Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9
Кристаллическая структура Cas9 в комплексе с направляющей РНК и целевой ДНК.jpg
Кристаллическая структура S pyogenes Cas9 в комплексе с sgRNA и ее целевой ДНК с разрешением 2,5 A. [1]
Идентификаторы
ОрганизмStreptococcus pyogenes M1
Символcas9
Альт. символыSpCas9
Entrez901176
PDB4OO8
RefSeq (мРНК)NC_002737.2
RefSeq (Prot)NP_269215.1
UniProtQ99ZW2
Прочие данные
Номер ЕС3.1.-.-
ХромосомаГеномный: 0,85 - 0,86 МБ
Ищи
СтруктурыШвейцарская модель
ДоменыИнтерПро

Cas9 ( C RISPR как связанный белок 9 , ранее называвшийся Cas5, Csn1 или Csx12) представляет собой белок весом 160 килодальтон, который играет жизненно важную роль в иммунологической защите определенных бактерий от ДНК-вирусов и плазмид и широко используется в приложениях генной инженерии. Его основная функция - разрезать ДНК и тем самым изменять геном клетки. Техника редактирования генома CRISPR-Cas9 внесла значительный вклад в Нобелевскую премию по химии 2020 года, присужденную Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна . [2]

С технической точки зрения Cas9 представляет собой фермент эндонуклеазу ДНК, управляемый двойной РНК, связанный с адаптивной иммунной системой с кластерными регулярными промежуточными короткими палиндромными повторами ( CRISPR ) у Streptococcus pyogenes . [3] [4] S. pyogenes использует CRISPR для запоминания и Cas9 для последующего опроса и расщепления чужеродной ДНК, например, вторгающейся ДНК бактериофага или плазмидной ДНК. [4] [5] [6] [7] Cas9 выполняет этот запрос, раскручивая чужеродную ДНК и проверяя сайты, комплементарные спейсерной области из 20 пар оснований направляющей РНК. . Если ДНК-субстрат комплементарен направляющей РНК, Cas9 расщепляет вторгающуюся ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (РНКи) у эукариот.

Помимо своей исходной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 широко используется в качестве инструмента геномной инженерии для индукции сайт-направленных двухцепочечных разрывов ДНК. Эти разрывы могут приводить к инактивации генов или внедрению гетерологичных генов посредством негомологичного соединения концов и гомологичной рекомбинации соответственно во многих лабораторных модельных организмах. Наряду с нуклеазами «цинковые пальцы» и белками эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN), Cas9 становится важным инструментом в области редактирования генома.

Cas9 приобрел популярность в последние годы, поскольку он может расщеплять практически любую последовательность, комплементарную направляющей РНК. [4] Поскольку целевая специфичность Cas9 проистекает из направляющей РНК: комплементарности ДНК, а не модификаций самого белка (например, TALENs и цинковые пальцы ), создание Cas9 для нацеливания на новую ДНК является простым. [8] Версии Cas9, которые связываются, но не расщепляют родственную ДНК, могут быть использованы для определения местоположения активатора или репрессоров транскрипции в конкретных последовательностях ДНК с целью контроля активации и репрессии транскрипции. [9] [10]Для нативного Cas9 требуется направляющая РНК, состоящая из двух разрозненных РНК, которые связываются - РНК CRISPR (crRNA) и транс-активирующей crRNA ( tracrRNA ). [3] Нацеливание на Cas9 было упрощено за счет создания химерной единственной направляющей РНК (хиРНК). Ученые предположили, что генные драйвы на основе Cas9 могут редактировать геномы целых популяций организмов. [11] В 2015 году Cas9 впервые был использован для модификации генома человеческих эмбрионов. [12]

CRISPR-опосредованный иммунитет [ править ]

Чтобы выжить во множестве сложных, негостеприимных мест обитания, заполненных бактериофагами , бактериями и археями, были разработаны методы, позволяющие уклоняться от хищных вирусов и отбиваться от них.. Сюда входит система адаптивного иммунитета CRISPR. На практике системы CRISPR / Cas действуют как самопрограммируемые рестрикционные ферменты. Локусы CRISPR состоят из коротких палиндромных повторов, которые встречаются через равные промежутки времени, и состоят из альтернативных повторов CRISPR и переменных спейсеров CRISPR длиной от 24 до 48 нуклеотидов. Эти локусы CRISPR обычно сопровождаются соседними генами, связанными с CRISPR (cas). В 2005 году три отдельные группы обнаружили, что спейсерные области гомологичны чужеродным элементам ДНК, включая плазмиды и вирусы. Эти отчеты предоставили первое биологическое свидетельство того, что CRISPR могут функционировать как иммунная система.

