Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Различные поколения нуклеаз, используемых для редактирования генома, и пути репарации ДНК, используемые для модификации целевой ДНК.

Редактирование генома , или инженерия генома , или редактирование генов , - это тип генной инженерии, при котором ДНК вставляется, удаляется, модифицируется или заменяется в геноме живого организма. В отличие от ранних методов генной инженерии, которые случайным образом вставляют генетический материал в геном хозяина, редактирование генома нацелено на вставки в определенные места.

История [ править ]

Редактирование генома было впервые применено в 1990-х годах [1] до появления обычных современных платформ для редактирования генов на основе нуклеаз, однако его использование было ограничено низкой эффективностью редактирования. Редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз, то есть все три основных класса этих ферментов - нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN) и сконструированные мегануклеазы - были выбраны Nature Methods в качестве метода года 2011 года. [2] Система CRISPR-Cas была выбрана Science как прорыв года 2015. [3]

По состоянию на 2015 год использовались четыре семейства сконструированных нуклеаз: мегануклеазы , нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs), нуклеазы на основе эффекторов, подобные активатору транскрипции (TALEN), и система с регулярными интервалами между короткими палиндромными повторами ( CRISPR / Cas9 ). [4] [5] [6] [7] По состоянию на 2017 год было доступно девять редакторов генома. [8]

В 2018 году в распространенных методах такого редактирования использовались сконструированные нуклеазы , или «молекулярные ножницы». Эти нуклеазы создают сайт-специфичные двухцепочечные разрывы (DSB) в желаемых местах генома. Индуцированные двухцепочечные разрывы репарируются посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR), что приводит к целевым мутациям («редактирование»).

В мае 2019 года адвокаты в Китае сообщили в свете подразумевал создание китайских ученой Хэ~d Jiankui из первых генов отредактированных людей (см Лулы и Наны споров ), разработка правил, кто манипулирует геном человека с помощью методов генного редактирования , как и CRISPR , будет нести ответственность за любые связанные с этим неблагоприятные последствия. [9] Осторожный взгляд на возможные слепые пятна и риски CRISPR и связанных с ними биотехнологий недавно обсуждался [10], уделяя особое внимание стохастической природе процессов клеточного контроля.

В феврале 2020 года исследование в США безопасно показало редактирование гена CRISPR у 3 больных раком. [11]

Фон [ править ]

Генная инженерия как метод введения новых генетических элементов в организмы существует с 1970-х годов. Одним из недостатков этой технологии является случайный характер, с которым ДНК вставляется в геном хозяина , что может повредить или изменить другие гены в организме. Тем не менее, было обнаружено несколько методов, которые нацеливают встроенные гены на определенные участки генома организма. [1] Это также позволило редактировать определенные последовательности в геноме, а также снизить нецелевые эффекты. Это может быть использовано в исследовательских целях, для нацеливания на мутации определенных генов и в генной терапии.. Вставив функциональный ген в организм и направив его на замену дефектного, можно вылечить определенные генетические заболевания .

Нацеливание на гены [ править ]

Гомологичная рекомбинация [ править ]

Ранние методы нацеливания генов на определенные участки в геноме организма (так называемое нацеливание на гены ) основывались на гомологичной рекомбинации (HR). [12] Создавая конструкции ДНК, которые содержат матрицу, которая соответствует целевой последовательности генома, возможно, что процессы HR в клетке вставят конструкцию в желаемое место. Использование этого метода на эмбриональных стволовых клетках привело к развитию трансгенных мышей с нокаутированными генами-мишенями . Также было возможно « сбивать» гены или изменять паттерны экспрессии генов . [13]В знак признания своего открытия того, как гомологичная рекомбинация может использоваться для введения генетических модификаций у мышей с помощью эмбриональных стволовых клеток, Марио Капеччи , Мартин Эванс и Оливер Смитис были удостоены Нобелевской премии 2007 года по физиологии и медицине . [14]

Условный таргетинг [ править ]

Если жизненно важный ген не работает, он может оказаться смертельным для организма. Для изучения функции этих генов использовали сайт-специфические рекомбиназы (SSR). Двумя наиболее распространенными типами являются системы Cre-LoxP и Flp-FRT . Cre-рекомбиназа - это фермент, который удаляет ДНК путем гомологичной рекомбинации между связывающими последовательностями, известными как сайты Lox-P. Система Flip-FRT работает аналогичным образом: рекомбиназа Flip распознает последовательности FRT. Путем скрещивания организма, содержащего сайты рекомбиназы, фланкирующие интересующий ген, с организмом, который экспрессирует SSR под контролем тканеспецифических промоторов, гены можно выключить или включить только в определенных клетках. Эти методы также использовались для удаления маркерных генов у трансгенных животных. Дальнейшие модификации этих систем позволили исследователям вызвать рекомбинацию только при определенных условиях, что позволило генам быть выключенными или экспрессироваться в желаемое время или на желаемых стадиях развития . [13]

Процесс [ править ]

Ремонт двойного разрыва цепи [ править ]

Распространенная форма редактирования генома основана на концепции механики восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Есть два основных пути восстановления DSB; негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологически направленная репарация (HDR). NHEJ использует различные ферменты для непосредственного соединения концов ДНК, в то время как более точный HDR использует гомологичную последовательность в качестве матрицы для восстановления недостающих последовательностей ДНК в точке разрыва. Этим можно воспользоваться, создав вектор с желаемыми генетическими элементами в гомологичной последовательности.к фланкирующим последовательностям DSB. Это приведет к тому, что желаемое изменение будет внесено на сайт DSB. Хотя редактирование генов на основе HDR аналогично таргетированию генов на основе гомологичной рекомбинации, скорость рекомбинации увеличивается по крайней мере на три порядка. [15]

Инженерные нуклеазы [ править ]

Группы инженерных нуклеаз. Соответствующие цвета обозначают шаблоны распознавания ДНК

Ключом к редактированию генома является создание DSB в определенной точке генома. Обычно используемые рестрикционные ферменты эффективны при разрезании ДНК, но обычно распознают и разрезают на нескольких участках. Чтобы преодолеть эту проблему и создать сайт-специфичный DSB, на сегодняшний день были открыты и биоинженерии три различных класса нуклеаз. Это нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции ( TALEN ), мегануклеазы и система систематически расположенных между собой коротких палиндромных повторов ( CRISPR / Cas9).

Мегануклеазы [ править ]

Мегануклеазы , открытые в конце 1980-х годов, представляют собой ферменты из семейства эндонуклеаз, которые характеризуются своей способностью распознавать и разрезать большие последовательности ДНК (от 14 до 40 пар оснований). [16] Самыми распространенными и известными мегануклеазами являются белки семейства LAGLIDADG, получившие свое название от консервативной аминокислотной последовательности .

Мегануклеазы, обычно встречающиеся у видов микробов, обладают уникальным свойством иметь очень длинные последовательности узнавания (> 14 п.н.), что делает их естественно очень специфичными. [17] [18] Однако практически нет шансов найти точную мегануклеазу, необходимую для воздействия на выбранную конкретную последовательность ДНК. Чтобы преодолеть эту проблему, были использованы методы мутагенеза и высокопроизводительного скрининга для создания вариантов мегануклеаз, распознающих уникальные последовательности. [18] [19] Другим удалось объединить различные мегануклеазы и создать гибридные ферменты, распознающие новую последовательность. [20] [21]Третьи пытались изменить ДНК-взаимодействующие аминокислоты мегануклеазы, чтобы сконструировать мегануклеазы, специфичные для последовательности, с помощью метода, названного рационально разработанная мегануклеаза. [22] Другой подход включает использование компьютерных моделей, чтобы попытаться максимально точно предсказать активность модифицированных мегануклеаз и специфичность распознаваемой нуклеиновой последовательности. [23]

Создан большой банк, содержащий несколько десятков тысяч белковых единиц. Эти единицы могут быть объединены для получения химерных мегануклеаз, распознающих целевой участок, тем самым предоставляя инструменты для исследований и разработок, отвечающие широкому спектру потребностей (фундаментальные исследования, здравоохранение, сельское хозяйство, промышленность, энергетика и т. Д.), Включая производство в промышленных масштабах. двух мегануклеаз, способных расщеплять ген XPC человека; Мутации в этом гене приводят к Xeroderma pigmentosum , тяжелому моногенному заболеванию, которое предрасполагает пациентов к раку кожи и ожогам всякий раз, когда их кожа подвергается воздействию УФ-лучей. [24]

Мегануклеазы обладают тем преимуществом, что вызывают меньшую токсичность для клеток, чем такие методы, как нуклеаза цинкового пальца (ZFN), вероятно, из-за более строгого распознавания последовательности ДНК; [18], однако, создание специфичных для последовательности ферментов для всех возможных последовательностей является дорогостоящим и требует много времени, поскольку комбинаторные возможности, которые используют такие методы, как ZFNs и слияния на основе TALEN, не приносят пользы.

