Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Часть серии по
Генная инженерия
Генная инженерия logo.png
 
Генетически модифицированные организмы
История и регулирование
Процесс
Приложения
Споры

Генная инженерия может быть выполнена с использованием нескольких методов. Перед созданием генетически модифицированного организма (ГМО) необходимо выполнить ряд шагов . Генные инженеры должны сначала выбрать, какой ген они хотят вставить, изменить или удалить. Затем ген необходимо выделить и включить вместе с другими генетическими элементами в подходящий вектор . Затем этот вектор используется для вставки гена в геном хозяина, создавая трансгенный или измененный организм. Возможность генетической инженерии организмов основана на многолетних исследованиях и открытиях того, как функционируют гены и как мы можем ими манипулировать. Важные достижения включают открытие рестрикционных ферментов и ДНК-лигаз.и развитие полимеразной цепной реакции и секвенирования .

Это позволило выделить интересующий ген и затем включить его в вектор. Часто добавляли промоторную и терминаторную области, а также ген селектируемого маркера . На этом этапе ген может быть модифицирован для более эффективной его экспрессии . Затем этот вектор вставляется в геном организма-хозяина . У животных ген обычно вставляют в эмбриональные стволовые клетки , тогда как у растений он может быть вставлен в любую ткань, которая может быть выращена в полностью развитом растении. Общие методы включают микроинъекции , вирус-опосредованный , Agrobacterium опосредованногоили биолистика . На полученном организме проводятся дальнейшие тесты, чтобы гарантировать стабильную интеграцию, наследование и экспрессию. Потомки первого поколения гетерозиготны , что требует их инбредности для создания гомозиготного паттерна, необходимого для стабильного наследования. Гомозиготность должна быть подтверждена на образцах второго поколения.

Традиционные методы случайным образом вставляли гены в геном хозяина. Достижения позволили вставлять гены в определенные места в геноме, что снижает нежелательные побочные эффекты случайной вставки. Ранние системы нацеливания основывались на мегануклеазах и нуклеазах цинковых пальцев . С 2009 года были разработаны более точные и простые в реализации системы. Наиболее часто используются эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), и система Cas9-guideRNA (адаптированная из CRISPR ). Они потенциально могут быть полезны в генной терапии и других процедурах, требующих точного или высокопроизводительного нацеливания.

История [ править ]

Смотрите также: История генной инженерии

Множество различных открытий и достижений привели к развитию генной инженерии . Управляемые человеком генетические манипуляции начались с одомашнивания растений и животных посредством искусственного отбора примерно в 12000 году до нашей эры. [1] : 1 Были разработаны различные методы, помогающие в разведении и селекции. Гибридизация была одним из способов внесения быстрых изменений в генетический состав организма. Гибридизация сельскохозяйственных культур, скорее всего, впервые произошла, когда люди начали выращивать генетически различных особей родственных видов в непосредственной близости. [2] : 32 Некоторые растения можно было размножить путем вегетативного клонирования .[2] : 31

Генетическая наследственность была впервые обнаружена Грегором Менделем в 1865 году после экспериментов по скрещиванию гороха. [3] В 1928 году Фредерик Гриффит доказал существование «трансформирующего принципа», вовлеченного в наследование, которое в 1944 году было идентифицировано как ДНК Освальдом Эйвери, Колином Маклаудом и Маклином Маккарти . Фредерик Сэнгер разработал метод секвенирования ДНК в 1977 году, значительно увеличив генетическую информацию, доступную исследователям.

После открытия существования и свойств ДНК пришлось разработать инструменты, позволяющие манипулировать ею. В 1970 году лаборатория Гамильтона Смита открыла рестрикционные ферменты , позволяющие ученым выделять гены из генома организма. [4] ДНК-лигазы , которые соединяют разорванную ДНК вместе, были открыты ранее в 1967 году. [5] Благодаря объединению двух ферментов стало возможным «вырезать и вставить» последовательности ДНК для создания рекомбинантной ДНК . Плазмиды , открытые в 1952 г. [6], стали важными инструментами для передачи информации между клетками и репликации последовательностей ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), разработанная Кэри Муллис в 1983 году, позволила амплифицировать (реплицировать) небольшие участки ДНК и способствовала идентификации и выделению генетического материала.

Помимо манипулирования ДНК, необходимо было разработать методы ее внедрения в геном организма. Эксперимент Гриффита уже показал, что некоторые бактерии обладают способностью естественным образом поглощать и экспрессировать чужеродную ДНК . Искусственная компетентность была вызвана у Escherichia coli в 1970 году путем обработки их раствором хлорида кальция (CaCl 2 ). [7] Трансформация с использованием электропорации была разработана в конце 1980-х годов, что повысило эффективность и бактериальный диапазон. [8] В 1907 г. бактерия, вызывающая опухоли растений, Agrobacterium tumefaciens., был обнаружен. В начале 1970-х было обнаружено, что эти бактерии вставляли свою ДНК в растения с помощью плазмиды Ti . [9] Удалив в плазмиде гены, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям вставить выбранную ими ДНК в геномы растений. [10]

Выбор целевых генов [ править ]

Первым шагом является определение целевого гена или генов для вставки в организм-хозяин. Этим движет цель для результирующего организма. В некоторых случаях поражается только один или два гена. Для более сложных задач могут быть задействованы целые биосинтетические пути с участием нескольких генов. Найденные гены и другая генетическая информация от широкого круга организмов может быть вставлена ​​в бактерии для хранения и модификации, создавая при этом генетически модифицированные бактерии . Бактерии дешевы, легко выращиваются, клонируются , быстро размножаются, относительно легко трансформируются и могут храниться при -80 ° C почти неограниченное время. Как только ген выделен, он может храниться внутри бактерий, обеспечивая неограниченный запас для исследований. [11]

Генетический скрининг может быть проведен для определения потенциальных генов с последующим проведением других тестов для определения лучших кандидатов. Простой экран включает случайную мутацию ДНК с помощью химикатов или радиации, а затем выбор тех, которые отображают желаемый признак. Для организмов, в которых мутация нецелесообразна, ученые вместо этого ищут людей среди населения, которые обладают характеристиками через естественные мутации. Процессы, которые смотрят на фенотип, а затем пытаются идентифицировать ответственный ген, называются прямой генетикой . Затем ген необходимо картировать , сравнивая наследование фенотипа с известными генетическими маркерами.. Близкие гены, скорее всего, наследуются вместе. [12]