Cas9 часто использовался как инструмент редактирования генома. Cas9 был использован в недавних разработках для предотвращения манипулирования вирусами ДНК хозяев. Поскольку CRISPR-Cas9 был разработан на основе систем бактериального генома, его можно использовать для нацеливания на генетический материал вирусов. Использование фермента Cas9 может стать решением многих вирусных инфекций. Cas9 обладает способностью нацеливаться на определенные вирусы путем нацеливания на определенные цепи вирусной генетической информации. Более конкретно, фермент Cas9 нацелен на определенные участки вирусного генома, что мешает вирусу выполнять свои нормальные функции. [13]Cas9 также использовался для разрушения вредных цепей ДНК и РНК, которые вызывают заболевания и мутировавшие цепи ДНК. Cas9 уже показал многообещающие результаты в подавлении эффектов ВИЧ-1. Было показано, что Cas9 подавляет экспрессию длинных концевых повторов в ВИЧ-1. При введении в геном ВИЧ-1 Cas9 показал способность мутировать цепи ВИЧ-1. [14] [15] Cas9 также использовался при лечении гепатита В путем нацеливания на концы некоторых длинных концевых повторов в геноме вируса гепатита В. [16] Cas9 был использован для исправления мутаций, вызывающих катаракту у мышей.

Рис.2: Этапы иммунитета к CRISPR

Системы CRISPR-Cas делятся на три основных типа (тип I, тип II и тип III) и двенадцать подтипов, в зависимости от их генетического содержания и структурных различий. Однако основными определяющими характеристиками всех систем CRISPR-Cas являются гены cas и их белки: cas1 и cas2 универсальны для типов и подтипов, в то время как cas3 , cas9 и cas10 являются сигнатурными генами для типов I, типа II и типа III. , соответственно.

Этапы защиты CRISPR-Cas [ править ]

Адаптация [ править ]

Адаптация включает распознавание и интеграцию спейсеров между двумя соседними повторами в локусе CRISPR. «Протоспейсер» относится к последовательности вирусного генома, которая соответствует спейсеру. Короткий участок консервативных нуклеотидов существует проксимальнее протоспейсера, который называется мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM). PAM - это мотив узнавания, который используется для получения фрагмента ДНК. [7] При типе II Cas9 распознает PAM во время адаптации, чтобы гарантировать получение функциональных спейсеров. [5]

Обработка CRISPR / биогенез [ править ]

Экспрессия CRISPR включает транскрипцию первичного транскрипта, называемого РНК CRISPR (пре-crRNA), который транскрибируется из локуса CRISPR с помощью РНК-полимеразы. Затем специфические эндорибонуклеазы расщепляют пре-crRNA на малые CRISPR-РНК (crRNA). [17]

Помехи / иммунитет [ править ]

Интерференция вовлекает crRNA в мультибелковом комплексе под названием CASCADE, который может распознавать и специфически соединять пары оснований с участками вставки комплементарной чужеродной ДНК. Комплекс crRNA-чужеродная нуклеиновая кислота затем расщепляется, однако, если есть несоответствия между спейсером и целевой ДНК или если есть мутации в PAM, то расщепление не начнется. В последнем случае чужеродная ДНК не является мишенью для атаки клетки, поэтому репликация вируса продолжается, и хозяин не застрахован от вирусной инфекции. Этап вмешательства может механически и временно отличаться от приобретения и выражения CRISPR, однако для полноценного функционирования в качестве защитной системы все три этапа должны быть функциональными. [18]

Этап 1: интеграция спейсера CRISPR. Протоспейсеры и связанные с протоспейсерами мотивы (показаны красным) приобретаются на «ведущем» конце массива CRISPR в ДНК хозяина. Массив CRISPR состоит из последовательностей спейсеров (показаны в цветных прямоугольниках), окруженных повторами (черные ромбы). Для этого процесса требуются Cas1 и Cas2 (и Cas9 в типе II [5] ), которые кодируются в локусе cas, которые обычно расположены рядом с массивом CRISPR.

Этап 2: выражение CRISPR. Пре-crРНК транскрибируется, начиная с лидерной области, с помощью РНК-полимеразы хозяина, а затем расщепляется белками Cas на меньшие crRNA, содержащие один спейсер и частичный повтор (показаны в виде шпилечной структуры с окрашенными спейсерами).

Этап 3: вмешательство CRISPR. crRNA со спейсером, который имеет сильную комплементарность входящей чужеродной ДНК, начинает событие расщепления (изображено ножницами), для которого требуются белки Cas. Расщепление ДНК препятствует репликации вируса и обеспечивает иммунитет хозяину. Этап интерференции может функционально и временно отличаться от получения и выражения CRISPR (обозначен белой линией, разделяющей ячейку).