Нуклеазы цинковых пальцев [ править ]

В отличие от мегануклеаз, концепция технологии ZFN и TALEN основана на неспецифическом каталитическом домене, разрезающем ДНК, который затем может быть связан со специфической последовательностью ДНК, распознающей пептиды, такие как цинковые пальцы и эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE). [25] Первым шагом к этому было обнаружение эндонуклеазы, у которой сайт узнавания ДНК и сайт расщепления были отделены друг от друга, что не является наиболее распространенной среди рестрикционных ферментов. [25] Как только этот фермент был обнаружен, его отщепляющая часть могла быть отделена, что было бы очень неспецифичным, поскольку у него не было бы способности распознавать. Затем эта часть может быть связана с пептидами, распознающими последовательность, что может привести к очень высокой специфичности.

Мотивы цинковых пальцев присутствуют в нескольких факторах транскрипции . Ион цинка, содержащийся в 8% всех белков человека, играет важную роль в организации их трехмерной структуры. В факторах транскрипции он чаще всего располагается в сайтах взаимодействия белок-ДНК, где он стабилизирует мотив. С-концевая часть каждого пальца отвечает за специфическое распознавание последовательности ДНК.

Распознаваемые последовательности короткие, состоят примерно из 3 пар оснований, но путем объединения от 6 до 8 цинковых пальцев, чьи сайты узнавания были охарактеризованы, можно получить специфические белки для последовательностей примерно из 20 пар оснований. Следовательно, можно контролировать экспрессию определенного гена. Было продемонстрировано, что эту стратегию можно использовать для стимулирования процесса ангиогенеза у животных. [26] Также возможно слить сконструированный таким образом белок с каталитическим доменом эндонуклеазы, чтобы вызвать целевой разрыв ДНК, и, следовательно, использовать эти белки в качестве инструментов геномной инженерии. [27]

Обычно принятый для этого метод включает связывание двух ДНК-связывающих белков, каждый из которых содержит от 3 до 6 специально выбранных цинковых пальцев, с каталитическим доменом эндонуклеазы FokI, который должен димеризоваться для расщепления двухцепочечной ДНК. Эти два белка распознают две последовательности ДНК, расстояние между которыми составляет несколько нуклеотидов. Связывание двух белков цинковых пальцев с их соответствующими последовательностями сближает два домена FokI. FokI требует, чтобы димеризация обладала нуклеазной активностью, а это означает, что специфичность резко возрастает, поскольку каждый партнер нуклеазы распознает уникальную последовательность ДНК. Чтобы усилить этот эффект, были разработаны нуклеазы FokI , которые могут функционировать только как гетеродимеры. [28]

Несколько подходов используются для создания специфических нуклеаз «цинковые пальцы» для выбранных последовательностей. Самый распространенный вариант - комбинирование узлов с цинковыми пальцами с известной спецификой (модульная сборка). Были разработаны различные методы отбора с использованием клеток бактерий, дрожжей или млекопитающих для выявления комбинаций, обеспечивающих наилучшую специфичность и наилучшую переносимость клеток. Хотя о прямой полногеномной характеристике активности нуклеазы цинкового пальца не сообщалось, анализ, который измеряет общее количество двухцепочечных разрывов ДНК в клетках, обнаружил, что только один-два таких разрыва происходят выше фона в клетках, обработанных нуклеазами цинкового пальца. с составным сайтом узнавания длиной 24 п.н. и облигатными гетеродимерными доменами нуклеазы FokI . [28]

Нуклеазы, функционирующие как гетеродимеры, могли бы избежать возможности нежелательной гомодимерной активности и, таким образом, повысить специфичность DSB. Хотя нуклеазные части конструкций ZFN и TALEN имеют схожие свойства, разница между этими сконструированными нуклеазами заключается в их пептиде, распознающем ДНК. ZFNs полагаются на цинковые пальцы Cys2-His2 и конструкции TALEN на TALEs. Оба этих ДНК-распознающих пептидных домена обладают тем свойством, что они в природе встречаются в комбинациях в своих белках. Cys2-His2 Цинковые пальцы обычно встречаются в повторах, находящихся на расстоянии 3 п.н., и обнаруживаются в различных комбинациях в различных белках, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, таких как факторы транскрипции.. Каждый палец домена цинкового пальца полностью независим, и на связывающую способность одного пальца влияет его сосед. С другой стороны, TALE встречаются в повторах с соотношением распознавания один к одному между аминокислотами и распознанными парами нуклеотидов. Поскольку и «цинковые пальцы», и «СКАЗКИ» повторяются в повторяющихся схемах, можно попробовать различные комбинации для создания самых разнообразных специфичных последовательностей. [17]Цинковые пальцы были более устоявшимися в этих терминах и подходах, таких как модульная сборка (где цинковые пальцы, коррелированные с триплетной последовательностью, присоединяются в ряд, чтобы покрыть требуемую последовательность), OPEN (выбор с низкой строгостью пептидных доменов против триплетных нуклеотидов с последующим путем высокочувствительного отбора комбинации пептидов по сравнению с конечной мишенью в бактериальных системах) и бактериальный моногибридный скрининг библиотек с цинковыми пальцами среди других методов были использованы для получения сайт-специфичных нуклеаз.

Нуклеазы цинковых пальцев - это инструменты исследований и разработок, которые уже использовались для модификации ряда геномов, в частности, в лабораториях Консорциума цинковых пальцев. Американская компания Sangamo BioSciences использует нуклеазы цинковых пальцев для проведения исследований в области генной инженерии стволовых клеток и модификации иммунных клеток в терапевтических целях. [29] [30] Модифицированные Т-лимфоциты в настоящее время проходят фазу I клинических испытаний для лечения одного типа опухоли головного мозга (глиобластомы) и борьбы со СПИДом. [28]

ТАЛЕН [ править ]

Общий обзор процесса TALEN

Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), представляют собой специфические ДНК-связывающие белки, которые имеют массив из 33 или 34 аминокислотных повторов. TALEN - это искусственные рестрикционные ферменты, созданные путем слияния ДНК-разрезающего домена нуклеазы с доменами TALE, которые могут быть адаптированы для специфического распознавания уникальной последовательности ДНК. Эти слитые белки служат в качестве легко нацеливаемых «ножниц для ДНК» для приложений редактирования генов, которые позволяют выполнять целевые модификации генома, такие как вставка, удаление, репарация и замена последовательностей в живых клетках. [31] ДНК-связывающие домены, которые могут быть созданы для связывания любой желаемой последовательности ДНК, происходят от эффекторов TAL , ДНК-связывающих белков, выделяемых патогенными растениями Xanthomanos app.Эффекторы TAL состоят из повторяющихся доменов, каждый из которых содержит высококонсервативную последовательность из 34 аминокислот и распознает один нуклеотид ДНК в целевом сайте. Нуклеаза может создавать двухцепочечные разрывы в целевом сайте, которые могут быть восстановлены путем негомологичного соединения концов, склонного к ошибкам.(NHEJ), что приводит к нарушению работы генов из-за внесения небольших вставок или делеций. Каждый повтор является консервативным, за исключением так называемых повторяющихся вариабельных ди-остатков (RVD) в аминокислотных положениях 12 и 13. RVD определяют последовательность ДНК, с которой будет связываться TALE. Это простое взаимно-однозначное соответствие между повторами TALE и соответствующей последовательностью ДНК упрощает процесс сборки массивов повторов для распознавания новых последовательностей ДНК. Эти TALE могут быть слиты с каталитическим доменом нуклеазы ДНК, FokI, с образованием эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN). Полученные конструкции TALEN сочетают в себе специфичность и активность, эффективно генерируя сконструированные нуклеазы, специфичные для последовательности, которые связывают и расщепляют последовательности ДНК только в заранее выбранных сайтах.Система распознавания целей TALEN основана на легко предсказуемом коде. Нуклеазы TAL специфичны для своей мишени отчасти из-за длины их сайта связывания из 30+ пар оснований. TALEN может быть выполнен в диапазоне 6 пар оснований любого отдельного нуклеотида во всем геноме.[32]

Конструкции TALEN используются аналогично разработанным нуклеазам цинкового пальца и имеют три преимущества в целевом мутагенезе: (1) специфичность связывания ДНК выше, (2) нецелевые эффекты ниже и (3) конструкция связывания ДНК домены проще.