Другой вариант - обратная генетика . Этот подход включает нацеливание на конкретный ген с мутацией и последующее наблюдение за тем, какой фенотип развивается. [12] Мутация может быть разработана так, чтобы инактивировать ген или позволить ему стать активным только при определенных условиях. Условные мутации полезны для идентификации генов, которые обычно являются летальными, если не работают. [13] Поскольку гены со схожими функциями имеют сходные последовательности ( гомологичные ), можно предсказать вероятную функцию гена, сравнив его последовательность с последовательностью хорошо изученных генов модельных организмов . [12] Разработка микроматриц ,транскриптомы и секвенирование генома значительно упростили поиск нужных генов. [14]

Бактерия Bacillus thuringiensis была впервые обнаружена в 1901 году как возбудитель гибели тутовых шелкопрядов . Благодаря этим инсектицидным свойствам бактерии использовались в качестве биологического инсектицида , коммерчески разработанного в 1938 году. Cry-белки были обнаружены для обеспечения инсектицидной активности в 1956 году, и к 1980-м годам ученые успешно клонировали ген, кодирующий этот белок, и экспрессировали его. это в растениях. [15] Ген, обеспечивающий устойчивость к гербициду глифосату, был обнаружен после семи лет поисков у бактерий, обитающих в выпускной трубе производственного предприятия Monsanto RoundUp . [16]У животных большинство используемых генов - это гены гормона роста . [17]

Генная манипуляция [ править ]

Все процессы генной инженерии включают модификацию ДНК. Традиционно ДНК выделяли из клеток организмов. Позже гены стали клонировать из сегмента ДНК после создания библиотеки ДНК или искусственно синтезировать . После выделения к гену добавляются дополнительные генетические элементы, позволяющие ему экспрессироваться в организме-хозяине и способствовать отбору.

Извлечение из ячеек [ править ]

Основная статья: извлечение ДНК

Сначала клетку нужно осторожно открыть , обнажая ДНК, не нанося ей слишком большого вреда. Используемые методы различаются в зависимости от типа ячейки. После открытия ДНК необходимо отделить от других клеточных компонентов. Разорванная клетка содержит белки и другие клеточные остатки. Путем смешивания с фенолом и / или хлороформом с последующим центрифугированием нуклеиновые кислоты могут быть отделены от этого дебриса в верхнюю водную фазу . Эта водная фаза может быть удалена и при необходимости очищена путем повторения стадий фенол-хлороформ. Затем нуклеиновые кислоты могут быть осаждены из водного раствора с использованием этанола или изопропанола . Любая РНКможно удалить, добавив рибонуклеазу, которая его расщепит. Многие компании сейчас продают комплекты, упрощающие этот процесс. [18]

Изоляция гена [ править ]

Интересующий ген необходимо отделить от экстрагированной ДНК. Если последовательность неизвестна, распространенным методом является разбиение ДНК методом случайного расщепления. Обычно это достигается с помощью рестрикционных ферментов (ферментов, разрезающих ДНК). Частичный рестрикционный гидролизат вырезает только некоторые из рестрикционных сайтов, в результате чего сегменты фрагментов ДНК перекрываются. Фрагменты ДНК помещают в отдельные плазмидные векторы и выращивают внутри бактерий. Попав в бактерии, плазмида копируется по мере деления бактерий . Чтобы определить, присутствует ли полезный ген в конкретном фрагменте, библиотека ДНК проверяется на желаемый фенотип.. Если фенотип обнаружен, возможно, бактерия содержит целевой ген.

Если ген не имеет поддающегося обнаружению фенотипа или библиотека ДНК не содержит правильный ген, необходимо использовать другие методы для его выделения. Если положение гена можно определить с помощью молекулярных маркеров, то ходьба по хромосоме - это один из способов выделить правильный фрагмент ДНК. Если ген проявляет близкую гомологию с известным геном у другого вида, то его можно выделить путем поиска генов в библиотеке, которые близко соответствуют известному гену. [19]

Для известных последовательностей ДНК можно использовать рестрикционные ферменты, которые разрезают ДНК по обе стороны от гена. Затем с помощью гель-электрофореза фрагменты сортируются по длине. [20] Некоторые гели могут разделять последовательности, которые отличаются одной парой оснований . ДНК можно визуализировать, окрашивая ее бромистым этидием и фотографируя в УФ-свете . Маркер с фрагментами известных длинами может быть установлен вместе с ДНК , чтобы оценить размер каждой полосы. Полоса ДНК правильного размера должна содержать ген, который можно вырезать из геля. [18] : 40–41 Другой метод выделения генов с известными последовательностями включаетполимеразная цепная реакция (ПЦР). [21] ПЦР - мощный инструмент, с помощью которого можно амплифицировать заданную последовательность, которую затем можно выделить с помощью гель-электрофореза. Его эффективность снижается с более крупными генами и может вносить ошибки в последовательность.

Можно искусственно синтезировать гены . [22] Некоторые синтетические последовательности коммерчески доступны, и многие из этих ранних этапов не используются. [23]

Модификация [ править ]

Вставляемый ген должен быть объединен с другими генетическими элементами, чтобы он работал должным образом. На этом этапе ген можно модифицировать для лучшей экспрессии или эффективности. Помимо вставляемого гена, большинство конструкций содержат область промотора и терминатора, а также ген селектируемого маркера . Область промотора инициирует транскрипцию гена и может использоваться для контроля местоположения и уровня экспрессии гена, в то время как область терминатора завершает транскрипцию. Селективный маркер, который в большинстве случаев придает устойчивость к антибиотикам организму, в котором он экспрессируется, используется для определения того, какие клетки трансформируются новым геном. Конструкции выполнены с использованиемметоды рекомбинантной ДНК , такие как рестрикционные переваривания , лигирование и молекулярное клонирование . [24]

Вставка ДНК в геном хозяина [ править ]

Основная статья: Доставка генов

После того, как ген сконструирован, он должен быть стабильно интегрирован в геном целевых организмов или существовать как внехромосомная ДНК . Существует ряд методов, доступных для встраивания гена в геном хозяина, и они различаются в зависимости от типа организма-мишени. У многоклеточных эукариот , если трансген включен в клетки зародышевой линии хозяина , полученная клетка-хозяин может передать трансген своему потомству . Если трансген включен в соматические клетки, трансген не может быть унаследован. [25]

Трансформация [ править ]

Основная статья: Трансформация (генетика)
Бактериальная трансформация включает перемещение гена от одной бактерии к другой. Он интегрирован в плазмиду реципиента. и затем может быть выражен новым хостом.

