНК в интересующем гене. Мутация может представлять собой изменение одного основания ( точечная мутация ), несколько изменений оснований, делеция или вставка . Затем однонитевой праймер удлиняется с помощью ДНК-полимеразы , которая копирует остальную часть гена. Скопированный таким образом ген содержит мутированный сайт, а затем вводится в клетку-хозяин в векторе и клонируется . Наконец, мутанты отбираются путем секвенирования ДНК. чтобы убедиться, что они содержат желаемую мутацию.

Подходы [ править ]

Оригинальный метод с использованием удлинения с одним праймером оказался неэффективным из-за низкого выхода мутантов. Эта полученная смесь содержит как исходную немутантную матрицу, так и мутантную цепь, что дает смешанную популяцию мутантных и немутантных потомков. Кроме того, используемая матрица метилирована, в то время как мутантная цепь неметилирована, и мутанты могут быть отобраны противоположным образом из-за наличия системы репарации ошибочного спаривания, которая благоприятствует метилированной матричной ДНК, что приводит к меньшему количеству мутантов. С тех пор было разработано множество подходов для повышения эффективности мутагенеза.

Доступно большое количество методов для осуществления сайт-направленного мутагенеза [12], хотя большинство из них редко использовалось в лабораториях с начала 2000-х годов, так как новые методы позволяют более простые и легкие способы введения сайт-специфической мутации в гены.

Метод Кункеля [ править ]

В 1985 году Томас Канкель представил технику, которая снижает необходимость отбора мутантов. [13] Фрагмент ДНК , чтобы быть мутирован вставлен в фагмиды , такие как M13mp18 / 19 , а затем превращается в E.coli , штамм с дефицитом в двух ферментов, dUTPase ( ИУ ) и урацил deglycosidase ( УДГ ). Оба фермента участвуют в репарации ДНК.путь, который защищает бактериальную хромосому от мутаций спонтанным дезаминированием dCTP в dUTP. Дефицит dUTPase предотвращает распад dUTP, что приводит к высокому уровню dUTP в клетке. Дефицит урацил-дегликозидазы препятствует удалению урацила из вновь синтезированной ДНК. Поскольку двойная мутантная E.coli реплицирует ДНК фага, ее ферментативный аппарат может, следовательно, неправильно включать dUTP вместо dTTP, что приводит к образованию однонитевой ДНК, содержащей некоторое количество урацилов (ssUDNA). SsUDNA извлекается из бактериофага, который высвобождается в среду, а затем используется в качестве матрицы для мутагенеза. олигонуклеотидсодержащий желаемую мутацию, используется для удлинения праймера. Образующаяся гетеродуплексная ДНК состоит из одной родительской немутантной цепи, содержащей dUTP, и мутантной цепи, содержащей dTTP. ДНК затем трансформировали в E.coli , штамм , несущий дикого типа ИУ и UDG генов. Здесь родительская цепь ДНК, содержащая урацил, разрушается, так что почти вся полученная ДНК состоит из мутированной цепи.

Кассетный мутагенез [ править ]

В отличие от других методов, кассетный мутагенез не требует удлинения праймера с использованием ДНК-полимеразы. В этом методе фрагмент ДНК синтезируется, а затем вставляется в плазмиду. [14] Он включает расщепление рестрикционным ферментом в сайте плазмиды и последующее лигирование пары комплементарных олигонуклеотидов, содержащих мутацию в гене, представляющем интерес для плазмиды. Обычно рестрикционные ферменты, которые разрезают плазмиду и олигонуклеотид, одинаковы, что позволяет липким концам плазмиды и вставке связываться друг с другом. Этот метод может генерировать мутанты с эффективностью, близкой к 100%, но ограничен доступностью подходящих сайтов рестрикции, фланкирующих сайт, который должен быть мутирован.