Деактивация транскрипции с помощью dCas9 [ править ]

dCas9, также называемый дефицитным по эндонуклеазе Cas9, может быть использован для редактирования экспрессии гена при применении к сайту связывания транскрипции желаемой части гена. Оптимальная функция dCas9 объясняется его принципом действия. Экспрессия генов подавляется, когда нуклеотиды больше не добавляются к цепи РНК и, следовательно, прекращают удлинение этой цепи, и в результате влияет на процесс транскрипции. Этот процесс происходит, когда dCas9 производится массово, поэтому он может воздействовать на большинство генов в любой момент времени через специфичную для последовательности молекулу направляющей РНК. Поскольку dCas9, по-видимому, подавляет экспрессию генов, это действие усиливается еще больше, когда он используется в сочетании с репрессивными доменами модификатора хроматина. [19]Белок dCas9 выполняет другие функции, помимо регуляции экспрессии генов. К белку dCas9 может быть добавлен промотор, который позволяет им работать друг с другом, чтобы стать эффективными при запуске или остановке транскрипции в различных последовательностях вдоль цепи ДНК. Эти два белка специфичны в том, где они действуют на ген. Это преобладает у определенных типов прокариот, когда промотор и dCas9 выравниваются вместе, чтобы препятствовать способности удлинения полимера нуклеотидов, соединяющихся вместе с образованием транскрибируемого фрагмента ДНК. Без промотора белок dCas9 не имеет такого же эффекта сам по себе или с телом гена. [20]

При дальнейшем изучении эффектов репрессии транскрипции, H3K27, аминокислотный компонент гистона, становится метилированным в результате взаимодействия dCas9 и пептида, называемого FOG1. По сути, это взаимодействие вызывает репрессию гена на C + N-концевом участке аминокислотного комплекса в определенном месте соединения гена и, как следствие, прекращает транскрипцию. [21]

dCas9 также оказался эффективным, когда дело доходит до изменения определенных белков, которые могут вызывать заболевания. Когда dCas9 присоединяется к форме РНК, называемой направляющей РНК, он предотвращает распространение повторяющихся кодонов и последовательностей ДНК, которые могут быть вредными для генома организма. По сути, когда продуцируются множественные повторяющиеся кодоны, это вызывает ответ или привлекает большое количество dCas9 для борьбы с избыточной продукцией этих кодонов и приводит к остановке транскрипции. dCas9 работает синергетически с гРНК и напрямую влияет на ДНК-полимеразу II, продолжая транскрипцию.

Дальнейшее объяснение того, как работает белок dCas9, можно найти в их использовании геномов растений путем регулирования выработки генов в растениях для увеличения или уменьшения определенных характеристик. Система CRISPR-CAS9 может либо активировать, либо подавлять гены. Белки dCas9 являются компонентом системы CRISPR-CAS9, и эти белки могут репрессировать определенные области гена растения. Это происходит, когда dCAS9 связывается с репрессорными доменами, а в случае растений действительно происходит дезактивация регуляторного гена, такого как AtCSTF64. [22]

Бактерии также являются еще одним направлением использования белков dCas9. Поскольку эукариоты имеют более крупный состав ДНК и геном; с гораздо более мелкими бактериями легко манипулировать. В результате эукариоты используют dCas9 для подавления РНК-полимеразы продолжения процесса транскрипции генетического материала. [23]

Структурные и биохимические исследования [ править ]

Кристаллическая структура [ править ]

Кристаллическая структура CRISPR-ассоциированного белка Cas9, основанная на PDB 5AXW, Nishimasu et al.

Cas9 имеет двухлепестковую архитектуру с направляющей РНК, расположенной между альфа-спиральной долей (синий) и долей нуклеазы (голубой, оранжевый и серый). Эти две доли соединены одной мостовой спиралью. Есть два нуклеазных домена, расположенных в доле многодоменной нуклеазы: RuvC (серый), который расщепляет нецелевую цепь ДНК, и нуклеазный домен HNH (голубой), который расщепляет целевую цепь ДНК. Домен RuvC кодируется последовательно разнесенными сайтами, которые взаимодействуют в третичной структуре с образованием домена расщепления RuvC (см. Правый рисунок).

Кристаллическая структура Cas9 в форме Apo. [24] Структурное воспроизведение было выполнено с использованием программного обеспечения UCSF Chimera.

Ключевой особенностью целевой ДНК является то, что она должна содержать мотив, прилегающий к протоспейсеру (PAM), состоящий из трехнуклеотидной последовательности - NGG. Этот PAM распознается взаимодействующим с PAM доменом (домен PI, оранжевый), расположенным рядом с C-концевым концом Cas9. Cas9 претерпевает явные конформационные изменения между состояниями апо, связанными направляющими РНК и связанными направляющими РНК: ДНК.