Трансформация - это прямое изменение генетических компонентов клетки путем прохождения генетического материала через клеточную мембрану . Около 1% бактерий естественным образом способны поглощать чужеродную ДНК , но эта способность может быть вызвана у других бактерий. [26] Воздействие на бактерии тепловым шоком или электропорацией может сделать клеточную мембрану проницаемой для ДНК, которая затем может быть включена в геном или существовать в виде внехромосомной ДНК. Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция) в холодных условиях, до воздействия теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяин. Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентных катионов в холодных условиях может изменить или ослабить структуру поверхности клетки, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс на клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку. Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки подвергаются кратковременному сотрясению электрическим полем 10-20 кВ./ см, что, как считается, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникать плазмидная ДНК. После электрического шока отверстия быстро закрываются механизмами восстановления мембраны клетки. Полученная ДНК может либо интегрироваться с геномом бактерий, либо, что более часто, существовать как внехромосомная ДНК .

Генная пушка использует биолистику для вставки ДНК в растительную ткань
A. tumefaciens прикрепляется к клетке моркови

В растениях ДНК часто вставляются с помощью Agrobacterium , -опосредованной рекомбинации , [27] воспользовавшись Agrobacterium сек Т-ДНК последовательности , что позволяет естественное введение генетического материала в клетки растений. [28] Растительную ткань разрезают на мелкие кусочки и замачивают в жидкости, содержащей суспендированные агробактерии . Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным порезами. Бактерии используют конъюгацию для передачи сегмента ДНК, называемого Т-ДНК.из его плазмиды в растение. Перенесенная ДНК направляется в ядро ​​растительной клетки и интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина. Плазмидная Т-ДНК интегрируется полуслучайно в геном клетки-хозяина. [29]

Модифицируя плазмиду для экспрессии интересующего гена, исследователи могут стабильно встраивать выбранный ген в геном растения. Единственными существенными частями Т-ДНК являются ее два небольших (25 пар оснований) граничных повторов, по крайней мере один из которых необходим для трансформации растений. [30] [31] Гены, которые необходимо ввести в растение, клонируют в вектор трансформации растений, который содержит область Т-ДНК плазмиды . Альтернативный метод - агроинфильтрация . [32] [33]

Другой метод, используемый для трансформации растительных клеток, - это биолистика , когда частицы золота или вольфрама покрываются ДНК, а затем вводятся в молодые клетки растений или зародыши растений. [34] Некоторый генетический материал проникает в клетки и трансформирует их. Этот метод можно использовать на растениях, которые не восприимчивы к инфекции Agrobacterium, а также позволяет трансформировать пластиды растений . Клетки растений также можно трансформировать с помощью электропорации, при которой используется электрический шок, чтобы сделать клеточную мембрану проницаемой для плазмидной ДНК. Из-за повреждения клеток и ДНК эффективность трансформации биолистики и электропорации ниже, чем агробактериальной трансформации. [ необходима цитата ]

Трансфекция [ править ]

Основная статья: Трансфекция

Трансформация имеет другое значение по отношению к животным, указывая на прогрессирование до ракового состояния, поэтому процесс, используемый для вставки чужеродной ДНК в клетки животных, обычно называется трансфекцией. [35] Есть много способов напрямую ввести ДНК в клетки животных in vitro . Часто эти клетки представляют собой стволовые клетки , которые используются для генной терапии . В химических методах используются природные или синтетические соединения для образования частиц, которые облегчают перенос генов в клетки. [36] Эти синтетические векторы обладают способностью связывать ДНК и приспосабливать большие генетические передачи. [37] Один из простейших методов предполагает использование фосфата кальция. чтобы связать ДНК и затем подвергнуть ее культивированию клеток. Раствор вместе с ДНК инкапсулируется клетками. [38] Липосомы и полимеры можно использовать в качестве векторов для доставки ДНК в культивируемые клетки животных. Положительно заряженные липосомы связываются с ДНК, в то время как полимеры могут взаимодействовать с ДНК. [36] Они образуют липоплексы и полиплексы соответственно, которые затем захватываются клетками. Другие методы включают использование электропорации и биолистики. [39] В некоторых случаях трансфицированные клетки могут стабильно интегрировать внешнюю ДНК в свой собственный геном, этот процесс известен как стабильная трансфекция . [40]

Чтобы создать трансгенных животных, ДНК необходимо вставить в жизнеспособные эмбрионы или яйца. Обычно это достигается с помощью микроинъекции , когда ДНК вводится через ядерную оболочку клетки непосредственно в ядро . [26] Суперовулированные оплодотворенные яйца собирают на стадии отдельных клеток и культивируют in vitro . Когда пронуклеусы головки сперматозоида и яйцеклетки видны сквозь протоплазму, генетический материал вводится в один из них. Ооцит затем имплантируют в яйцеводе о наличии псевдобеременного животного. [41]Другой метод - это перенос генов, опосредованный эмбриональными стволовыми клетками. Ген трансфицируется в эмбриональные стволовые клетки, а затем они вставляются в бластоцисты мыши , которые затем имплантируются приемным матерям. Полученное потомство является химерным , и дальнейшее спаривание может дать мышей, полностью трансгенных по интересующему гену. [42]

Трансдукция [ править ]

Основная статья: Трансдукция (генетика)

Трансдукция - это процесс, при котором чужеродная ДНК вводится в клетку вирусом или вирусным вектором . [43] Генетически модифицированные вирусы можно использовать в качестве вирусных векторов для переноса генов-мишеней в другой организм в генной терапии . [44] Сначала из вируса удаляются вирулентные гены и вместо них вставляются гены-мишени. Последовательности, которые позволяют вирусу вставлять гены в организм-хозяин, должны оставаться нетронутыми. Популярные вирусные векторы разработаны из ретровирусов или аденовирусов . Другие вирусы, используемые в качестве переносчиков, включают лентивирусы , вирусы оспы.и вирусы герпеса . Тип используемого вируса будет зависеть от клеток-мишеней и от того, нужно ли изменять ДНК навсегда или временно.

