Библиотека (биология)

Эта статья требует дополнительных ссылок для проверки . Пожалуйста, помогите улучшить эту статью , добавив цитаты из надежных источников . Материал, не полученный от источника, может быть оспорен и удален.
Найти источники: «Библиотека» биология - новости · газеты · книги · ученый · JSTOR ( декабрь 2009 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения )

Мутагенез с насыщением сайта - это тип сайт-направленного мутагенеза . На этом изображении показан мутагенез насыщения в одном положении теоретического белка с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже.

Как библиотеки ДНК генерируются с помощью случайного пространства последовательностей образцов мутагенеза . Показана аминокислота, замещенная в данном положении. Каждая точка или набор связанных точек является одним членом библиотеки. Подверженная ошибкам ПЦР случайным образом изменяет некоторые остатки на другие аминокислоты. Аланиновое сканирование заменяет каждый остаток белка аланином, один за другим. Насыщение сайта заменяет каждую из 20 возможных аминокислот (или некоторые их подмножества) в одном положении, одну за другой.

В молекулярной биологии , А библиотека представляет собой набор ДНК - фрагменты , которые хранятся и распространяются в популяции микроорганизмов в процессе молекулярного клонирования . Существуют различные типы библиотек ДНК, включая библиотеки кДНК (сформированные из РНК с обратной транскрипцией ), геномные библиотеки (сформированные из геномной ДНК) и рандомизированные мутантные библиотеки (сформированные путем синтеза генов de novo, в которые включены альтернативные нуклеотиды или кодоны). Технология библиотеки ДНК - это основа современной молекулярной биологии , генной инженерии и белковой инженерии., и применение этих библиотек зависит от источника исходных фрагментов ДНК. Существуют различия в векторах клонирования и методах, используемых при приготовлении библиотеки, но в целом каждый фрагмент ДНК уникальным образом вставляется в вектор клонирования, а затем пул рекомбинантных молекул ДНК переносится в популяцию бактерий ( бактериальная искусственная хромосома или библиотека ВАС). ) или дрожжи, так что каждый организм содержит в среднем одну конструкцию (вектор + вставка). По мере роста популяции организмов в культуре содержащиеся в них молекулы ДНК копируются и размножаются (таким образом, «клонируются»).

Терминология [ править ]

Термин «библиотека» может относиться к популяции организмов, каждый из которых несет молекулу ДНК, вставленную в вектор клонирования, или, альтернативно, к коллекции всех клонированных векторных молекул.

библиотеки кДНК [ править ]

Библиотека кДНКа представляет собой образец мРНКа очищает от конкретного источника (либо сбор клеток, определенная ткань или весь организм), который был преобразован обратно в матричную ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы . Таким образом, он представляет гены, которые активно транскрибировались в этом конкретном источнике в физиологических условиях, в условиях развития или в условиях окружающей среды, которые существовали, когда мРНК была очищена. Библиотеки кДНК могут быть созданы с использованием методов, которые способствуют «полноразмерным» клонам, или в условиях, которые генерируют более короткие фрагменты, используемые для идентификации « меток экспрессируемой последовательности ».

Библиотеки кДНК полезны в обратной генетике, но они представляют только очень небольшую (менее 1%) часть общего генома в данном организме.

Приложения библиотек кДНК включают:

Открытие новых генов
Клонирование полноразмерных молекул кДНК для исследования функции генов in vitro
Изучение репертуара мРНК, экспрессируемых в разных клетках или тканях.
Изучение альтернативного сплайсинга в разных клетках или тканях

Геномные библиотеки [ править ]

Геномная библиотека представляет собой набор клонов , которые вместе представляет весь геном данного организма. Количество клонов, составляющих геномную библиотеку, зависит от (1) размера рассматриваемого генома и (2) размера вставки, допустимого для конкретной системы вектора клонирования . Для большинства практических целей тканевый источник геномной ДНК не важен, потому что каждая клетка тела содержит практически идентичную ДНК (за некоторыми исключениями).