Cas9 распознает архитектуру стебель-петля, присущую локусу CRISPR, который опосредует созревание рибонуклеопротеинового комплекса crRNA-tracrRNA . [25] Cas9 в комплексе с CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующей crRNA (tracrRNA) дополнительно распознает и разрушает целевую дцДНК. [26] В представленной здесь сокристаллической структуре комплекс crRNA-tracrRNA заменен химерной однонаправленной РНК (sgRNA, выделенной красным цветом), которая, как было доказано, выполняет ту же функцию, что и природный комплекс РНК. [4]Основание sgRNA в паре с целевой ssDNA закреплено Cas9 в виде Т-образной архитектуры. Эта кристаллическая структура ДНК-связанного фермента Cas9 выявляет отчетливые конформационные изменения в альфа-спиральной доле по отношению к доле нуклеазы, а также расположение домена HNH. Белок состоит из доли узнавания (REC) и доли нуклеазы (NUC). Все области, кроме HNH, образуют тесные взаимодействия друг с другом и комплексом sgRNA-ssDNA, в то время как домен HNH образует мало контактов с остальной частью белка. В другой конформации комплекса Cas9, наблюдаемой в кристалле, домен HNH не виден. Эти структуры предполагают конформационную гибкость домена HNH.

На сегодняшний день изучено и опубликовано не менее трех кристаллических структур. Один представляет конформацию Cas9 в состоянии апо [24], а два представляет Cas9 в связанном состоянии ДНК. [27] [1]

Взаимодействие с sgRNA [ править ]

CRISPR / Cas9

В комплексе sgRNA-Cas9, основываясь на кристаллической структуре, домены REC1, BH и PI имеют важные контакты с остовом или основаниями как в области повтора, так и в области спейсера. [1] [27] Было протестировано несколько мутантов Cas9, включая делецию доменов REC1 или REC2 и мутации остатков в BH. Мутанты, родственные REC1 и BH, проявляют более низкую активность или ее отсутствие по сравнению с диким типом, что указывает на то, что эти два домена имеют решающее значение для распознавания sgRNA в повторяющейся последовательности и стабилизации всего комплекса. Хотя взаимодействия между последовательностью спейсера и Cas9, а также доменом PI и районом повтора нуждаются в дальнейших исследованиях, сокристалл демонстрирует четкую границу раздела между Cas9 и sgRNA.

Расщепление ДНК [ править ]

Предыдущий анализ последовательности и биохимические исследования показали, что Cas9 содержит два нуклеазных домена: McrA-подобный нуклеазный домен HNH и RuvC-подобный нуклеазный домен. [28] Эти HNH- и RuvC-подобные нуклеазные домены ответственны за расщепление комплементарных / целевых и некомплементарных / нецелевых цепей ДНК, соответственно. [4] Несмотря на низкое сходство последовательностей, последовательность, подобная РНКазе H, имеет складку RuvC (один член семейства РНКазы H), а область HNH складывается как T4 Endo VII (один член семейства эндонуклеаз HNH). [ необходима цитата ]

S. pyogenes Cas9 дикого типа требует кофакторов магния (Mg 2+ ) для РНК-опосредованного расщепления ДНК; однако было показано, что Cas9 проявляет различные уровни активности в присутствии ионов других двухвалентных металлов. [4] Например, было показано , что Cas9 в присутствии марганца (Mn 2+ ) способен к РНК-независимому расщеплению ДНК. [29] В Кинетике расщепления ДНК по cas9 была большим интерес для научного сообщества, так как эти данные дают представление о тонкостях реакции. В то время как расщепление ДНК РНК-связанным Cas9 было показано относительно быстро ( k ≥ 700 с -1), высвобождение продуктов расщепления происходит очень медленно ( t 1/2 = ln (2) / k ≈ 43-91 ч), по существу превращая Cas9 в фермент с одним оборотом . [30] Дополнительные исследования кинетики Cas9 показали, что сконструированный Cas9 эффективен в снижении нецелевых эффектов за счет изменения скорости реакции. [31] [32]

Проблемы, которые бактерии создают для редактирования Cas9 [ править ]

Большинство археи и бактерии упорно отказываются позволить cas9 редактировать их геном. Это потому, что они могут прикреплять чужеродную ДНК, которая не влияет на них, в свой геном. Другой способ, которым эти клетки игнорируют Cas9, - это система процесса рестрикционной модификации (RM). Когда бактериофаг попадает в бактериальную клетку или клетку архей, он становится мишенью для системы RM. Затем система RM разрезает ДНК бактериофагов на отдельные части рестрикционными ферментами и использует эндонуклеазы для дальнейшего разрушения цепей ДНК. Это создает проблему для редактирования Cas9, потому что система RM также нацелена на чужеродные гены, добавленные процессом Cas9. [33]

Применение Cas9 для настройки транскрипции [ править ]

Вмешательство в транскрипцию с помощью dCas9 [ править ]

Из-за уникальной способности Cas9 связываться практически с любой последовательностью комплемента в любом геноме , исследователи хотели использовать этот фермент для подавления транскрипции различных локусов генома . Для этого два критических каталитических остатка домена RuvC и HNH могут быть мутированы в аланин, устраняя всю эндонуклеазную активность Cas9. Полученный белок, названный «мертвым» Cas9 или для краткости «dCas9», все еще может прочно связываться с дцДНК. Этот каталитически неактивный вариант Cas9 использовался как для механистических исследований вопросительного связывания Cas9 ДНК, так и в качестве общего программируемого ДНК-связывающего комплекса РНК-белок.