Регенерация [ править ]

Поскольку часто генетическим материалом трансформируется только одна клетка, организм необходимо регенерировать из этой единственной клетки. У растений это достигается за счет использования культуры тканей . [45] [46] У каждого вида растений разные требования для успешной регенерации. В случае успеха методика дает взрослое растение, которое содержит трансген в каждой клетке. [47] У животных необходимо убедиться, что встроенная ДНК присутствует в эмбриональных стволовых клетках . [27] Потомство можно проверить на наличие гена. Все потомки первого поколения гетерозиготны по вставленному гену и должны быть инбредными для получениягомозиготный экземпляр. [ необходима цитата ] Бактерии состоят из одной клетки и размножаются клонально, поэтому в регенерации нет необходимости. Селективные маркеры используются для легкой дифференциации трансформированных клеток от нетрансформированных.

Клетки, которые были успешно трансформированы ДНК, содержат маркерный ген, а клетки, не трансформированные, не содержат. Выращивая клетки в присутствии антибиотика или химического вещества, которое выбирает или маркирует клетки, экспрессирующие этот ген, можно отделить модифицированные клетки от немодифицированных. Другой метод скрининга включает зонд ДНК, который прикрепляется только к вставленному гену. Эти маркеры обычно присутствуют в трансгенном организме, хотя был разработан ряд стратегий, позволяющих удалить селектируемый маркер из зрелого трансгенного растения. [48]

Подтверждение [ править ]

Обнаружения того, что рекомбинантный организм содержит встроенные гены, обычно недостаточно, чтобы гарантировать, что они будут надлежащим образом экспрессироваться в намеченных тканях. Дальнейшее тестирование с использованием ПЦР, гибридизации по Саузерну и секвенирования ДНК проводится для подтверждения того, что организм содержит новый ген. [49] Эти тесты также могут подтвердить хромосомное местоположение и количество копий встроенного гена. После подтверждения методы, которые ищут и измеряют продукты генов (РНК и белок), также используются для оценки экспрессии генов, транскрипции, паттернов обработки РНК, а также экспрессии и локализации белковых продуктов. К ним относятся Нозерн-гибридизация , количественная ОТ-ПЦР , Вестерн-блоттинг ,иммунофлуоресценция , ELISA и фенотипический анализ. [50] При необходимости, потомство организма изучается, чтобы подтвердить, что трансген и связанный с ним фенотип стабильно наследуются.

Нацеливание на внедрение генов [ править ]

Основные статьи: Нацеливание на гены и редактирование генома

Традиционные методы генной инженерии обычно случайным образом вставляют новый генетический материал в геном хозяина. Это может нарушить или изменить другие гены в организме. Были разработаны методы, позволяющие вставлять новый генетический материал в определенные участки генома организма. Ранние методы, нацеленные на определенные участки генома, основывались на гомологичной рекомбинации . [51] Создавая конструкции ДНК, которые содержат матрицу, которая соответствует целевой последовательности генома, возможно, что процессы HR в клетке вставят конструкцию в желаемое место. Использование этого метода на эмбриональных стволовых клетках привело к созданию трансгенных мышей с целевым нокаутом.. Также было возможно « сбивать» гены или изменять паттерны экспрессии генов . [52]

Если жизненно важный ген не работает, он может оказаться смертельным для организма. Для изучения функции этих генов использовали сайт-специфические рекомбиназы (SSR). Двумя наиболее распространенными типами являются системы Cre-LoxP и Flp-FRT . Cre-рекомбиназа - это фермент, который удаляет ДНК путем гомологичной рекомбинации между связывающими последовательностями, известными как сайты Lox-P. Система Flip-FRT работает аналогичным образом: рекомбиназа Flip распознает последовательности FRT. Путем скрещивания организма, содержащего сайты рекомбиназы, фланкирующие интересующий ген, с организмом, который экспрессирует SSR под контролем тканеспецифических промоторов, возможно выключить или включить гены только в определенных клетках. Это также использовалось для удаления маркерных генов у трансгенных животных. Дальнейшие модификации этих систем позволили исследователям вызвать рекомбинацию только при определенных условиях, что позволило генам быть выключенными или экспрессироваться в желаемое время или на желаемых стадиях развития . [52]

При редактировании генома используются искусственно созданные нуклеазы, которые создают определенные двухцепочечные разрывы в желаемых местах генома. Разрывы подвергаются процессам репарации клеточной ДНК, которые можно использовать для целевого нокаута, коррекции или вставки гена на высоких частотах. Если присутствует донорская ДНК, содержащая соответствующую последовательность (гомологии), то новый генетический материал, содержащий трансген, будет интегрирован в целевой сайт с высокой эффективностью путем гомологичной рекомбинации . [53] Существует четыре семейства сконструированных нуклеаз: мегануклеазы , [54] [55] ZFN , [56] [57] активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Тально), [58] [59] т он CRISPR / Cas (кластерному регулярна interspaced короткого палиндромного повтор / CRISPRassociated белка (например , CRISPR / cas9) . [60] [61] Среди четыре типов, Тальны и CRISPR / Cas являются двумя наиболее часто используемыми. [62] Последние достижения направлены на объединение нескольких систем для использования лучших свойств обеих (например, MegaTAL, который представляет собой слияние ДНК-связывающего домена TALE и мегануклеазы). [63] Недавние исследования также были сосредоточены на разработке стратегий для создания нокаута или исправлений генов без создания двухцепочечных разрывов (базовые редакторы). [62]

Мегануклеазы и нуклеазы цинковых пальцев [ править ]

Мегануклеазы впервые были использованы в 1988 г. в клетках млекопитающих. [64] Мегануклеазы - это эндодезоксирибонуклеазы, которые действуют как рестрикционные ферменты с длинными сайтами узнавания, что делает их более специфичными для своего целевого сайта, чем другие рестрикционные ферменты . Это увеличивает их специфичность и снижает их токсичность, поскольку они не нацелены на такое большое количество сайтов в геноме. Наиболее изученными мегануклеазами являются семейство LAGLIDADG . Хотя мегануклеазы по-прежнему весьма восприимчивы к связыванию вне мишени, что делает их менее привлекательными, чем другие инструменты редактирования генов, их меньший размер по-прежнему делает их привлекательными, особенно с точки зрения вирусной векторизации. [65] [53]