CRISPR [ править ]

Основная статья: редактирование генов CRISPR

CRISPR (кластерные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы) - это генетические элементы, которые бактерии используют в качестве своего рода приобретенного иммунитета для защиты от вирусов. Они состоят из коротких последовательностей, которые происходят из вирусных геномов и включены в бактериальный геном. Cas (белки, связанные с CRISPR) обрабатывают эти последовательности и вырезают соответствующие последовательности вирусной ДНК. Путем введения плазмид, содержащих гены Cas и специально сконструированные CRISPR, в эукариотические клетки, эукариотический геном можно разрезать в любом желаемом положении. [33]

Редактирование с помощью модификации Nucleobase (редактирование BASE) [ править ]

Один из самых ранних методов эффективного редактирования нуклеиновых кислот с использованием ферментов, модифицирующих азотистые основания, управляемых направляющими последовательностями нуклеиновых кислот, был впервые описан в 1990-х годах и возродился совсем недавно. [1] [34] [35] [36] Этот метод имеет то преимущество, что он не требует разрыва цепей геномной ДНК и, таким образом, позволяет избежать случайных вставок и делеций, связанных с разрывом цепей ДНК. Он подходит только для точного редактирования, требующего изменения отдельных нуклеотидов, и оказался очень эффективным для этого типа редактирования. [36]

Точность и эффективность сконструированных нуклеаз [ править ]

Мегануклеазный метод редактирования генов наименее эффективен из перечисленных выше. Из-за природы его ДНК-связывающего элемента и расщепляющего элемента он ограничен распознаванием одной потенциальной мишени на каждые 1000 нуклеотидов. [7] ZFN был разработан для преодоления ограничений мегануклеазы. Число возможных мишеней, которые может распознать ZFN, увеличилось до одного на каждые 140 нуклеотидов. [7] Однако оба метода непредсказуемы, поскольку их ДНК-связывающие элементы влияют друг на друга. В результате требуются высокий уровень знаний и длительные и дорогостоящие процессы проверки.

Использование нуклеаз TALE, являясь наиболее точным и специфическим методом, дает более высокую эффективность, чем два предыдущих метода. Такая эффективность достигается благодаря тому, что ДНК-связывающий элемент состоит из массива субъединиц TALE, каждая из которых обладает способностью распознавать определенную нуклеотидную цепь ДНК независимо от других, что приводит к большему количеству целевых сайтов с высокой точностью. На создание новых нуклеаз TALE уходит около недели и несколько сотен долларов с учетом специфики молекулярной биологии и белковой инженерии. [7]

Нуклеазы CRISPR имеют немного меньшую точность по сравнению с нуклеазами TALE. Это вызвано необходимостью наличия определенного нуклеотида на одном конце для производства направляющей РНК, которую CRISPR использует для восстановления индуцируемого им двухцепочечного разрыва. Было показано, что это самый быстрый и дешевый метод, который стоит менее двухсот долларов и несколько дней времени. [7] CRISPR также требует наименьшего количества знаний в области молекулярной биологии, так как дизайн основан на направляющей РНК, а не на белках. Одним из основных преимуществ CRISPR перед методами ZFN и TALEN является то, что он может быть направлен на нацеливание на различные последовательности ДНК с использованием своих ~ 80nt CRISPR sgRNA, в то время как методы ZFN и TALEN требовали создания и тестирования белков, созданных для нацеливания на каждую последовательность ДНК. [37]

Потому что от целевой активности активной нуклеазы будет иметь потенциально опасные последствия на генетические и организменных уровнях, точность мегануклеазы, ZFNs, CRISPR и слитые Таленой основе была активная областью исследований. Хотя сообщалось о различных цифрах, ZFN, как правило, обладают большей цитотоксичностью, чем методы TALEN или нуклеазы, управляемые РНК, в то время как подходы, управляемые TALEN и РНК, как правило, имеют наибольшую эффективность и меньше побочных эффектов. [38] Основываясь на максимальном теоретическом расстоянии между связыванием ДНК и нуклеазной активностью, подходы TALEN обеспечивают наибольшую точность. [7]

Мультиплексная автоматизированная геномная инженерия (MAGE) [ править ]

Синтетическая ДНК многократно вводится в несколько целевых областей хромосомы и / или локусов, а затем реплицируется, производя клетки с мутациями или без них.

Методы для ученых и исследователей, желающих изучить геномное разнообразие и все возможные связанные фенотипы, были очень медленными, дорогими и неэффективными. До этой новой революции исследователям приходилось проводить манипуляции с одним геном и настраивать один маленький участок генома за раз, наблюдать фенотип и начинать процесс заново с другой манипуляции с одним геном. [39]Поэтому исследователи из Института Висса при Гарвардском университете разработали MAGE - мощную технологию, улучшающую процесс редактирования генома in vivo. Он позволяет быстро и эффективно манипулировать геномом, причем все это происходит в машине, достаточно маленькой, чтобы ее можно было поставить на небольшой кухонный стол. Эти мутации сочетаются с вариациями, которые естественным образом возникают во время митоза клеток, создавая миллиарды клеточных мутаций.

Химически объединенная синтетическая одноцепочечная ДНК (оцДНК) и пул олигионуклеотидов вводятся в целевые области клетки, тем самым создавая генетические модификации. Циклический процесс включает трансформацию оцДНК ( электропорацией), за которым следует рост, во время которого белки гомологичной рекомбинации бактериофагов опосредуют отжиг оцДНК к их геномным мишеням. Эксперименты, нацеленные на селективные фенотипические маркеры, проверяют и идентифицируют, помещая клетки на дифференциальные среды. Каждый цикл в конечном итоге занимает 2,5 часа, с дополнительным временем, необходимым для выращивания изогенных культур и характеристики мутаций. Путем итеративного введения библиотек мутагенных оцДНК, нацеленных на множество сайтов, MAGE может генерировать комбинаторное генетическое разнообразие в популяции клеток. Можно редактировать до 50 геномов, от одиночных пар нуклеотидных оснований до всего генома или генных сетей одновременно с результатами в считанные дни. [39]

Эксперименты MAGE можно разделить на три класса, характеризующиеся разной степенью масштаба и сложности: (i) множество сайтов-мишеней, отдельные генетические мутации; (ii) единственный сайт-мишень, множество генетических мутаций; и (iii) множество сайтов-мишеней, множество генетических мутаций. [39] Пример третьего класса был отражен в 2009 году, когда Черч и его коллеги смогли запрограммировать Escherichia coli.производить в пять раз больше обычного количества ликопина, антиоксиданта, обычно содержащегося в семенах томатов и обладающего противораковыми свойствами. Они применили MAGE для оптимизации метаболического пути 1-дезокси-d-ксилулозо-5-фосфата (DXP) в Escherichia coli с целью избыточного производства изопреноидного ликопина. На это у них ушло около 3 дней и чуть более 1000 долларов на материалы. Легкость, скорость и экономическая эффективность, с которыми MAGE может изменять геномы, могут изменить подход промышленности к производству и производству важных соединений в биоинженерии, биоэнергетике, биомедицинской инженерии, синтетической биологии, фармацевтической, сельскохозяйственной и химической промышленности.

Приложения [ править ]

Гены растений, животных и человека, успешно нацеленные на использование ZFN, что демонстрирует универсальность этого подхода.

По состоянию на 2012 год эффективное редактирование генома было разработано для широкого спектра экспериментальных систем, начиная от растений и заканчивая животными, что часто выходит за рамки клинического интереса, и становится стандартной экспериментальной стратегией в исследовательских лабораториях. [40] Недавнее поколение ZFN-опосредованных мутантов крыс, рыбок данио , кукурузы и табака и усовершенствования подходов, основанных на TALEN, свидетельствуют о значении этих методов, и этот список быстро расширяется. Редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз, вероятно, внесет вклад во многие области наук о жизни, от изучения функций генов у растений и животных до генной терапии у людей. Например, в области синтетической биологиикоторый нацелен на создание клеток и организмов для выполнения новых функций, вероятно, выиграет от способности модифицированной нуклеазы добавлять или удалять элементы генома и, следовательно, создавать сложные системы. [40] Кроме того, функции генов можно изучить с помощью стволовых клеток с помощью сконструированных нуклеаз.