Взаимодействие dCas9 с дцДНК-мишенью настолько плотное, что денатурирующий белок мочевина с высокой молярностью не может полностью диссоциировать комплекс dCas9 РНК-белок от дцДНК-мишени. [34] dCas9 был нацелен с помощью сконструированных однонаправленных РНК к сайтам инициации транскрипции любых локусов, где dCas9 может конкурировать с РНК-полимеразой на промоторах, останавливая транскрипцию. [35] Кроме того, dCas9 может быть нацелен на кодирующую область локусов, так что ингибирование РНК-полимеразы происходит во время фазы элонгации транскрипции. [35] У эукариот подавление экспрессии генов может быть увеличено путем нацеливания dCas9 на энхансерные последовательности, где dCas9 может блокировать сборку факторов транскрипции, что приводит к подавлению экспрессии специфических генов.[10] Кроме того, направляющие РНК, предоставленные для dCas9, могут быть разработаны таким образом, чтобы включать специфические несовпадения с его комплементарной родственной последовательностью, что количественно ослабит взаимодействие dCas9 с его запрограммированной родственной последовательностью, что позволит исследователю настроить степень подавления гена, применяемого к гену. представляет интерес. [35] Эта технология в принципе похожа на РНКи , так как экспрессия генов модулируется на уровне РНК. Однако подход dCas9 получил большую популярность, поскольку существует меньше нецелевых эффектов и в целом большие и более воспроизводимые эффекты сайленсинга за счет использования dCas9 по сравнению с экранами RNAi. [36]Более того, поскольку подход dCas9 к подавлению генов можно контролировать количественно, исследователь теперь может точно контролировать степень репрессии интересующего гена, что позволяет получить ответы на больше вопросов о регуляции генов и стехиометрии генов .

Помимо прямого связывания dCas9 с транскрипционно чувствительными позициями локусов, dCas9 может быть слит с множеством модулирующих белковых доменов для выполнения множества функций. Недавно dCas9 был слит с белками ремоделирования хроматина (HDACs / HATs) для реорганизации структуры хроматина вокруг различных локусов. [35] Это важно для нацеливания на различные интересующие эукариотические гены, поскольку структуры гетерохроматина препятствуют связыванию Cas9. Более того, поскольку Cas9 может реагировать на гетерохроматин , предполагается, что этот фермент может быть в дальнейшем применен для изучения структуры хроматина различных локусов. [35]Кроме того, dCas9 использовался в полногеномном скрининге репрессии генов. Используя большие библиотеки направляющих РНК, способных воздействовать на тысячи генов, был проведен генетический скрининг всего генома с использованием dCas9. [37]

Другой метод подавления транскрипции с помощью Cas9 - это прямое расщепление продуктов мРНК с помощью каталитически активного фермента Cas9. [38] Этот подход стал возможным благодаря гибридизации оцДНК с комплементарной последовательностью PAM с оцРНК, позволяющей создать сайт дцДНК-РНК PAM для связывания Cas9. Эта технология дает возможность выделять эндогенные РНК-транскрипты в клетках без необходимости индуцировать химические модификации РНК или методов маркировки РНК.

Активация транскрипции гибридными белками dCas9 [ править ]

В отличие от генов сайленсинга, dCas9 может также использоваться для активации генов при слиянии с факторами активации транскрипции. [35] Эти факторы включают субъединицы бактериальной РНК-полимеразы II и традиционные факторы транскрипции у эукариот. Недавно был проведен полногеномный скрининг активации транскрипции с использованием слияния dCas9, названного «CRISPRa» для активации. [37]

См. Также [ править ]