Нуклеазы "цинковые пальцы" (ZFN), впервые использованные в 1996 г., обычно создаются путем слияния доменов "цинковые пальцы" и домена нуклеазы Fok I. Таким образом, ZFN обладают способностью расщеплять ДНК в сайтах-мишенях. [53] Конструируя домен цинкового пальца для нацеливания на конкретный сайт в геноме, можно редактировать геномную последовательность в желаемом месте . [65] [66] [53] ZFN обладают большей специфичностью, но все же обладают потенциалом связываться с неспецифическими последовательностями. Хотя определенное количество расщеплений вне мишени приемлемо для создания трансгенных модельных организмов, они могут не подходить для этого. оптимален для всех видов генной терапии человека. [65]

ТАЛЕН и CRISPR [ править ]

Доступ к коду, управляющему распознаванием ДНК эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALE), в 2009 году открыл путь к разработке нового класса эффективных инструментов редактирования генов на основе TAL. TALE, белки, секретируемые патогеном растений Xanthomonas, с большой специфичностью связываются с генами в растении-хозяине и инициируют транскрипцию генов, способствующих инфицированию. Инженерная TALE путем слияния ДНК-связывающего ядра с каталитическим доменом нуклеазы Fok I позволила создать новый инструмент дизайнерских нуклеаз - нуклеазу TALE (TALEN). [67]Они обладают одной из важнейших особенностей всех современных сконструированных нуклеаз. Из-за наличия повторяющихся последовательностей их трудно сконструировать с помощью стандартной процедуры молекулярной биологии и полагаться на более сложный метод, такой как клонирование по Золотым воротам . [62]

В 2011 году была разработана еще одна крупная революционная технология, основанная на системах CRISPR / Cas (сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы / белок, ассоциированный с CRISPR), которые функционируют как адаптивная иммунная система у бактерий и архей . Система CRISPR / Cas позволяет бактериям и архее бороться с вторгающимися вирусами, расщепляя вирусную ДНК и вставляя части этой ДНК в свой собственный геном. Затем организм транскрибирует эту ДНК в РНК и объединяет эту РНК с Cas9.белки, чтобы сделать двухцепочечные разрывы во вторгающейся вирусной ДНК. РНК служит в качестве направляющей РНК, чтобы направить фермент Cas9 в нужное место в ДНК вируса. Спаривая белки Cas с разработанной направляющей РНК, CRISPR / Cas9 можно использовать для индукции двухцепочечных разрывов в определенных точках в последовательностях ДНК. Разрыв восстанавливается ферментами репарации клеточной ДНК, создавая в большинстве случаев небольшую мутацию типа вставки / удаления. Нацеленная репарация ДНК возможна путем предоставления донорской ДНК-матрицы, которая представляет желаемое изменение и которая (иногда) используется для репарации двухцепочечных разрывов путем гомологичной рекомбинации. Позже было продемонстрировано, что CRISPR / Cas9 может редактировать человеческие клетки в чашке. Хотя раннему поколению не хватает специфики TALEN, основным преимуществом этой технологии является простота конструкции.Он также позволяет одновременно использовать несколько сайтов, позволяя редактировать сразу несколько генов.CRISPR / Cpf1 - это недавно обнаруженная система, которая требует другой направляющей РНК для создания определенных двухцепочечных разрывов (оставляет выступы при расщеплении ДНК) по сравнению с CRISPR / Cas9. [62]

CRISPR / Cas9 эффективен при разрушении генов. Создание ВИЧ-устойчивых младенцев китайским исследователем Хэ Цзянькуй, пожалуй, самый известный пример нарушения генов с помощью этого метода. [68] Он гораздо менее эффективен при генной коррекции. Методы редактирования оснований находятся в стадии разработки, в которых эндонуклеаза Cas 9 или родственный фермент используется для нацеливания на гены, в то время как связанный фермент дезаминаза производит целенаправленное изменение основания в ДНК. [69]Самая последняя доработка CRISPR-Cas9 называется Prime Editing. Этот метод связывает обратную транскриптазу с инженерной нуклеазой, управляемой РНК, которая делает только одноцепочечные разрезы, но не двухцепочечные разрывы. Он заменяет участок ДНК рядом с разрезом за счет последовательного действия нуклеазы и обратной транскриптазы, внося желаемое изменение из матрицы РНК. [70]

См. Также [ править ]

  • Список программного обеспечения для генной инженерии : программное обеспечение для кодирования генетических модификаций
  • Мутагенез (метод молекулярной биологии)

Ссылки [ править ]