Ниже перечислены некоторые конкретные задачи, которые может выполнять этот метод:

  • Нацеленная мутация гена
  • Генная терапия
  • Создание хромосомной перестройки
  • Изучение функции генов с помощью стволовых клеток
  • Трансгенные животные
  • Мечение эндогенных генов
  • Целевое добавление трансгена

Целенаправленная модификация генов у животных [ править ]

Сочетание последних открытий в области генной инженерии, в частности редактирования генов, и последних улучшений в технологиях воспроизводства крупного рогатого скота (например, культивирование эмбрионов in vitro ) позволяет редактировать геном непосредственно в оплодотворенных ооцитах с использованием синтетических высокоспецифичных эндонуклеаз. РНК-управляемые эндонуклеазы: кластеры с регулярными интервалами между короткими палиндромными повторами, ассоциированными с Cas9 (CRISPR / Cas9), представляют собой новый инструмент, еще более расширяющий диапазон доступных методов . В частности, сконструированные эндонуклеазы CRISPR / Cas9 позволяют использовать несколько направляющих РНК для одновременного нокаута (KO) за один этап путем прямой цитоплазматической инъекции (CDI) в зиготы млекопитающих. [41]

Благодаря параллельному развитию транскриптомики единичных клеток, редактированию генома и новым моделям стволовых клеток мы сейчас вступаем в захватывающий с научной точки зрения период, когда функциональная генетика больше не ограничивается моделями животных, а может выполняться непосредственно на образцах человека. Анализ экспрессии одноклеточных генов разрешил транскрипционную дорожную карту человеческого развития, на основе которой определяются ключевые гены-кандидаты для функциональных исследований. Используя глобальные данные транскриптомики для проведения экспериментов, инструмент редактирования генома на основе CRISPR сделал возможным нарушить или удалить ключевые гены, чтобы выяснить их функции в условиях человека. [42]

Целенаправленная модификация генов у растений [ править ]

Обзор рабочего процесса GEEN и возможностей редактирования

Геном редактирование с помощью Meganuclease , [43] ZFNs и Таленый предоставляют новую стратегию генетических манипуляций в растениях и, скорее всего , чтобы помочь в проектировании желаемых признаков растений путем модификации эндогенных генов. Например, сайт-специфическое добавление генов у основных видов сельскохозяйственных культур может использоваться для «суммирования признаков», посредством чего несколько желаемых признаков физически связаны, чтобы гарантировать их совместную сегрегацию в процессе селекции. [28] Недавно сообщалось о прогрессе в таких случаях у Arabidopsis thaliana [44] [45] [46] и Zea mays . У Arabidopsis thalianaс использованием нацеливания на гены с помощью ZFN два гена устойчивости к гербицидам (табачная ацетолактатсинтаза SuRA и SuRB) были введены в локусы SuR с 2% трансформированных клеток с мутациями. [47] У Zea mays нарушение целевого локуса было достигнуто с помощью ZFN-индуцированных DSB и возникающих в результате NHEJ. В этом случае ZFN также использовали для приведения кассеты экспрессии гена устойчивости к гербицидам (PAT) в целевой эндогенный локус IPK1. [48] Такая модификация генома, наблюдаемая у регенерированных растений, как было показано, передается по наследству и передается следующему поколению. [48] Потенциально успешный пример применения методов редактирования генома для улучшения сельскохозяйственных культур можно найти в банане, где ученые использовалиРедактирование CRISPR / Cas9 для инактивации эндогенного вируса полосатости бананов в геноме B банана ( Musa spp. ) Для преодоления серьезной проблемы в селекции бананов. [49]

Кроме того, геномная инженерия на основе TALEN была тщательно протестирована и оптимизирована для использования в растениях. [50] Смеси TALEN также использовались американской компанией по производству пищевых ингредиентов Calyxt [51] для улучшения качества соевых масел [52] и увеличения потенциала хранения картофеля [53]

Необходимо выполнить несколько оптимизаций, чтобы улучшить редактирование геномов растений с использованием ZFN-опосредованного нацеливания. [54] Существует потребность в надежном дизайне и последующем тестировании нуклеаз, отсутствие токсичности нуклеаз, соответствующий выбор растительной ткани для нацеливания, пути индукции активности фермента, отсутствие нецелевого мутагенеза. и надежное обнаружение мутировавших случаев. [54]

Распространенным методом доставки CRISPR / Cas9 в растения является трансформация на основе Agrobacterium . [55] Т-ДНК вводится непосредственно в геном растения по механизму T4SS. Кассеты экспрессии на основе Cas9 и gRNA превращаются в плазмиды Ti , которые трансформируются в Agrobacterium для применения в растениях. [55] Для улучшения доставки Cas9 в живые растения используются вирусы, более эффективная доставка трансгенов. [55]

Часть серии статей о
Синтетическая биология
Синтетические биологические схемы
  • База данных синтетических генов
  • BioBrick
  • Реестр стандартных биологических частей
Редактирование генома
  • CRISPR
  • Генная терапия
  • Синтетическая иммунология
Искусственные клетки
  • Искусственный синтез генов
  • Синтетическая геномика
  • Лаборатория микоплазм
  • Protocell
Ксенобиология
  • Аналог нуклеиновой кислоты
  • Ксено нуклеиновая кислота
  • Неестественная базовая пара
  • Расширенный генетический код
  • Зеркальная жизнь
Другие темы
  • Опасности
  • Открытая синтетическая биология
  • Биология своими руками
  • v
  • т
  • е

Исследование [ править ]

Генная терапия [ править ]

Идеальная практика генной терапии - это замена дефектного гена нормальным аллелем в его естественном месте. Это выгодно по сравнению с геном, доставляемым вирусами, поскольку нет необходимости включать полные кодирующие последовательности и регуляторные последовательности, когда требуется изменить только небольшую часть гена, как это часто бывает. [56] Экспрессия частично замененных генов также более соответствует нормальной клеточной биологии, чем полные гены, переносимые вирусными векторами.

Первое клиническое применение редактирования генома на основе TALEN было в лечении CD19 + острого лимфобластного лейкоза у 11-месячного ребенка в 2015 году. Модифицированные донорские Т-клетки были сконструированы так, чтобы атаковать лейкозные клетки, чтобы они были устойчивыми к Алемтузумабу и избегали обнаружение иммунной системой хозяина после введения. [57] [58]

Обширные исследования были проведены на клетках и животных с использованием CRISPR-Cas9, чтобы попытаться исправить генетические мутации, вызывающие генетические заболевания, такие как синдром Дауна, расщепление позвоночника, анэнцефалия и синдромы Тернера и Клайнфельтера. [59]

В феврале 2019 года ученые-медики, работающие с Sangamo Therapeutics , штаб-квартира которой находится в Ричмонде, штат Калифорния , объявили о первой в истории терапии генного редактирования человека «в организме» для постоянного изменения ДНК - у пациента с синдромом Хантера . [60] Сангамо проводит клинические испытания, связанные с редактированием генов с использованием нуклеазы цинковых пальцев (ZFN). [61]

Искоренение болезней [ править ]

Исследователи использовали CRISPR-cas9 генов дисков для модификации генов , связанных с бесплодием в A. gambiae , вектор малярии. [62] Этот метод имеет дополнительное значение для искоренения других трансмиссивных болезней, таких как желтая лихорадка, денге и вирус Зика. [63]

Система CRISPR-Cas9 может быть запрограммирована для модуляции популяции любых видов бактерий путем нацеливания на клинические генотипы или эпидемиологические изоляты. Он может избирательно активировать полезные виды бактерий над вредными, устраняя патогены, что дает ему преимущество перед антибиотиками широкого спектра действия. [39]

Антивирусные приложения для лечения вирусов человека, таких как ВИЧ, герпес и вирус гепатита B, находятся в стадии исследования. CRISPR можно использовать для нацеливания на вирус или хозяина, чтобы разрушить гены, кодирующие белки рецепторов клеточной поверхности вируса. [37] В ноябре 2018 года Хэ Цзянькуй объявил, что отредактировал два человеческих эмбриона, чтобы попытаться отключить ген CCR5 , который кодирует рецептор, который ВИЧ использует для проникновения в клетки. Он сказал, что девочки-близнецы Лулу и Нана родились несколькими неделями ранее. Он сказал, что у девочек все еще есть функциональные копии CCR5 вместе с отключенным CCR5 ( мозаика) и все еще были уязвимы к ВИЧ. Работа была широко осуждена как неэтичная, опасная и преждевременная. [64]

В январе 2019 года ученые из Китая сообщили о создании пяти идентичных клонированных обезьян, подвергнутых редактированию генов, с использованием той же техники клонирования, которая использовалась с Чжун Чжун и Хуа Хуа - первыми клонированными обезьянами - и овцой Долли , и тем же геном. редактирование Crispr - техника Cas9 , которую предположительно использовал Хэ Цзянькуй при создании первых в истории генетически модифицированных человеческих младенцев Лулу и Наны . Клоны обезьян были созданы для изучения нескольких заболеваний. [65] [66]