  • Система активации DCas9
  • CRISPR
  • Редактирование генов CRISPR
  • Редактирование генома
  • Нуклеаза цинкового пальца
  • Эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Нисимасу Х., Ран Ф.А., Сюй П.Д., Конерманн С., Шехата С.И., Дохмае Н., Ишитани Р., Чжан Ф., Нуреки О. (февраль 2014 г.). «Кристаллическая структура Cas9 в комплексе с направляющей РНК и целевой ДНК» . Cell . 156 (5): 935–49. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.02.001 . PMC  4139937 . PMID  24529477 .
  2. ^ "Нобелевская премия по химии 2020" . NobelPrize.org . Проверено 7 октября 2020 .
  3. ^ a b Дельчева Е., Чилински К., Шарма К.М., Гонсалес К., Чао Ю., Пирзада З.А., Экерт М.Р., Фогель Дж., Шарпантье Е. (март 2011 г.). «Созревание РНК CRISPR с помощью транскодируемой малой РНК и фактора хозяина РНКазы III» . Природа . 471 (7340): 602–607. Bibcode : 2011Natur.471..602D . DOI : 10,1038 / природа09886 . PMC 3070239 . PMID 21455174 .  
  4. ^ Б с д е е Jinek M, K, Chylinski Fonfara I, M Hauer, Doudna JA, Шарпантье E (август 2012 г.). «Программируемая двойная РНК-управляемая ДНК-эндонуклеаза в адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–21. Bibcode : 2012Sci ... 337..816J . DOI : 10.1126 / science.1225829 . PMC 6286148 . PMID 22745249 .  
  5. ^ Б с Хелер R, P, Самай Modell JW, Weiner C, Goldberg GW, Bikard D, Marraffini LA (март 2015 г.). «Cas9 определяет функциональные вирусные мишени во время адаптации CRISPR-Cas» . Природа . 519 (7542): 199–202. Bibcode : 2015Natur.519..199H . DOI : 10,1038 / природа14245 . PMC 4385744 . PMID 25707807 .  
  6. ^ Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S и др. (Март 2007 г.). «CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот». Наука . 315 (5819): 1709–12. Bibcode : 2007Sci ... 315.1709B . DOI : 10.1126 / science.1138140 . ЛВП : 20.500.11794 / 38902 . PMID 17379808 . 
  7. ^ a b Гарно Дж. Э., Дюпюи М., Виллион М., Ромеро Д. А., Баррангу Р., Боявал П., Фремо С., Хорват П., Магадан А. Х., Мойно С. (ноябрь 2010 г.). «Бактериальная иммунная система CRISPR / Cas расщепляет бактериофаговую и плазмидную ДНК». Природа . 468 (7320): 67–71. Bibcode : 2010Natur.468 ... 67G . CiteSeerX 10.1.1.451.9645 . DOI : 10,1038 / природа09523 . PMID 21048762 .  
  8. ^ Mali P, Esvelt км, Церковь GM (октябрь 2013 г. ). «Cas9 как универсальный инструмент инженерной биологии» . Природные методы . 10 (10): 957–63. DOI : 10.1038 / nmeth.2649 . PMC 4051438 . PMID 24076990 .  
  9. ^ Мали Р, Aach Дж, Stranges ПБ, Esvelt КМ, Moosburner М, Kosuri S, Ян л, Церковь ГМ (сентябрь 2013 г. ). «Активаторы транскрипции CAS9 для скрининга целевой специфичности и парные никазы для совместной инженерии генома» . Природа Биотехнологии . 31 (9): 833–8. DOI : 10.1038 / nbt.2675 . PMC 3818127 . PMID 23907171 .  
  10. ^ a b Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брар Г.А., Торрес С.Е., Стерн-Гиноссар Н., Брандман О., Уайтхед Е.Х., Дудна Д.А., Лим В.А., Вайсман Д.С., Ци Л.С. (июль 2013 г.). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот» . Cell . 154 (2): 442–51. DOI : 10.1016 / j.cell.2013.06.044 . PMC 3770145 . PMID 23849981 .  
  11. ^ Esvelt KM, Smidler AL, Catteruccia F, церковь GM (июль 2014). «Относительно РНК-управляемых генных движений для изменения диких популяций» . eLife . 3 . DOI : 10.7554 / eLife.03401 . PMC 4117217 . PMID 25035423 .  
  12. ^ Cyranoski D, Рирдон S (22 апреля 2015). «Китайские ученые генетически модифицируют человеческие эмбрионы». Природа . DOI : 10.1038 / nature.2015.17378 .
  13. ^ Doudna JA, Мали P (2016). CRISPR-Cas: лабораторное руководство . Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк. ISBN 9781621821304. OCLC  922914104 .
  14. ↑ Chen W, Page-McCaw PS (март 2019). «Редактирование гена CRISPR / Cas9». AccessScience . McGraw-Hill Education. DOI : 10.1036 / 1097-8542.168060 .