  1. ^ Корень C (2007). Приручение . Издательские группы Гринвуд. ISBN 9780313339875.
  2. ^ a b Kingsbury N (15 октября 2009 г.). Гибрид: история и наука селекции растений . Издательство Чикагского университета. ISBN 978-0-226-43705-7.
  3. ^ Hartl DL, Орловский V (июнь 1992 г.). "Что, по мнению Грегора Менделя, он обнаружил?" . Генетика . 131 (2): 245–53. PMC 1205000 . PMID 1644269 .  
  4. ^ Робертс RJ (апрель 2005). «Как рестрикционные ферменты стали рабочими лошадками молекулярной биологии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (17): 5905–8. Bibcode : 2005PNAS..102.5905R . DOI : 10.1073 / pnas.0500923102 . PMC 1087929 . PMID 15840723 .  
  5. ↑ Weiss B, Richardson CC (апрель 1967). «Ферментативный разрыв и присоединение дезоксирибонуклеиновой кислоты, I. Ремонт однонитевых разрывов в ДНК с помощью ферментной системы из Escherichia coli, инфицированной бактериофагом Т4» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 57 (4): 1021–8. Bibcode : 1967PNAS ... 57.1021W . DOI : 10.1073 / pnas.57.4.1021 . PMC 224649 . PMID 5340583 .  
  6. ^ Ледерберг J (октябрь 1952 г.). «Клеточная генетика и наследственный симбиоз». Физиологические обзоры . 32 (4): 403–30. CiteSeerX 10.1.1.458.985 . DOI : 10.1152 / Physrev.1952.32.4.403 . PMID 13003535 .  
  7. Перейти ↑ Mandel M, Higa A (октябрь 1970 г.). «Кальций-зависимая ДНК-инфекция бактериофага». Журнал молекулярной биологии . 53 (1): 159–62. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (70) 90051-3 . PMID 4922220 . 
  8. ^ Wirth R, Friesenegger A, S Фидлер (март 1989). «Трансформация различных видов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к 11 различным родам, путем электропорации». Молекулярная и общая генетика . 216 (1): 175–7. DOI : 10.1007 / BF00332248 . PMID 2659971 . 
  9. ^ Нестер, Евгений. «Agrobacterium: естественный генетик (100 лет спустя)» . Архивировано из оригинального 19 октября 2012 года . Проверено 14 января 2011 года .
  10. ^ Zambryski Р, Йоос Н, Genetello С, Лееманс Дж, Монтэгу М.В., Schell J (1983). «Плазмидный вектор Ti для введения ДНК в клетки растений без изменения их нормальной способности к регенерации» . Журнал EMBO . 2 (12): 2143–50. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1983.tb01715.x . PMC 555426 . PMID 16453482 .  
  11. ^ «Повторное открытие биологии - онлайн-учебник: блок 13 генетически модифицированных организмов» . www.learner.org . Проверено 18 августа 2017 .
  12. ^ a b c Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2002). «Изучение экспрессии и функции генов» . Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Наука о гирляндах.
  13. ^ Гриффитс AJ, Miller JH, Suzuki DT, Левонтин RC, Gelbart WM (2000). «Мутантные типы» . Введение в генетический анализ (7-е изд.).
  14. ^ Ко Н, Kwon S, Томсон М (2015-08-26). Современные технологии в молекулярной селекции растений: Руководство по молекулярной селекции растений для исследователей . Springer. п. 242. ISBN. 9789401799966.
  15. ↑ Roh JY, Choi JY, Li MS, Jin BR, Je YH (апрель 2007 г.). «Bacillus thuringiensis как специфическое, безопасное и эффективное средство борьбы с насекомыми-вредителями». Журнал микробиологии и биотехнологии . 17 (4): 547–59. PMID 18051264 . 
  16. ^ Адлер J (май 2011). «Растущая угроза со стороны суперсорняков». Scientific American . 304 (5): 74–9. Bibcode : 2011SciAm.304e..74A . DOI : 10.1038 / Scientificamerican0511-74 . PMID 21595408 . 
  17. ^ Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций. «Процесс генетической модификации» .
  18. ^ a b Nicholl ST (29 мая 2008 г.). Введение в генную инженерию . Издательство Кембриджского университета. ISBN 978-1-139-47178-7.
  19. ↑ Michels CA (10 июня 2002 г.). Генетические методы для биологических исследований: подход тематического исследования . Джон Вили и сыновья. С. 85–88. ISBN 978-0-471-89919-8.
  20. ^ Альбертс B и др. (2002). «8» . Выделение, клонирование и секвенирование ДНК (4-е изд.). Нью-Йорк: Наука о гирляндах.
  21. Перейти ↑ Kaufman RI, Nixon BT (июль 1996 г.). «Использование ПЦР для выделения генов, кодирующих сигма54-зависимые активаторы из различных бактерий» . Журнал бактериологии . 178 (13): 3967–70. DOI : 10.1128 / jb.178.13.3967-3970.1996 . PMC 232662 . PMID 8682806 .  
  22. Перейти ↑ Liang J, Luo Y, Zhao H (2011). «Синтетическая биология: интеграция синтеза в биологию» . Междисциплинарные обзоры Wiley: системная биология и медицина . 3 (1): 7–20. DOI : 10.1002 / wsbm.104 . PMC 3057768 . PMID 21064036 .  
  23. ^ «Генетический синтез GeneArt» . www.thermofisher.com . Проверено 9 ноября 2017 .
  24. ^ Berg P, Mertz JE (январь 2010). «Личные размышления о происхождении и появлении технологии рекомбинантной ДНК» . Генетика . 184 (1): 9–17. DOI : 10.1534 / genetics.109.112144 . PMC 2815933 . PMID 20061565 .  
  25. ^ Nayerossadat N, Maedeh T, Ali PA (6 июля 2012). «Вирусные и невирусные системы доставки для доставки генов» . Передовые биомедицинские исследования . 1 : 27. DOI : 10,4103 / 2277-9175.98152 . PMC 3507026 . PMID 23210086 .  
  26. ^ a b Chen I, Dubnau D (март 2004 г.). «Поглощение ДНК при бактериальной трансформации». Обзоры природы. Микробиология . 2 (3): 241–9. DOI : 10.1038 / nrmicro844 . PMID 15083159 . 
  27. ^ a b Комитет Национального исследовательского совета (США) по выявлению и оценке непреднамеренного воздействия продуктов, полученных с помощью генной инженерии, на здоровье человека (2004-01-01). Методы и механизмы генетического манипулирования растениями, животными и микроорганизмами . Национальная академия прессы (США).