В ближайшем будущем новая система CRISPR также сможет искоренить болезни и состояния, к которым люди предрасположены. С помощью этой новой технологии ученые смогут взять гены сперматозоидов и яйцеклетки человека и заменить гены, которые активируют рак или другие аномальные или нежелательные дефекты. Это снимет стресс с родителей, которые беспокоятся о том, что у них будет ребенок, и которые не смогут жить нормальной жизнью. После всего лишь одного поколения этого процесса всему будущему человечества никогда не придется беспокоиться о проблемах уродств или предрасположенных состояний. [67]

Перспективы и ограничения [ править ]

В будущем важной целью исследования редактирования генома с помощью сконструированных нуклеаз должно стать повышение безопасности и специфичности нуклеаз. Например, улучшение способности обнаруживать нецелевые события может улучшить нашу способность узнавать о способах их предотвращения. Кроме того, цинковые пальцы, используемые в ZFN, редко бывают полностью специфичными, а некоторые из них могут вызывать токсическую реакцию. Однако сообщалось, что токсичность снижается за счет модификации домена расщепления ZFN. [56]

Кроме того, исследования Даны Кэрролл по модификации генома с помощью сконструированных нуклеаз показали необходимость лучшего понимания основных механизмов рекомбинации и репарации ДНК. В будущем возможным методом идентификации вторичных мишеней будет захват оборванных концов клеток, экспрессирующих ZFN, и секвенирование фланкирующей ДНК с использованием высокопроизводительного секвенирования. [56]

Благодаря простоте использования и рентабельности CRISPR в настоящее время проводятся обширные исследования. Сейчас публикаций о CRISPR больше, чем о ZFN и TALEN, несмотря на недавнее открытие CRISPR. [37] И CRISPR, и TALEN являются предпочтительными вариантами для внедрения в крупномасштабном производстве из-за их точности и эффективности.

Редактирование генома происходит также как естественный процесс без искусственной генной инженерии. Агентами, способными редактировать генетические коды, являются вирусы или субвирусные РНК-агенты.

Хотя GEEN имеет более высокую эффективность, чем многие другие методы обратной генетики, он все же не очень эффективен; во многих случаях желаемые изменения достигают менее половины обработанных популяций. [47] Например, когда кто-то планирует использовать NHEJ клетки для создания мутации, системы HDR клетки также будут работать, исправляя DSB с более низкой скоростью мутаций.

Традиционно мыши были наиболее частым выбором исследователей в качестве хозяина модели заболевания. CRISPR может помочь преодолеть разрыв между этой моделью и клиническими испытаниями на людях, создав модели трансгенных заболеваний на более крупных животных, таких как свиньи, собаки и нечеловеческие приматы. [68] [69] Используя систему CRISPR-Cas9, запрограммированный белок Cas9 и sgRNA могут быть непосредственно введены в оплодотворенные зиготы для достижения желаемых модификаций генов при создании трансгенных моделей на грызунах. Это позволяет обойти обычную стадию нацеливания на клетки при создании трансгенных линий и, как следствие, сокращает время генерации на 90%. [69]

Одним из потенциальных возможностей CRISPR с его эффективностью является применение ксенотрансплантации. В предыдущих исследованиях CRISPR продемонстрировал способность нацеливать и устранять эндогенные ретровирусы, что снижает риск передачи заболеваний и снижает иммунные барьеры. [37] Устранение этих проблем улучшает функцию донорских органов, что приближает это приложение к реальности.

У растений редактирование генома рассматривается как жизнеспособное решение для сохранения биоразнообразия. Генный драйв - это потенциальный инструмент для изменения скорости воспроизводства инвазивных видов , хотя с этим связаны значительные риски. [70]

Улучшение человека [ править ]

Многие трансгуманисты рассматривают редактирование генома как потенциальный инструмент улучшения человека . [71] [72] [73] Австралийский биолог и профессор генетики Дэвид Эндрю Синклер отмечает, что «новые технологии редактирования генома позволят использовать его на людях (...), чтобы иметь (...) более здоровых детей» - дизайнерские младенцы . [74] Согласно отчету Совета Наффилда по биоэтике за сентябрь 2016 г., в будущем можно будет улучшить людей генами от других организмов или полностью синтетическими генами, например, для улучшения ночного видения и обоняния . [75] [76]

Американская национальная академия наук и Национальная медицинская академия выпустили в феврале 2017 года отчет, в котором квалифицированно поддерживаются редактирование генома человека. [77] Они рекомендовали разрешить клинические испытания редактирования генома, как только будут найдены ответы на проблемы безопасности и эффективности, «но только для серьезных условий под строгим контролем». [78]

Риски [ править ]

В заявлении разведывательного сообщества США о всемирной оценке угроз 2016 года директор национальной разведки США Джеймс Р. Клэппер назвал редактирование генома потенциальным оружием массового уничтожения , заявив, что редактирование генома, проводимое странами с нормативными или этическими стандартами, "отличается от Западные страны «вероятно, увеличивают риск создания вредных биологических агентов или продуктов. Согласно заявлению, широкое распространение, низкая стоимость и ускоренные темпы развития этой технологии, ее преднамеренное или непреднамеренное неправильное использование может привести к далеко идущим последствиям для экономики и национальной безопасности. [79] [80] [81]Например, такие технологии, как CRISPR, можно использовать для создания «комаров-убийц», вызывающих эпидемии, уничтожающие основные сельскохозяйственные культуры. [81]

Согласно отчету Совета по биоэтике Наффилда за сентябрь 2016 г. , простота и низкая стоимость инструментов для редактирования генетического кода позволят любителям - или « биохакерам » - проводить свои собственные эксперименты, что создает потенциальный риск от выпуска генетически модифицированных ошибки. Обзор также показал, что риски и преимущества изменения генома человека - и передачи этих изменений будущим поколениям - настолько сложны, что требуют срочной этической проверки. Такие модификации могут иметь непредвиденные последствия, которые могут нанести вред не только ребенку, но и их будущим детям, поскольку измененный ген будет в их сперме или яйцеклетках. [75] [76] В 2001 году австралийские исследователи Рональд Джексон и Ян Рэмшоу подверглись критике за публикацию статьи в Journal of Virology, в которой изучались потенциальные возможности борьбы с мышами, одним из основных вредителей в Австралии, путем заражения их измененным вирусом оспы мышей, который мог вызвать бесплодие. информация может привести к производству биологического оружия потенциальными биотеррористами, которые могут использовать эти знания для создания устойчивых к вакцинам штаммов других вирусов оспы, таких как оспа , которые могут поражать людей. [76] [82] Кроме того, существуют дополнительные опасения по поводу экологических рисков, связанных с высвобождением генов в дикие популяции. [76][83] [84]

См. Также [ править ]

  • CRISPR / Cpf1
  • Редактирование эпигенома
  • Технология выбора зародышей
  • NgAgo , эндонуклеаза аргонавта, управляемая оцДНК