Сайт-направленный мутагенез ПЦР [ править ]

Описание одного из распространенных способов клонирования библиотеки сайт-направленного мутагенеза (т. Е. С использованием вырожденных олигонуклеотидов). Интересующий ген подвергается ПЦР с олигонуклеотидами, которые содержат область, которая полностью комплементарна матрице (синий), и область, которая отличается от матрицы одним или несколькими нуклеотидами (красный). Многие такие праймеры, содержащие вырожденность в некомплементарной области, объединяются в одну и ту же ПЦР, что приводит к множеству различных продуктов ПЦР с разными мутациями в этой области (отдельные мутанты показаны разными цветами ниже).

Ограничение сайтов рестрикции в кассетном мутагенезе может быть преодолено с использованием полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными « праймерами », так что может быть получен более крупный фрагмент, охватывающий два удобных сайта рестрикции. Экспоненциальная амплификация в ПЦР дает фрагмент, содержащий желаемую мутацию в количестве, достаточном для отделения от исходной немутированной плазмиды с помощью гель-электрофореза., который затем может быть вставлен в исходный контекст с использованием стандартных методов рекомбинантной молекулярной биологии. Есть много вариантов одной и той же техники. Самый простой метод размещает сайт мутации ближе к одному из концов фрагмента, при этом один из двух олигонуклеотидов, используемых для создания фрагмента, содержит мутацию. Это включает одностадийную ПЦР, но по-прежнему имеет присущую проблему необходимость наличия подходящего сайта рестрикции рядом с сайтом мутации, если не используется очень длинный праймер. Поэтому в других вариантах используются три или четыре олигонуклеотида, два из которых могут быть немутагенными олигонуклеотидами, которые покрывают два удобных сайта рестрикции и генерируют фрагмент, который можно расщеплять и лигировать в плазмиду,тогда как мутагенный олигонуклеотид может быть комплементарным участку внутри этого фрагмента вдали от любого удобного сайта рестрикции. Эти методы требуют нескольких этапов ПЦР, чтобы конечный фрагмент, подлежащий лигированию, мог содержать желаемую мутацию. Процесс разработки для создания фрагмента с желаемой мутацией и соответствующими сайтами рестрикции может быть громоздким. Программные инструменты, такие как SDM-Assist[15] может упростить процесс.

Мутагенез цельной плазмиды [ править ]

Для манипуляций с плазмидами другие методы сайт-направленного мутагенеза были вытеснены в основном методами, которые являются высокоэффективными, но относительно простыми, легкими в использовании и коммерчески доступными в виде набора. Примером этих методов является метод Quikchange [16], в котором пара комплементарных мутагенных праймеров используется для амплификации всей плазмиды в реакции термоциклирования с использованием высокоточной ДНК-полимеразы без вытеснения цепи, такой как полимераза pfu . В результате реакции образуется кольцевая ДНК с разрывами . Матричная ДНК должна быть удалена ферментативным расщеплением рестрикционным ферментом, таким как Dpn.I, специфичный для метилированной ДНК. Вся ДНК, полученная из большинства штаммов Escherichia coli , будет метилирована; матричная плазмида, которая биосинтезируется в E. coli, будет поэтому перевариваться, в то время как мутантная плазмида, которая генерируется in vitro и, следовательно, неметилирована, останется непереваренной. Обратите внимание, что в этих методах двухцепочечного мутагенеза плазмиды, хотя можно использовать реакцию термоциклирования, ДНК не нужно экспоненциально амплифицировать, как в ПЦР. Вместо этого амплификация является линейной, и поэтому неточно описывать их как ПЦР, поскольку цепной реакции нет.

Обратите внимание, что полимераза pfu может вытеснять цепи при более высокой температуре удлинения (≥70 ° C), что может привести к провалу эксперимента, поэтому реакцию удлинения следует проводить при рекомендуемой температуре 68 ° C. Было замечено, что в некоторых приложениях этот метод приводит к вставке нескольких копий праймеров. [17] Разновидность этого метода, называемая SPRINP, предотвращает этот артефакт и использовалась в различных типах сайт-направленного мутагенеза. [17]

Другие методы, такие как сканирующий мутагенез олигонуклеотидов (SMOOT), могут полуслучайно комбинировать мутагенные олигонуклеотиды в плазмидном мутагенезе. [18] Этот метод позволяет создавать библиотеки мутагенеза плазмид в диапазоне от единичных мутаций до комплексного мутагенеза кодонов по всему гену.