  28. ^ Gelvin SB (март 2003). «Опосредованная Agrobacterium трансформация растений: биология, лежащая в основе инструмента« генной борьбы » . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 67 (1): 16–37, содержание. DOI : 10.1128 / MMBR.67.1.16-37.2003 . PMC 150518 . PMID 12626681 .  
  29. ^ Фрэнсис KE, Спайкер S (февраль 2005). «Идентификация трансформантов Arabidopsis thaliana без отбора показывает высокую частоту замалчивания интеграций Т-ДНК» . Заводской журнал . 41 (3): 464–77. DOI : 10.1111 / j.1365-313x.2004.02312.x . PMID 15659104 . 
  30. Перейти ↑ Schell J, Van Montagu M (1977). «Ti-плазмида Agrobacterium Tumefaciens, естественный вектор для внедрения генов NIF в растения?». В Hollaender A, Burris RH, Day PR, Hardy RW, Helinski DR, Lamborg MR, Owens L, Valentine RC (ред.). Генная инженерия для фиксации азота . Основные науки о жизни. 9 . С. 159–79. DOI : 10.1007 / 978-1-4684-0880-5_12 . ISBN 978-1-4684-0882-9. PMID  336023 .
  31. ^ Йоос Н, Тиммерман В, Монтэг М.В., Schell J (1983). «Генетический анализ переноса и стабилизации ДНК Agrobacterium в растительных клетках» . Журнал EMBO . 2 (12): 2151–60. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1983.tb01716.x . PMC 555427 . PMID 16453483 .  
  32. ^ Томсон JA. "Генная инженерия растений" (PDF) . Биотехнология . 3 . Проверено 17 июля 2016 года .
  33. ^ Лейцингер К, Дент М, Хуртад J, J Станке, Лай Н, Чжоу Х, Чен Q (июль 2013 г. ). «Эффективная агроинфильтрация растений для высокоуровневой временной экспрессии рекомбинантных белков» . Журнал визуализированных экспериментов . 77 (77). DOI : 10.3791 / 50521 . PMC 3846102 . PMID 23913006 .  
  34. ^ Глава G, Халл RH, Tzotzos GT (2009). Генетически модифицированные растения: оценка безопасности и управление рисками . Лондон: Academic Pr. п. 244 . ISBN 978-0-12-374106-6.
  35. Перейти ↑ Alberts B , Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2002). Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Наука о гирляндах. п. Г: 35. ISBN 978-0-8153-4072-0.
  36. ^ a b Kamimura K, Suda T, Zhang G, Liu D (октябрь 2011 г.). «Достижения в системах доставки генов» . Фармацевтическая медицина . 25 (5): 293–306. DOI : 10.1007 / bf03256872 . PMC 3245684 . PMID 22200988 .  
  37. ^ Пакет DW, Хоффман AS, Пун S, Stayton PS (июль 2005). «Дизайн и разработка полимеров для доставки генов». Обзоры природы. Открытие наркотиков . 4 (7): 581–93. DOI : 10.1038 / nrd1775 . PMID 16052241 . 
  38. ^ «Лекция 8 генная инженерия клеток животных» . www.slideshare.net . 2012-01-25 . Проверено 18 июля 2018 .
  39. ^ Biocyclopedia.com. "Методы переноса (трансфекции) генов у животных | Генная инженерия и биотехнология Методы переноса генов и трансгенные организмы | Генетика, биотехнология, молекулярная биология, ботаника | Biocyclopedia.com" . biocyclopedia.com . Проверено 18 июля 2018 .
  40. ^ Ким, Тэ Гён; Эбервайн, Джеймс Х. (август 2010 г.). «Трансфекция клеток млекопитающих: настоящее и будущее» . Аналитическая и биоаналитическая химия . 397 (8): 3173–3178. DOI : 10.1007 / s00216-010-3821-6 . ISSN 1618-2642 . PMC 2911531 . PMID 20549496 .   
  41. ^ Муллин А. "Пронуклеарная инъекция" . Тулейнский университет.
  42. ^ "Перенос генов, опосредованный эмбриональными стволовыми клетками - трансгенные животные" . sites.google.com . Проверено 19 июля 2018 .
  43. ^ Трансдукция, генетика в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
  44. ^ «Перенаправление стволовых клеток» . stemcells.nih.gov .
  45. ^ Tuomela M, Stanescu I, Крон K (октябрь 2005). «Обзор валидации биоаналитических методов» . Генная терапия . 12 Дополнение 1 (S1): S131–8. DOI : 10.1038 / sj.gt.3302627 . PMID 16231045 . 
  46. Перейти ↑ Narayanaswamy S (1994). Культура растительных клеток и тканей . Тата Макгроу-Хилл Образование. стр. vi. ISBN 9780074602775.
  47. ^ Уолтер, Питер; Робертс, Кейт; Рафф, Мартин; Льюис, Джулиан; Джонсон, Александр; Альбертс, Брюс (2002). «Изучение экспрессии и функции генов» . Молекулярная биология клетки. 4-е издание .
  48. ^ Хон B, Леви А.А., Puchta H (апрель 2001). «Устранение маркеров селекции из трансгенных растений». Текущее мнение в области биотехнологии . 12 (2): 139–43. DOI : 10.1016 / S0958-1669 (00) 00188-9 . PMID 11287227 . 
  49. ^ Setlow JK (2002-10-31). Генная инженерия: принципы и методы . Springer Science & Business Media. п. 109. ISBN 9780306472800.
  50. ^ Дипак S, Kottapalli K, Rakwal R, G Орос, Rangappa K, Iwahashi H, Masuo Y, Агроэл G (июнь 2007). «ПЦР в реальном времени: революция в обнаружении и анализе экспрессии генов» . Текущая геномика . 8 (4): 234–51. DOI : 10.2174 / 138920207781386960 . PMC 2430684 . PMID 18645596 .  
  51. ^ Лодиш Н, Берк А, Zipursky SL, Мацудаира Р, Балтимор D, Дарнелл J (2000). «Глава 8.5: Замена генов и трансгенные животные: ДНК переносится в эукариотические клетки различными способами». Молекулярная клеточная биология (4-е изд.). WH Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-3136-8.
  52. ^ a b Роша-Мартинс, Маурисио; Cavalheiro, Gabriel R .; Матос-Родригес, Габриэль Э .; Мартинс, Родриго а. П.; Роша-Мартинс, Маурисио; Cavalheiro, Gabriel R .; Матос-Родригес, Габриэль Э .; Мартинс, Родриго а. П. (август 2015). «От нацеливания на гены до редактирования генома: приложения для трансгенных животных и не только» . Anais da Academia Brasileira de Ciências . 87 (2): 1323–1348. DOI : 10.1590 / 0001-3765201520140710 . ISSN 0001-3765 . PMID 26397828 .  