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Вульф, Тод М. (апрель 1998 г.). «Терапевтическое восстановление мутированных последовательностей нуклеиновых кислот» . Природа Биотехнологии . 16 (4): 341–344. DOI : 10.1038 / nbt0498-341 . ISSN  1546-1696 . PMID  9555723 . S2CID  9210810 .
  2. ^ «Метод года 2011» . Природные методы . 9 (1): 1 января 2012 г. doi : 10.1038 / nmeth.1852 . PMID 22312634 . 
  3. ^ Science News Staff (17 декабря 2015 г.). «Прорыв года: CRISPR - лучший вариант» .
  4. ^ Esvelt К.М., Ван HH (2013). «Геномная инженерия для систем и синтетической биологии» . Молекулярная системная биология . 9 (1): 641. DOI : 10.1038 / msb.2012.66 . PMC 3564264 . PMID 23340847 .  
  5. ^ Tan WS, Карлсон DF, Уолтон MW, Fahrenkrug SC Хакетт PB (2012). «Прецизионное редактирование геномов крупных животных». Успехи в генетике Том 80 . Успехи в генетике . 80 . С. 37–97. DOI : 10.1016 / B978-0-12-404742-6.00002-8 . ISBN 9780124047426. PMC  3683964 . PMID  23084873 .
  6. ^ Puchta H, Fauser F (2013). «Нацеливание на гены в растениях: 25 лет спустя» . Международный журнал биологии развития . 57 (6–8): 629–37. DOI : 10,1387 / ijdb.130194hp . PMID 24166445 . 
  7. ^ a b c d e f Боглиоли Э., Ричард М. «Переписывая книгу жизни: новая эра в точном редактировании генома» (PDF) . Бостонская консалтинговая группа . Проверено 30 ноября 2015 года .
  8. ^ Черч Г. "Будущее генетических кодов и кодов BRAIN" . YouTube . NIHvcast . Проверено 10 февраля +2017 .
  9. ^ Cyranoski, Дэвид (20 мая 2019). «Китай намерен ввести регулирование редактирования генов после CRISPR-baby furore - проект правил означает, что любой, кто манипулирует человеческими генами у взрослых или эмбрионов, несет ответственность за неблагоприятные результаты» . Природа . DOI : 10.1038 / d41586-019-01580-1 . PMID 32424191 . Дата обращения 20 мая 2019 . 
  10. ^ Чеонг, Кан Хао; Ко, Джин Мин; Джонс, Майкл С. (2019). «Черные лебеди CRISPR: стохастичность и сложность генетической регуляции». BioEssays . 0 (7): 1900032. doi : 10.1002 / bies.201900032 . ISSN 1521-1878 . PMID 31090950 .  
  11. ^ AFP. «Испытание в США показывает, что геномы трех больных раком были безопасно изменены с помощью CRISPR» . ScienceAlert . Проверено 9 февраля 2020 .
  12. ^ Лодиш Н, Берк А, Zipursky SL, Мацудаира Р, Балтимор D, Дарнелл J (2000). «Глава 8.5: Замена генов и трансгенные животные: ДНК переносится в эукариотические клетки различными способами» . Молекулярная клеточная биология (4-е изд.). WH Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-3136-8.
  13. ^ a b Роша-Мартинс М, Кавальейро Г.Р., Матос-Родригес Г.Э., Мартинс Р.А. (август 2015 г.). «От нацеливания на гены до редактирования генома: приложения для трансгенных животных и не только» . An. Акад. Бюстгальтеры. Ciênc . 87 (2 Suppl): 1323–48. DOI : 10.1590 / 0001-3765201520140710 . ISSN 0001-3765 . PMID 26397828 .  
  14. ^ "Нобелевская премия по физиологии и медицине 2007" . Нобелевский фонд . Проверено 15 декабря 2008 года .
  15. ^ Jasin M (июнь 1996). «Генетические манипуляции с геномами с помощью редко-режущих эндонуклеаз». Тенденции в генетике . 12 (6): 224–8. DOI : 10.1016 / 0168-9525 (96) 10019-6 . PMID 8928227 . 
  16. ↑ Стоддард BL (февраль 2005 г.). «Строение и функция самонаводящейся эндонуклеазы». Ежеквартальные обзоры биофизики . 38 (1): 49–95. DOI : 10.1017 / s0033583505004063 . PMID 16336743 . 
  17. ^ a b de Souza N (январь 2012 г.). «Праймер: редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз». Природные методы . 9 (1): 27. DOI : 10.1038 / nmeth.1848 . PMID 22312638 . S2CID 26924628 .  
  18. ^ a b c Смит Дж., Гризо С., Арно С., Дюклер А., Эпинат Дж. К., Чамес П., Прието Дж., Редондо П., Бланко Ф. Дж., Браво Дж., Монтойя Г., Пак Ф., Дюшато П. (2006). «Комбинаторный подход к созданию эндонуклеаз искусственного самонаведения, расщепляющих выбранные последовательности» . Исследования нуклеиновых кислот . 34 (22): e149. DOI : 10.1093 / NAR / gkl720 . PMC 1702487 . PMID 17130168 .  
  19. ^ Селигман Л.М., Чишолй К.М., Шевалье BS, MS Chadsey, Эдвардс ST, Savage JH, Veillet AL (сентябрь 2002). «Мутации, изменяющие специфичность расщепления самонаводящейся эндонуклеазы» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (17): 3870–9. DOI : 10.1093 / NAR / gkf495 . PMC 137417 . PMID 12202772 .  
  20. ^ Шевалье BS, Kortemme T, Chadsey MS, Baker D, Monnat RJ Стоддард BL (октябрь 2002). «Дизайн, активность и структура высокоспецифической искусственной эндонуклеазы». Молекулярная клетка . 10 (4): 895–905. DOI : 10.1016 / S1097-2765 (02) 00690-1 . PMID 12419232 . 
  21. ^ Арнульд S, Chames Р, Перес С, Лакруа Е, Duclert А, Epinat JC, Stricher F, Пти А.С., Патин А, Guillier S, Роллан S, Прито Дж, Бланко FJ, Браво Дж, Монтойя G, Серрано л, Duchateau P, Pâques F (январь 2006 г.). «Разработка большого количества высокоспецифичных эндонуклеаз самонаведения, которые индуцируют рекомбинацию на новых мишенях ДНК». Журнал молекулярной биологии . 355 (3): 443–58. DOI : 10.1016 / j.jmb.2005.10.065 . PMID 16310802 . 
  22. ^ Рационально спроектированные мегануклеазы с измененной последовательностью специфичностью и ДНК-связывающей аффинностью , 2006-10-18 , извлекаются 2018-08-11
  23. Перейти ↑ Ashworth J, Taylor GK, Havranek JJ, Quadri SA, Stoddard BL, Baker D (сентябрь 2010 г.). «Вычислительное перепрограммирование специфичности самонаводящейся эндонуклеазы на множестве соседних пар оснований» . Исследования нуклеиновых кислот . 38 (16): 5601–8. DOI : 10.1093 / NAR / gkq283 . PMC 2938204 . PMID 20435674 .  
  24. ^ Редондо Р, Прито Дж, Муньос И.Г., Alibés А, Stricher Ж, Серрано л, Cabaniols ДП, Daboussi Ж, Арнульд S, Perez С, Duchateau Р, Р Pâques, Бланко FJ, Монтойя G (ноябрь 2008 г.). «Молекулярная основа распознавания ДНК группы C xeroderma pigmentosum сконструированными мегануклеазами». Природа . 456 (7218): 107–11. Bibcode : 2008Natur.456..107R . DOI : 10,1038 / природа07343 . PMID 18987743 . S2CID 4300643 .  
  25. ^ a b Baker M (январь 2012 г.). «Гено-редактирующие нуклеазы». Природные методы . 9 (1): 23–6. DOI : 10.1038 / nmeth.1807 . PMID 22312637 . S2CID 37050234 .  
  26. ^ Арматурный EJ, Huang Y, Хикки R, Нат AK, Meoli D, Нат S, Чэнь B, Сюй L, Лян Y, Джеймисон AC, Чжан L, Спратт SK, Case CC, Wolffe A, Джордано FJ (декабрь 2002). «Индукция ангиогенеза на мышиной модели с использованием сконструированных факторов транскрипции». Природная медицина . 8 (12): 1427–32. DOI : 10.1038 / nm1202-795 . PMID 12415262 . S2CID 23318821 .  
  27. ↑ Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (февраль 1996 г.). «Гибридные рестрикционные ферменты: слияния цинковых пальцев с доменом расщепления Fok I» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (3): 1156–60. Bibcode : 1996PNAS ... 93.1156K . DOI : 10.1073 / pnas.93.3.1156 . PMC 40048 . PMID 8577732 .  
  28. ^ a b c d Урнов FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD (сентябрь 2010 г.). «Редактирование генома с помощью инженерных нуклеаз цинковых пальцев». Природа Обзоры Генетики . 11 (9): 636–46. DOI : 10.1038 / nrg2842 . PMID 20717154 . S2CID 205484701 .  