Методы сайт-направленного мутагенеза in vivo [ править ]

  • Delitto perfetto [19]
  • Замена "всплывающего окна"
  • Прямая делеция гена и сайт-специфический мутагенез с ПЦР и одним рециклируемым маркером
  • Прямая делеция гена и сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР и одного пригодного для повторного использования маркера с использованием длинных гомологичных областей
  • Сайт-направленный мутагенез in vivo с синтетическими олигонуклеотидами [20]

CRISPR [ править ]

Основная статья: редактирование генов CRISPR

С 2013 года развитие технологии CRISPR -Cas9 позволило эффективно вносить различные мутации в геном самых разных организмов. Для этого метода не требуется сайт вставки транспозона, он не оставляет маркера, а его эффективность и простота сделали его предпочтительным методом редактирования генома . [21] [22]

Приложения [ править ]

Мутагенез с насыщением сайта - это тип сайт-направленного мутагенеза. На этом изображении показан мутагенез насыщения в одном положении теоретического белка с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет собой первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже.

Сайт-направленный мутагенез используется для создания мутаций, которые могут производить рационально разработанный белок с улучшенными или особыми свойствами (например, инженерия белков).

Инструменты исследования - специфические мутации в ДНК позволяют исследовать функцию и свойства последовательности ДНК или белка с помощью рационального подхода. Более того, изменения отдельных аминокислот путем сайт-направленного мутагенеза в белках могут помочь понять важность посттрансляционных модификаций. Например, замена определенного серина (фосфоакцептора) на аланин (фосфо-неакцептор) в белке-субстрате блокирует присоединение фосфатной группы, тем самым позволяя исследовать фосфорилирование. Этот подход был использован для обнаружения фосфорилирования белка CBP киназой HIPK2 [23]. Другой комплексный подход - мутагенез с насыщением сайтов, когда один кодонили набор кодонов может быть заменен всеми возможными аминокислотами в определенных положениях. [24]

Коммерческое применение - белки могут быть созданы для получения мутантных форм, адаптированных для конкретного применения. Например, обычно используемые моющие средства для стирки могут содержать субтилизин , форма дикого типа которого содержит метионин, который может окисляться отбеливателем, что значительно снижает активность белка в процессе. [25] Этот метионин может быть заменен аланином или другими остатками, что делает его устойчивым к окислению, тем самым сохраняя активность белка в присутствии отбеливателя. [26]

Синтез генов [ править ]

Поскольку стоимость синтеза олигонуклеотидов ДНК падает, искусственный синтез полного гена в настоящее время является жизнеспособным методом введения мутации в ген. Этот метод позволяет проводить обширный мутагенез на множестве сайтов, включая полную переработку использования кодонов гена для оптимизации его для конкретного организма. [27]

См. Также [ править ]