  53. ^ а б в г Кэрролл Д. (август 2011 г.). «Геномная инженерия с помощью нуклеаз цинковых пальцев» . Генетика . 188 (4): 773–82. DOI : 10.1534 / genetics.111.131433 . PMC 3176093 . PMID 21828278 .  
  54. ^ Grizot S, Смит Дж, Daboussi Ж, Прито Дж, Редондо Р, мериноса Н, Villate М, Томас S, Лемер L, G Монтойя, Бланко FJ, Pâques Р, Р Duchateau (сентябрь 2009 г.). «Эффективное нацеливание гена SCID с помощью сконструированной одноцепочечной эндонуклеазы самонаведения» . Исследования нуклеиновых кислот . 37 (16): 5405–19. DOI : 10.1093 / NAR / gkp548 . PMC 2760784 . PMID 19584299 .  
  55. ^ Гао Н, Смит Дж, Ян М, Джонс S, Джуканович В, Николсона М., Западный А, Bidney D, Falco SC, Jantz D, Lyznik Л.А. (январь 2010). «Наследственный целевой мутагенез кукурузы с использованием разработанной эндонуклеазы» . Заводской журнал . 61 (1): 176–87. DOI : 10.1111 / j.1365-313X.2009.04041.x . PMID 19811621 . 
  56. ↑ Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, Fu F, Maeder ML, Joung JK, Voytas DF (май 2009 г.). «Высокочастотная модификация генов растений с использованием сконструированных нуклеаз типа« цинковые пальцы »» . Природа . 459 (7245): 442–5. Bibcode : 2009Natur.459..442T . DOI : 10,1038 / природа07845 . PMC 2743854 . PMID 19404258 .  
  57. ^ Шукла В.К., Doyon Y, Миллер JC, DeKelver RC, Moehle Е.А., Уорден SE, Митчелл JC, Arnold NL, Гопалан S, Мэн X, Choi В.М., Рок JM, Ву YY, Katibah GE, Zhifang G, McCaskill D, Симпсон MA, Блейксли Б., Гринвалт С.А., Батлер Х.Дж., Хинкли С.Дж., Чжан Л., Ребар Э.Дж., Грегори П.Д., Урнов Ф.Д. (май 2009 г.) «Точная модификация генома у сельскохозяйственных культур Zea mays с использованием нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Природа . 459 (7245): 437–41. Bibcode : 2009Natur.459..437S . DOI : 10,1038 / природа07992 . PMID 19404259 . 
  58. ↑ Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, Hummel A, Bogdanove AJ, Voytas DF (октябрь 2010 г.). «Нацеливание на двухцепочечные разрывы ДНК с помощью эффекторных нуклеаз TAL» . Генетика . 186 (2): 757–61. DOI : 10.1534 / genetics.110.120717 . PMC 2942870 . PMID 20660643 .  
  59. ↑ Li T, Huang S, Jiang WZ, Wright D, Spalding MH, Weeks DP, Yang B (январь 2011 г.). «Нуклеазы TAL (TALN): гибридные белки, состоящие из эффекторов TAL и домена расщепления ДНК FokI» . Исследования нуклеиновых кислот . 39 (1): 359–72. DOI : 10.1093 / NAR / gkq704 . PMC 3017587 . PMID 20699274 .  
  60. ^ Esvelt К.М., Ван HH (2013). «Геномная инженерия для систем и синтетической биологии» . Молекулярная системная биология . 9 : 641. DOI : 10.1038 / msb.2012.66 . PMC 3564264 . PMID 23340847 .  
  61. ^ Tan WS, Карлсон DF, Уолтон MW, Fahrenkrug SC, Hackett PB (2012). «Прецизионное редактирование геномов крупных животных». Успехи в генетике Том 80 . Успехи в генетике. 80 . С. 37–97. DOI : 10.1016 / B978-0-12-404742-6.00002-8 . ISBN 9780124047426. PMC  3683964 . PMID  23084873 .
  62. ^ a b c d Мальзан, Эйми; Лоудер, Леви; Ци, Ипин (2017). «Редактирование генома растений с помощью TALEN и CRISPR» . Cell & Bioscience . 7 : 21. DOI : 10,1186 / s13578-017-0148-4 . PMC 5404292 . PMID 28451378 .  
  63. ^ Boissel S, Jarjour Дж, Астрахань А, Adey А, Gouble А, Duchateau Р, Shendure Дж, Стоддард Б.Л., Certo МТ, Бейкер Д, Scharenberg АМ (февраль 2014). «MegaTALs: архитектура нуклеаз с редким расщеплением для терапевтической геномной инженерии» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (4): 2591–601. DOI : 10.1093 / NAR / gkt1224 . PMC 3936731 . PMID 24285304 .  
  64. ^ Choulika, A .; Perrin, A .; Dujon, B .; Николас, Дж. Ф. (1994). «Мегануклеаза дрожжей I-Sce I индуцирует сайт-направленную хромосомную рекомбинацию в клетках млекопитающих». Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, Série III . 317 (11): 1013–9. PMID 7882137 . 
  65. ^ a b c Сильва Г., Пуаро Л., Галетто Р., Смит Дж., Монтойя Г., Дюшато П., Пак Ф. (февраль 2011 г.). «Мегануклеазы и другие инструменты для целевой геномной инженерии: перспективы и проблемы генной терапии» . Современная генная терапия . 11 (1): 11–27. DOI : 10.2174 / 156652311794520111 . PMC 3267165 . PMID 21182466 .  
  66. ^ Silva GH, Белфорт M, Wende W, Pingoud A (август 2006). «От мономерных эндонуклеаз к гомодимерным и обратно: разработка новой специфичности ферментов LAGLIDADG». Журнал молекулярной биологии . 361 (4): 744–54. DOI : 10.1016 / j.jmb.2006.06.063 . PMID 16872628 . 
  67. ^ Кристиан, М .; Cermak, T .; Дойл, Э.Л .; Schmidt, C .; Zhang, F .; Hummel, A .; Богданове, AJ; Войтас, Д.Ф. (2010). «Нацеливание на двухцепочечные разрывы ДНК с помощью эффекторных нуклеаз TAL» . Генетика . 186 (2): 757–761. DOI : 10.1534 / genetics.110.120717 . PMC 2942870 . PMID 20660643 .  
  68. ^ Сираноски, Д. (2019). "Что будет дальше с младенцами CRISPR?" . Природа . 566 : 440–442. DOI : 10.1038 / d41586-019-00673-1 . PMID 30809070 . 
  69. ^ Рис, H .; Лю, Д.Р. (2018). «Базовое редактирование: прецизионная химия на геноме и транскриптоме живых клеток» . Природа Обзоры Генетики . 19 (12): 770–788. DOI : 10.1038 / s41576-018-0059-1 . PMC 6535181 . PMID 30323312 .  
  70. ^ Anzalone, AV; Randolph, PB; Дэвис, младший (2019). «Редактирование генома с поиском и заменой без двухцепочечных разрывов или донорской ДНК» . Природа . 576 (7785): 149–157. Bibcode : 2019Natur.576..149A . DOI : 10.1038 / s41586-019-1711-4 . PMC 6907074 . PMID 31634902 .