  15. ^ Эбина Н, Н Мисава, Kanemura Y, Койанаги Y (2013-08-26). «Использование системы CRISPR / Cas9 для разрушения латентного провируса ВИЧ-1» . Научные отчеты . 3 (1): 2510. DOI : 10.1038 / srep02510 . PMC 3752613 . PMID 23974631 .  
  16. ^ Li H, Sheng C, Wang S, Yang L, Liang Y, Huang Y, Liu H, Li P, Yang C, Yang X, Jia L, Xie J, Wang L, Hao R, Du X, Xu D, Zhou Дж., Ли М., Сун И, Тонг И, Ли Кью, Цю С., Сон Х (2017-03-22). «Удаление интегрированной ДНК вируса гепатита B с помощью CRISPR-Cas9» . Границы клеточной и инфекционной микробиологии . 7 : 91. DOI : 10.3389 / fcimb.2017.00091 . PMC 5360708 . PMID 28382278 .  
  17. ^ Хорват P, Barrangou R (январь 2010). «CRISPR / Cas, иммунная система бактерий и архей». Наука . 327 (5962): 167–70. Bibcode : 2010Sci ... 327..167H . DOI : 10.1126 / science.1179555 . PMID 20056882 . 
  18. ^ Каргин FV, Ханнон GJ (январь 2010). «Система CRISPR: защита под контролем малых РНК у бактерий и архей» . Молекулярная клетка . 37 (1): 7–19. DOI : 10.1016 / j.molcel.2009.12.033 . PMC 2819186 . PMID 20129051 .  
  19. ^ Йенсен Е.Д., Феррейра Р, Т Jakočiūnas, Arsovska D, Чжан J, Дин L, и др. (Март 2017 г.). «Транскрипционное репрограммирование в дрожжах с использованием стратегии dCas9 и комбинаторной гРНК» . Фабрики микробных клеток . 16 (1): 46. DOI : 10,1186 / s12934-017-0664-2 . PMC 5353793 . PMID 28298224 .  
  20. ↑ Pinto BS, Saxena T, Oliveira R, Méndez-Gómez HR, Cleary JD, Denes LT, McConnell O, Arboleda J, Xia G, Swanson MS, Wang ET (ноябрь 2017 г.). «Препятствие транскрипции расширенных микросателлитных повторов деактивированным Cas9» . Молекулярная клетка . 68 (3): 479–490.e5. DOI : 10.1016 / j.molcel.2017.09.033 . PMC 6013302 . PMID 29056323 .  
  21. ^ O'Geen Н, Рен С, Николе СМ, Перес А.А., Халмаи Дж, Ле В.М., Маккей ДП, Фарнхем PJ, Сегал ди - джей (сентябрь 2017 г.). «Редактирование эпигенома на основе dCas9 предполагает, что приобретение метилирования гистонов недостаточно для репрессии целевого гена» . Исследования нуклеиновых кислот . 45 (17): 9901–9916. DOI : 10.1093 / NAR / gkx578 . PMC 5622328 . PMID 28973434 .  
  22. ^ Lowder LG, Пол JW, Qi Y (2017). Мультиплексная активация или репрессия транскрипции в растениях с использованием систем на основе CRISPR-dCas9 . Методы молекулярной биологии . 1629 . С. 167–184. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-7125-1_12 . ISBN 978-1-4939-7124-4. PMID  28623586 .
  23. ^ Barrangou R, Хорват P (июнь 2017). «Десятилетие открытий: функции и приложения CRISPR». Природная микробиология . 2 (7): 17092. DOI : 10.1038 / nmicrobiol.2017.92 . PMID 28581505 . 
  24. ^ a b Jinek M, Jiang F, Taylor DW, Sternberg SH, Kaya E, Ma E, Anders C, Hauer M, Zhou K, Lin S, Kaplan M, Iavarone AT, Charpentier E, Nogales E, Doudna JA (март 2014 г.) ). «Структуры эндонуклеаз Cas9 обнаруживают РНК-опосредованную конформационную активацию» . Наука . 343 (6176): 1247997. DOI : 10.1126 / science.1247997 . PMC 4184034 . PMID 24505130 .  
  25. ^ Wiedenheft B, Штернберг SH, Doudna JA (февраль 2012). «РНК-управляемые системы генетического сайленсинга у бактерий и архей». Природа . 482 (7385): 331–8. Bibcode : 2012Natur.482..331W . DOI : 10,1038 / природа10886 . PMID 22337052 . 
  26. Перейти ↑ Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F (ноябрь 2013 г.). «Геномная инженерия с использованием системы CRISPR-Cas9» . Протоколы природы . 8 (11): 2281–2308. DOI : 10.1038 / nprot.2013.143 . PMC 3969860 . PMID 24157548 .  
  27. ^ a b Андерс C, Невёнер O, Duerst A, Jinek M (сентябрь 2014 г.). «Структурные основы распознавания PAM-зависимой целевой ДНК эндонуклеазой Cas9» . Природа . 513 (7519): 569–73. DOI : 10,1038 / природа13579 . PMC 4176945 . PMID 25079318 .  
  28. ^ Макарова К.С., Гришин Н.В., Шабалина С.А., Вольф Ю.И., Кунин Е.В. (март 2006 г.). «Предполагаемая иммунная система, основанная на РНК-интерференции, у прокариот: компьютерный анализ предсказанного ферментативного механизма, функциональные аналогии с эукариотической РНКи и гипотетические механизмы действия» . Биология Директ . 1 (1): 7. DOI : 10.1186 / 1745-6150-1-7 . PMC 1462988 . PMID 16545108 .  