Приложения геномных библиотек включают:

Определение полной последовательности генома данного организма (см. Проект генома )
Служит источником геномной последовательности для создания трансгенных животных с помощью генной инженерии.
Изучение функции регуляторных последовательностей in vitro
Изучение генетических мутаций в раковых тканях

Библиотеки синтетических мутантов [ править ]

Описание одного из распространенных способов клонирования библиотеки сайт-направленного мутагенеза (т. Е. С использованием вырожденных олигонуклеотидов). Интересующий ген подвергается ПЦР с олигонуклеотидами, которые содержат область, которая полностью комплементарна матрице (синий), и область, которая отличается от матрицы одним или несколькими нуклеотидами (красный). Многие такие праймеры, содержащие вырожденность в некомплементарной области, объединяются в одну и ту же ПЦР, что приводит к множеству различных продуктов ПЦР с разными мутациями в этой области (отдельные мутанты показаны разными цветами ниже).

В отличие от типов библиотек, описанных выше, существует множество искусственных методов создания библиотек вариантных генов. ^[1] Вариации по всему гену могут быть внесены случайным образом с помощью подверженной ошибкам ПЦР , ^[2] перетасовки ДНК для рекомбинации частей похожих генов вместе ^[3] или методов на основе транспозонов для введения инделей . ^[4] Альтернативно, мутации могут быть нацелены на конкретные кодоны во время синтеза de novo или мутагенеза насыщения для конструирования одного или нескольких точечных мутантов гена контролируемым образом. ^[5] Это приводит к смеси двухцепочечных молекул ДНК, которые представляют собой варианты исходного гена.

Затем экспрессированные белки из этих библиотек могут быть подвергнуты скринингу на предмет вариантов, которые проявляют благоприятные свойства (например, стабильность, сродство связывания или ферментативную активность). Это можно повторять в циклах создания вариантов генов и скрининга продуктов экспрессии в процессе направленной эволюции . ^[1]

Обзор методов подготовки библиотеки кДНК [ править ]

Извлечение ДНК [ править ]

При создании библиотеки мРНК (например, с клонами кДНК) существует несколько возможных протоколов выделения мРНК полной длины. Для извлечения ДНК из библиотек геномной ДНК (также известной как гДНК) может быть полезен мини-препарат ДНК.

Подготовить вставки [ править ]

Библиотеки кДНК требуют осторожности, чтобы гарантировать, что клоны мРНК полной длины захватываются в виде кДНК (которая позже будет вставлена в векторы). По этой причине было разработано несколько протоколов для оптимизации синтеза 1-й цепи кДНК и 2-й цепи кДНК, а также для повышения вероятности направленного клонирования в вектор.

Фрагменты гДНК генерируются из экстрагированной гДНК с использованием неспецифических рестрикционных ферментов с частым резанием.

Векторы [ править ]

Представляющие интерес нуклеотидные последовательности сохраняются в виде вставок в плазмиду или геном бактериофага , который использовался для заражения бактериальных клеток.

Чаще всего векторы размножаются в бактериальных клетках, но при использовании YAC (искусственная хромосома дрожжей) можно использовать дрожжевые клетки. Векторы также могут быть размножены с помощью вирусов, но это может занять много времени и утомительно. Однако высокая эффективность трансфекции, достигаемая с помощью вирусов (часто фагов), делает их полезными для упаковки вектора (с лигированной вставкой) и последующего введения их в бактериальную (или дрожжевую) клетку.

Кроме того, для библиотек кДНК была разработана система, использующая фаг Lambda Zap II, ExAssist и 2 вида E. coli. Вместо этого также можно использовать систему Cre-Lox, использующую сайты loxP и экспрессию фермента рекомбиназы in vivo. Это примеры систем удаления in vivo. Иссечение in vitro включает субклонирование, часто с использованием традиционных рестрикционных ферментов и стратегий клонирования. Иссечение in vitro может занять больше времени и может потребовать большей практической работы, чем системы удаления in vivo. В любом случае системы позволяют перемещать вектор из фага в живую клетку, где вектор может реплицироваться и размножаться до тех пор, пока не будет использована библиотека.