  • Направленный мутагенез
  • Анализ значения Phi

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии» . Cell . 157 (6): 1262–78. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.05.010 . PMC  4343198 . PMID  24906146 .
  2. ^ Килби, BJ (1995). «Шарлотта Ауэрбах (1899–1994)» . Генетика . 141 (1): 1–5. PMC 1206709 . PMID 8536959 .  
  3. ^ Shortle, D .; Dimaio, D .; Натанс, Д. (1981). «Направленный мутагенез». Ежегодный обзор генетики . 15 : 265–294. DOI : 10.1146 / annurev.ge.15.120181.001405 . PMID 6279018 . 
  4. ^ Карас, И. В.; Макиннес, Массачусетс; Персинг, DH; Coffino, P .; Мартин-младший, DW (1982). «Механизм мутагенеза 2-аминопурина в клетках Т-лимфосаркомы мыши» . Молекулярная и клеточная биология . 2 (9): 1096–1103. DOI : 10,1128 / MCB.2.9.1096 . PMC 369902 . PMID 6983647 .  
  5. ^ МакХью, GL; Миллер, CG (1974). «Выделение и характеристика мутантов пролин-пептидазы Salmonella typhimurium» . Журнал бактериологии . 120 (1): 364–371. DOI : 10.1128 / JB.120.1.364-371.1974 . PMC 245771 . PMID 4607625 .  
  6. ^ D Шортл и D Натанс (1978). «Местный мутагенез: метод создания вирусных мутантов с заменами оснований в заранее выбранных областях вирусного генома» . Труды Национальной академии наук . 75 (5): 2170–2174. DOI : 10.1073 / pnas.75.5.2170 . PMC 392513 . PMID 209457 .  
  7. ^ RA Flavell; DL Sabo; EF Bandle & C. Weissmann (1975). «Сайт-направленный мутагенез: влияние экстрацистронной мутации на распространение РНК бактериофага Qbeta in vitro» . Proc Natl Acad Sci USA . 72 (1): 367–371. DOI : 10.1073 / pnas.72.1.367 . PMC 432306 . PMID 47176 .  
  8. ^ Вилли Мюллер; Ганс Вебер; Франсуа Мейер; Чарльз Вайсманн (1978). «Сайт-направленный мутагенез в ДНК: создание точечных мутаций в клонированной комплементарной ДНК β-глобина в положениях, соответствующих аминокислотам со 121 по 123». Журнал молекулярной биологии . 124 (2): 343–358. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (78) 90303-0 . PMID 712841 . 
  9. ^ Hutchison Ca, 3 .; Эджелл, MH (1971). "Генетический анализ малых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты бактериофага φX174" . Журнал вирусологии . 8 (2): 181–189. DOI : 10,1128 / JVI.8.2.181-189.1971 . PMC 356229 . PMID 4940243 .  CS1 maint: numeric names: authors list (link)
  10. ↑ Маршалл Х. Эдджелл, Клайд А. Хатчисон, III, и Мортон Склер (1972). «Специфические фрагменты эндонуклеазы R бактериофага X174 дезоксирибонуклеиновой кислоты» . Журнал вирусологии . 9 (4): 574–582. DOI : 10,1128 / JVI.9.4.574-582.1972 . PMC 356341 . PMID 4553678 .  CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  11. ↑ Hutchison CA, Phillips S, Edgell MH, Gillam S, Jahnke P, Smith M (сентябрь 1978 г.). «Мутагенез в определенном положении в последовательности ДНК» (PDF) . J. Biol. Chem . 253 (18): 6551–60. PMID 681366 .  
  12. ^ Браман, Джефф, изд. (2002). Протоколы мутагенеза in vitro . Методы молекулярной биологии. 182 (2-е изд.). Humana Press. ISBN 978-0896039100.
  13. ^ Кункель Т.А. (1985). «Быстрый и эффективный сайт-специфический мутагенез без фенотипической селекции» . Труды Национальной академии наук . 82 (2): 488–92. DOI : 10.1073 / pnas.82.2.488 . PMC 397064 . PMID 3881765 .  
  14. ^ Уэллс, JA; Эстелл, Д.А. (1988). «Субтилизин - фермент, предназначенный для разработки». Направления биохимических наук . 13 (8): 291–297. DOI : 10.1016 / 0968-0004 (88) 90121-1 . PMID 3154281 . 
  15. ^ Карник, Абхиджит; Карник, Руча; Грефен, Кристофер (2013). «Программное обеспечение SDM-Assist для создания праймеров для сайт-направленного мутагенеза, вводящих« молчащие »сайты рестрикции» . BMC Bioinformatics . 14 (1): 105. DOI : 10,1186 / 1471-2105-14-105 . ISSN 1471-2105 . PMC 3644487 . PMID 23522286 .   