  29. ^ Сундаресан Р., Парамешваран HP, Йогеша С.Д., Кейлбарт М.В., Раджан Р. (декабрь 2017 г.). «РНК-независимая активность расщепления ДНК Cas9 и Cas12a» . Сотовые отчеты . 21 (13): 3728–3739. DOI : 10.1016 / j.celrep.2017.11.100 . PMC 5760271 . PMID 29281823 .  
  30. ^ Raper AT, Стефенсон AA, Суо Z (февраль 2018). «Функциональные идеи, обнаруженные кинетическим механизмом CRISPR / Cas9». Журнал Американского химического общества . 140 (8): 2971–2984. DOI : 10.1021 / jacs.7b13047 . PMID 29442507 . 
  31. ^ Ли JK, Jeong E, Lee J, Jung M, Shin E, Kim YH и др. (Август 2018 г.). «Направлял эволюцию CRISPR-Cas9 для увеличения его специфичности» . Nature Communications . 9 (1): 3048. Bibcode : 2018NatCo ... 9.3048L . DOI : 10.1038 / s41467-018-05477-х . PMC 6078992 . PMID 30082838 .  
  32. ^ Сингх Д., Ван И, Мэллон Дж, Ян О, Фей Дж, Поддар А и др. (Апрель 2018). «Механизмы повышенной специфичности сконструированных Cas9, выявленные с помощью одномолекулярного анализа FRET» . Структурная и молекулярная биология природы . 25 (4): 347–354. DOI : 10.1038 / s41594-018-0051-7 . PMC 6195204 . PMID 29622787 .  
  33. ^ Кусано К, Т Найто, Ханда N, Кобаяши I (ноябрь 1995 года). «Системы рестрикции и модификации как геномные паразиты в конкуренции за определенные последовательности» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (24): 11095–9. Bibcode : 1995PNAS ... 9211095K . DOI : 10.1073 / pnas.92.24.11095 . PMC 40578 . PMID 7479944 .  
  34. ^ Штернберг SH, Реддинг S, M Jinek, Greene EC, Doudna JA (март 2014). «Исследование ДНК с помощью CRISPR-управляемой РНК эндонуклеазы Cas9» . Природа . 507 (7490): 62–7. DOI : 10,1038 / природа13011 . PMC 4106473 . PMID 24476820 .  
  35. ^ Б с д е е Bikard D, Jiang W, P, Самай Хохшильда A, Zhang F, Marraffini LA (август 2013 г. ). «Программируемая репрессия и активация экспрессии бактериальных генов с использованием сконструированной системы CRISPR-Cas» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (15): 7429–37. DOI : 10.1093 / NAR / gkt520 . PMC 3753641 . PMID 23761437 .  
  36. ^ Хайнтце Дж, Люфт С, Кеттелер R (2013). «CRISPR CASe для подавления звука с высокой пропускной способностью» . Границы генетики . 4 : 193. DOI : 10,3389 / fgene.2013.00193 . PMC 3791873 . PMID 24109485 .  
  37. ^ a b Гилберт Л.А., Хорлбек М.А., Адамсон Б., Вильялта Дж. Э., Чен Й, Уайтхед Е. Х., Гимарайнш С., Паннинг Б., Плоег Г. Л., Бассик М. С., Ци Л. С., Кампманн М., Вайсман Дж. С. (октябрь 2014 г.). «Genome-Scale CRISPR-опосредованный контроль репрессии и активации генов» . Cell . 159 (3): 647–61. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.09.029 . PMC 4253859 . PMID 25307932 .  
  38. ↑ O'Connell MR, Oakes BL, Sternberg SH, East-Seletsky A, Kaplan M, Doudna JA (декабрь 2014 г.). «Программируемое распознавание и расщепление РНК с помощью CRISPR / Cas9» . Природа . 516 (7530): 263–6. DOI : 10,1038 / природа13769 . PMC 4268322 . PMID 25274302 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Кеннеди Э.М., Каллен Б.Р. (май 2015 г.). «Бактериальные эндонуклеазы ДНК CRISPR / Cas: революционная технология, которая может существенно повлиять на исследования и лечение вирусов» . Вирусология . 479–480: 213–20. DOI : 10.1016 / j.virol.2015.02.024 . PMC  4424069 . PMID  25759096 .
  • Abbott TR, Dhamdhere G, Liu Y, Lin X, Goudy L, Zeng L и др. (Май 2020 г.). «Разработка CRISPR как антивирусной стратегии для борьбы с SARS-CoV-2 и гриппом» . Cell . 181 : 1–12. DOI : 10.1016 / j.cell.2020.04.020 . Выложить резюме - ПРОВОДНОЙ .

Внешние ссылки [ править ]

  • Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : Q99ZW2 (эндонуклеаза Cas9 / Csn1, ассоциированная с CRISPR Streptococcus pyogenes) в PDBe-KB .