  29. ^ Рейк А. и др. (2008). «Нуклеазы цинковых пальцев, нацеленные на рецептор глюкокортикоидов, позволяют трансгенным CTL IL-13 зетакина убивать клетки глиобластомы in vivo в присутствии иммунодепрессантов глюкокортикоидов» . Мол. Ther . 16 (Дополнение 1): S13 – S14. DOI : 10.1016 / S1525-0016 (16) 39437-0 .
  30. ↑ Holt N, Wang J, Kim K, Friedman G, Wang X, Taupin V, Crooks GM, Kohn DB, Грегори П.Д., Холмс MC, Cannon PM (август 2010). «Человеческие гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники, модифицированные нуклеазами« цинковые пальцы », нацеленные на CCR5, контролирующие ВИЧ-1 in vivo» . Природа Биотехнологии . 28 (8): 839–47. DOI : 10.1038 / nbt.1663 . PMC 3080757 . PMID 20601939 .  
  31. ^ Gaj T, Gersbach CA, Барбас CF (июль 2013). «Методы на основе ZFN, TALEN и CRISPR / Cas для геномной инженерии» . Тенденции в биотехнологии . 31 (7): 397–405. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2013.04.004 . PMC 3694601 . PMID 23664777 .  
  32. ^ Переса-Кинтеро А.Л., Родригес-R Л.М., Dereeper А, С López, Koebnik R, Szurek В, Cunnac S (2013-07-15). «Усовершенствованный метод предсказания сайтов связывания ДНК эффекторов TAL выявляет функциональную конвергенцию в репертуарах TAL штаммов Xanthomonas oryzae» . PLOS ONE . 8 (7): e68464. Bibcode : 2013PLoSO ... 868464P . DOI : 10.1371 / journal.pone.0068464 . PMC 3711819 . PMID 23869221 .  
  33. ↑ Young S (11 февраля 2014 г.). «Геномная хирургия» . Обзор технологий MIT .
  34. ^ Вульф, TM; Чейз, JM; Стинчкомб, Д. Т. (1995-08-29). «К терапевтическому редактированию мутированных последовательностей РНК» . Труды Национальной академии наук . 92 (18): 8298–8302. Bibcode : 1995PNAS ... 92.8298W . DOI : 10.1073 / pnas.92.18.8298 . ISSN 0027-8424 . PMC 41144 . PMID 7545300 .   
  35. ^ Вульф, Тод М .; Gurumurthy, Channabasavaiah B .; Бойс, Фредерик; Кмиц, Эрик Б. (апрель 2017 г.). «Расщеплять или не расщеплять: редактирование терапевтического гена с программируемыми нуклеазами и без них» . Обзоры природы Открытие лекарств . 16 (4): 296. DOI : 10.1038 / nrd.2017.42 . ISSN 1474-1784 . PMID 28303022 .  
  36. ^ a b Komor, Alexis C .; Kim, Yongjoo B .; Пакер, Майкл С .; Zuris, John A .; Лю, Дэвид Р. (май 2016 г.). «Программируемое редактирование основания-мишени в геномной ДНК без расщепления двухцепочечной ДНК» . Природа . 533 (7603): 420–424. Bibcode : 2016Natur.533..420K . DOI : 10.1038 / nature17946 . ISSN 1476-4687 . PMC 4873371 . PMID 27096365 .   
  37. ^ а б в г Баррангу Р., Дудна Дж. А. (сентябрь 2016 г.). «Применение технологий CRISPR в исследованиях и за его пределами». Природа Биотехнологии . 34 (9): 933–941. DOI : 10.1038 / nbt.3659 . PMID 27606440 . S2CID 21543486 .  
  38. Перейти ↑ Kim H, Kim JS (май 2014 г.). «Руководство по инженерии генома с помощью программируемых нуклеаз». Природа Обзоры Генетики . 15 (5): 321–34. DOI : 10.1038 / nrg3686 . PMID 24690881 . S2CID 9373606 .  
  39. ^ а б в г Галлахер Р. Р., Ли З., Льюис А. О., Айзекс Ф. Дж. (октябрь 2014 г.). «Быстрое редактирование и эволюция бактериальных геномов с использованием библиотек синтетической ДНК». Протоколы природы . 9 (10): 2301–16. DOI : 10.1038 / nprot.2014.082 . PMID 25188632 . S2CID 16447825 .  
  40. ^ a b McMahon MA, Rahdar M, Porteus M (декабрь 2011 г.). «Генное редактирование: больше не только для перевода». Природные методы . 9 (1): 28–31. DOI : 10.1038 / nmeth.1811 . PMID 22205513 . S2CID 2144013 .  
  41. ^ Росс, Пабло Дж .; Джордж В. Смит; Раджпут, Сандип; Дайно, Брэдфорд В. (17 мая 2018 г.). «Эмбриональный POU5F1 необходим для образования расширенной бластоцисты крупного рогатого скота» . Научные отчеты . 8 (1): 7753. Bibcode : 2018NatSR ... 8.7753D . DOI : 10.1038 / s41598-018-25964-х . ISSN 2045-2322 . PMC 5958112 . PMID 29773834 .   
  42. ^ Ортега, Николас М; Винблад, Нергес; Plaza Reyes, Альваро; Ланнер, Фредрик (октябрь 2018 г.). «Функциональная генетика раннего развития человека» . Текущее мнение в области генетики и развития . 52 : 1–6. DOI : 10.1016 / j.gde.2018.04.005 . PMID 29729430 . 
  43. ^ Арну S, Delenda C, Grizot S, Desseaux C, Pâques F, Silva GH, Smith J (январь 2011). «Мегануклеаза I-CreI и ее модифицированные производные: приложения от клеточной модификации до генной терапии» . Белковая инженерия, дизайн и выбор . 24 (1-2): 27-31. DOI : 10,1093 / белок / gzq083 . PMID 21047873 . 
  44. ↑ Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (май 2009 г.). «Высокочастотная модификация генов растений с использованием сконструированных нуклеаз типа« цинковые пальцы »» . Природа . 459 (7245): 442–5. Bibcode : 2009Natur.459..442T . DOI : 10,1038 / природа07845 . PMC 2743854 . PMID 19404258 .  
  45. ↑ Zhang F, Maeder ML, Unger-Wallace E, Hoshaw JP, Reyon D, Christian M, Li X, Pierick CJ, Dobbs D, Peterson T, Joung JK, Voytas DF (июнь 2010). «Высокочастотный целевой мутагенез в Arabidopsis thaliana с использованием нуклеаз цинкового пальца» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (26): 12028–33. Bibcode : 2010PNAS..10712028Z . DOI : 10.1073 / pnas.0914991107 . PMC 2900673 . PMID 20508152 .  
  46. ^ Osakabe K, Osakabe Y, Токи S (июнь 2010). «Сайт-направленный мутагенез в Arabidopsis с использованием специально разработанных нуклеаз цинковых пальцев» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (26): 12034–9. Bibcode : 2010PNAS..10712034O . DOI : 10.1073 / pnas.1000234107 . PMC 2900650 . PMID 20508151 .  
  47. ^ a b Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (май 2009 г.). «Высокочастотная модификация генов растений с использованием сконструированных нуклеаз типа« цинковые пальцы »» . Природа . 459 (7245): 442–5. Bibcode : 2009Natur.459..442T . DOI : 10,1038 / природа07845 . PMC 2743854 . PMID 19404258 .  
  48. ^ a b Шукла В.К., Дойон Y, Миллер Дж. К., Декелвер Р. К., Моэле Э. А., Уорден С. Е., Митчелл Дж. , Симпсон М.А., Блейксли Б., Гринвалт С.А., Батлер Х.Дж., Хинкли С.Дж., Чжан Л., Ребар Э.Д., Грегори П.Д., Урнов Ф.Д. (май 2009 г.). «Точная модификация генома сельскохозяйственных культур Zea mays с использованием нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Природа . 459 (7245): 437–41. Bibcode : 2009Natur.459..437S . DOI : 10,1038 / природа07992 . PMID 19404259 . S2CID 4323298 .  
  49. ^ Трипати, Лина; Бритт, Энн; Самвел К. Муирури; Рон, Мили; Нтуи, Валентин О .; Бритт, Энн; Трипати, Джаиндра Н. (31.01.2019). «Редактирование CRISPR / Cas9 эндогенного вируса полосатости бананов в геноме B Musa spp. Решает серьезную проблему в селекции бананов» . Биология коммуникации . 2 (1): 46. DOI : 10.1038 / s42003-019-0288-7 . ISSN 2399-3642 . PMC 6355771 . PMID 30729184 .   
  50. ^ Таунсон, Джонатан (2017-01-01). «Последние разработки в области редактирования генома для потенциального использования в растениях» . Горизонты биологии . 10 . DOI : 10.1093 / BioHorizons / hzx016 .
  51. ^ Regalado, Антонио (19 декабря 2017). «Это не ГМО вашего отца» . Обзор технологий MIT . Проверено 16 апреля 2018 года .