  16. ^ Papworth, С., Бауэр, JC, Braman, Дж и Райт, Д. А. (1996). «Сайт-направленный мутагенез за один день с эффективностью> 80%». Стратегии . 9 (3): 3–4.CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  17. ^ а б Эдельхейт, О; Ханукоглу, А; Ханукоглу, I (2009). «Простой и эффективный сайт-направленный мутагенез с использованием двух параллельных реакций с одним праймером для создания мутантов для исследования структуры и функции белков» . BMC Biotechnol . 9 : 61. DOI : 10,1186 / 1472-6750-9-61 . PMC 2711942 . PMID 19566935 .  
  18. ^ Черчионе, Дерек; Лавлак, Кэтрин; Тиллотсон, Эрик Л .; Харбински, Фред; DaSilva, Jen; Келли, Чейз П .; Кестон-Смит, Элиза; Fernandez, Cecilia A .; Myer, Vic E .; Джаярам, ​​Харихаран; Стейнберг, Барретт Э. (16 апреля 2020 г.). [10.1371 / journal.pone.0231716 «Библиотеки SMOOT и индуцированная фагом направленная эволюция Cas9 для снижения нецелевой активности»] Проверить значение ( справка ) . PLOS ONE . 15 (4): e0231716. DOI : 10.1371 / journal.pone.0231716 . ISSN 1932-6203 . PMC 7161989 . PMID 32298334 .|url=   
  19. ^ Сторичи Ф .; Резник MA. (2006). Подход delitto perfetto к сайт-направленному мутагенезу in vivo и хромосомным перестройкам с синтетическими олигонуклеотидами в дрожжах . Методы в энзимологии . 409 . С. 329–45. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (05) 09019-1 . ISBN 9780121828141. PMID  16793410 .
  20. ^ Сторичи Ф .; Резник MA (2003). «Delitto perfetto нацеленный мутагенез в дрожжах с олигонуклеотидами». Генная инженерия . 25 : 189–207. PMID 15260239 . 
  21. ^ Дэмиен Био-Пеллетье и Винсент Дж. Дж. Мартин (2016). «Бесшовный сайт-направленный мутагенез генома Saccharomyces cerevisiae с использованием CRISPR-Cas9» . Журнал биологической инженерии . 10 : 6. DOI : 10,1186 / s13036-016-0028-1 . PMC 4850645 . PMID 27134651 .  CS1 maint: uses authors parameter (link)
  22. ↑ Xu S (20 августа 2015 г.). «Применение редактирования генома CRISPR-Cas9 у Caenorhabditis elegans» . J Genet Genomics . 42 (8): 413–21. DOI : 10.1016 / j.jgg.2015.06.005 . PMC 4560834 . PMID 26336798 .  
  23. Перейти ↑ Kovács KA, Steinmann M, Halfon O, Magistretti PJ, Cardinaux JR (ноябрь 2015 г.). «Комплексная регуляция CREB-связывающего белка с помощью гомеодомен-взаимодействующей протеинкиназы 2» (PDF) . Сотовая связь . 27 (11): 2252–60. DOI : 10.1016 / j.cellsig.2015.08.001 . PMID 26247811 .  
  24. ^ Reetz, MT; Carballeira JD (2007). «Итерационный мутагенез насыщения (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Протоколы природы . 2 (4): 891–903. DOI : 10.1038 / nprot.2007.72 . PMID 17446890 . S2CID 37361631 .  
  25. ^ Стауффер CE, ETSON D (10 октября 1969). «Влияние субтилизина на активность окисления остатка метионина» . Журнал биологической химии . 244 (19): 5333–8. PMID 5344139 . 
  26. ^ Estell DA, Graycar TP, Wells JA (10 июня 1985). «Разработка фермента путем сайт-направленного мутагенеза, чтобы он был устойчивым к химическому окислению» . Журнал биологической химии . 260 (11): 6518–21. PMID 3922976 . 
  27. ^ Юрий Е. Худяков, Ховард А. Филдс, изд. (25 сентября 2002 г.). Искусственная ДНК: методы и приложения . CRC Press. п. 13. ISBN 9781420040166.

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы библиотеки о
сайт-направленном мутагенезе
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • Нобелевская лекция по изобретению сайт-направленного мутагенеза
  • OpenWetWare
  • Схема, обобщающая сайт-направленный мутагенез