Использование библиотек [ править ]

Рабочий процесс скрининга синтетической библиотеки для выявления клеток, продуцирующих интересующее химическое вещество.

Это включает в себя «скрининг» интересующих последовательностей. Есть несколько возможных способов добиться этого.

Ссылки [ править ]

^ а б Ваджапей, Нарендра; Лю, Алекс Ю .; Форлони, Маттео (01.03.2018). «Случайный мутагенез с использованием ДНК-полимераз, склонных к ошибкам». Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2018 (3): pdb.prot097741. DOI : 10,1101 / pdb.prot097741 . ISSN 1940-3402 . PMID 29496818 .
^ Маккаллум, Элизабет О.; Уильямс, Береа А.Р.; Чжан, Джинглей; Chaput, John C. (2010), Braman, Jeff (ed.), «Random Mutagenesis by Error-Prone PCR», In vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition , Methods in Molecular Biology, Humana Press, 634 , стр. 103–109. , DOI : 10.1007 / 978-1-60761-652-8_7 , ISBN 9781607616528, PMID 20676978
^ Crameri A, Raillard SA, Бермудес E, Штеммер WP (январь 1998). «Перетасовка ДНК семейства генов разных видов ускоряет направленную эволюцию». Природа . 391 (6664): 288–91. Bibcode : 1998Natur.391..288C . DOI : 10.1038 / 34663 . PMID 9440693 .
Перейти ↑ Jones DD (май 2005 г.). «Удаление триплетных нуклеотидов в случайных положениях в гене-мишени: толерантность бета-лактамазы ТЕМ-1 к аминокислотной делеции» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (9): e80. DOI : 10.1093 / NAR / gni077 . PMC 1129029 . PMID 15897323 .
^ Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тин; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (01.09.2006). «Конструирование мутантной библиотеки в направленной молекулярной эволюции». Молекулярная биотехнология . 34 (1): 55–68. DOI : 10.1385 / MB: 34: 1: 55 . ISSN 1559-0305 . PMID 16943572 .

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы в вашей библиотеке
Ресурсы в других библиотеках

[:0-1] а б Ваджапей, Нарендра; Лю, Алекс Ю .; Форлони, Маттео (01.03.2018). «Случайный мутагенез с использованием ДНК-полимераз, склонных к ошибкам». Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2018 (3): pdb.prot097741. DOI : 10,1101 / pdb.prot097741 . ISSN 1940-3402 . PMID 29496818 .

[2] Маккаллум, Элизабет О.; Уильямс, Береа А.Р.; Чжан, Джинглей; Chaput, John C. (2010), Braman, Jeff (ed.), «Random Mutagenesis by Error-Prone PCR», In vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition , Methods in Molecular Biology, Humana Press, 634 , стр. 103–109. , DOI : 10.1007 / 978-1-60761-652-8_7 , ISBN 9781607616528, PMID 20676978

[3] Crameri A, Raillard SA, Бермудес E, Штеммер WP (январь 1998). «Перетасовка ДНК семейства генов разных видов ускоряет направленную эволюцию». Природа . 391 (6664): 288–91. Bibcode : 1998Natur.391..288C . DOI : 10.1038 / 34663 . PMID 9440693 .

[4] Перейти ↑ Jones DD (май 2005 г.). «Удаление триплетных нуклеотидов в случайных положениях в гене-мишени: толерантность бета-лактамазы ТЕМ-1 к аминокислотной делеции» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (9): e80. DOI : 10.1093 / NAR / gni077 . PMC 1129029 . PMID 15897323 .

[5] Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тин; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (01.09.2006). «Конструирование мутантной библиотеки в направленной молекулярной эволюции». Молекулярная биотехнология . 34 (1): 55–68. DOI : 10.1385 / MB: 34: 1: 55 . ISSN 1559-0305 . PMID 16943572 .