  52. ^ Хон Вт, Коффмэн А, Clasen БМ, Demorest ZL, Лоуи А, Рэй Е, Retterath А, Стоддард Т, Juillerat А, Cedrone Ж, Матис л, Voytas DF, Чжан F (сентябрь 2014). «Повышение качества соевого масла за счет целенаправленного мутагенеза семейства гена десатуразы жирных кислот 2» . Журнал биотехнологии растений . 12 (7): 934–40. DOI : 10.1111 / pbi.12201 . PMID 24851712 . 
  53. ^ Clasen БМ, Стоддард т, Ло S, Demorest ZL, Ли Дж, Cedrone F, Tibebu R, Дэвисон S, Рэй Е.Е., Daulhac А, Коффмэн А, Yabandith А, Retterath А, Haun Вт, Балтес штат Нью - Джерси, Матис л, Voytas Д.Ф., Чжан Ф. (январь 2016 г.). «Улучшение характеристик холодного хранения и обработки картофеля посредством целевого нокаута гена». Журнал биотехнологии растений . 14 (1): 169–76. DOI : 10.1111 / pbi.12370 . PMID 25846201 . 
  54. ^ a b Пухта Х, Хон Б. (июнь 2010 г.). «Последние новости: растения мутируют точно в цель» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (26): 11657–8. Bibcode : 2010PNAS..10711657P . DOI : 10.1073 / pnas.1006364107 . PMC 2900667 . PMID 20554917 .  
  55. ^ а б в Ци, Ипин; Пол, Джозеф В. (2016-07-01). «CRISPR / Cas9 для редактирования генома растений: достижения, проблемы и перспективы». Отчеты о растительных клетках . 35 (7): 1417–1427. DOI : 10.1007 / s00299-016-1985-Z . ISSN 1432-203X . PMID 27114166 . S2CID 8035222 .   
  56. ^ a b c Кэрролл D (ноябрь 2008 г.). «Успехи и перспективы: нуклеазы цинковых пальцев как средства генной терапии» . Генная терапия . 15 (22): 1463–8. DOI : 10.1038 / gt.2008.145 . PMC 2747807 . PMID 18784746 .  
  57. ^ Поллак, Эндрю (2015-11-05). «Клеточная терапия, не опробованная на людях, спасает ребенка от рака» . Нью-Йорк Таймс . ISSN 0362-4331 . Проверено 30 ноября 2015 . 
  58. ^ Couzin-Френкель, Дженнифер (2015). «Журнал Science: лейкемия у детей отступает после новой клеточной терапии». Наука . 350 (6262): 731. DOI : 10.1126 / science.350.6262.731 . PMID 26564829 . 
  59. ^ Mentis AF (декабрь 2016 г.). «Эпигеномная инженерия синдрома Дауна». Неврология и биоповеденческие обзоры . 71 : 323–327. DOI : 10.1016 / j.neubiorev.2016.09.012 . PMID 27646312 . S2CID 24192441 .  
  60. ↑ Маркионе, Мэрилин (7 февраля 2019 г.). «Испытания предполагают ученые достигли 1 - го„в теле“редактирования генов» . AP News . Проверено 7 февраля 2019 .
  61. ^ Персонал (2 февраля 2019 г.). «Изучение возрастающей дозы редактирования генома с помощью нуклеазы цинкового пальца (ZFN), терапевтической SB-913 у субъектов с MPS II» . ClinicalTrials.gov . Национальная медицинская библиотека США . Проверено 7 февраля 2019 .
  62. ^ Хаммонд А, Galizi R, Киру К, Симони А, Синискальчи С, D Katsanos, Гриббл М, Бейкер Д, Е Marois, Рассел S, Берт А, Windbichler Н, Кризанти А, Т Нолан (январь 2016). «Система привода генов CRISPR-Cas9, нацеленная на размножение самок в переносчике малярийных комаров Anopheles gambiae» . Nat. Biotechnol . 34 (1): 78–83. DOI : 10.1038 / nbt.3439 . PMC 4913862 . PMID 26641531 .  
  63. ^ Флетчер, Мартин (2018-08-11). «Комары-мутанты: может ли редактирование генов убить малярию?» . Телеграф . ISSN 0307-1235 . Проверено 12 августа 2018 . 
  64. ↑ Бегли, Шарон (28 ноября 2018 г.). «На фоне шумихи китайский ученый защищает создание генно-отредактированных младенцев - STAT» . СТАТ .
  65. ^ Science China Press (23 января 2019 г.). «Обезьяны с генетически отредактированными болезнями, клонированные в Китае» . EurekAlert! . Проверено 24 января 2019 .
  66. ^ Мандельбаума, Райан Ф. (23 января 2019). «Последний эксперимент Китая с клонированной обезьяной - этический беспорядок» . Gizmodo . Проверено 24 января 2019 .
  67. ^ «ВОЗ запускает глобальный реестр редактирования генома человека». PharmaBiz, 31 августа 2019 г. Gale General OneFile, по состоянию на 27 апреля 2020 г.
  68. ↑ Im W, Moon J, Kim M (сентябрь 2016 г.). «Применение CRISPR / Cas9 для редактирования генов при наследственных двигательных расстройствах» . Журнал двигательных расстройств . 9 (3): 136–43. DOI : 10,14802 / jmd.16029 . PMC 5035944 . PMID 27667185 .  
  69. ^ a b Hsu PD, Lander ES, Zhang F (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии» . Cell . 157 (6): 1262–78. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.05.010 . PMC 4343198 . PMID 24906146 .  
  70. ^ Джонсон, JA; Altwegg, R .; Эванс, DM; Ewen, JG; Гордон, Эй Джей; Петторелли, Н .; Янг, JK (2016-04-01). «Есть ли будущее у технологий редактирования генома в области сохранения?» . Сохранение животных . 19 (2): 97–101. DOI : 10.1111 / acv.12273 . ISSN 1469-1795 . 
  71. ^ Перлман, Алекс (2015-12-03). «Генетики обеспокоены, что трансгуманисты будут использовать CRISPR на себе» . Вице-материнская плата . Проверено 26 декабря +2016 .
  72. ^ Йоргенсен Э. "Как DIY-биохакеры меняют разговор о генной инженерии" . Вашингтон Пост . Проверено 26 декабря +2016 .
  73. ^ «Улучшение человека» . Pew Research Center. 2016-07-26 . Проверено 26 декабря +2016 .
  74. ^ Регаладо А. "Создание идеального ребенка" . Обзор технологий MIT . Проверено 26 декабря +2016 .
  75. ^ a b Образец, Ян (30 сентября 2016 г.). «Эксперты предупреждают, что домашние наборы для редактирования генов представляют опасность для общества» . Хранитель . Проверено 26 декабря +2016 .
  76. ^ a b c d "Редактирование генома: этический обзор" (PDF) . Совет Наффилда по биоэтике. Сентябрь 2016 . Проверено 27 декабря +2016 .
  77. ^ Harmon A (2017-02-14). «Редактирование генов человека получает поддержку научной группы» . Нью-Йорк Таймс . ISSN 0362-4331 . Проверено 17 февраля 2017 . 
  78. ^ "Ученые ОК генетической инженерии младенцев" . New York Post . Рейтер. 2017-02-14 . Проверено 17 февраля 2017 .
  79. ^ Клаппер JR (9 февраля 2016 г.). «Всемирная оценка угроз разведывательного сообщества США» (PDF) . Проверено 26 декабря +2016 .
  80. ^ Warmflash D (06.09.2016). «Редактирование генома: угроза национальной безопасности?» . Проверено 26 декабря +2016 .
  81. ^ a b Регаладо А. "Главный представитель разведки США называет Джина редактированием угрозы ОМП" . Обзор технологий MIT . Проверено 26 декабря +2016 .
  82. ^ Джексон, R; Рамшоу, я (январь 2010 г.). «Опыт мышиной оспы. Интервью с Рональдом Джексоном и Яном Рэмшоу об исследованиях двойного назначения. Интервью Майкла Дж. Селгелида и Лорны Вейр» . EMBO Reports . 11 (1): 18–24. DOI : 10.1038 / embor.2009.270 . PMC 2816623 . PMID 20010799 .  
  83. ↑ Broad WJ (23 января 2001 г.). «Австралийцы создают смертельный мышиный вирус» . Нью-Йорк Таймс . Проверено 27 декабря +2016 .
  84. Перейти ↑ Radford T (10 января 2001). «Лаборатория случайно создает вирус-убийцу» . Хранитель . Проверено 27 декабря +2016 .

«ВОЗ запускает глобальный реестр редактирования генома человека». PharmaBiz, 31 августа 2019 г. Gale General OneFile, по состоянию на 27 апреля 2020 г.

Дальнейшее чтение [ править ]

  • «Специальный выпуск о редактировании зародышевой линии человека» . Биоэтика . 34 . 2020.
  • «Индивидуальные гены человека: новые обещания и опасности» . Scientific American . Проверено 21 февраля 2019 .
  • Коннор, Стив (25 апреля 2014 г.). «Научный раскол - прорыв в геноме человека, разделяющий бывших коллег» . Независимый . Проверено 11 февраля 2016 .
  • "Что такое редактирование генома?" . yourgenome.org . Проверено 13 апреля 2018 .