 | Эта статья требует дополнительных ссылок для проверки . ( май 2008 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить это сообщение-шаблон ) |
Библиотека кДНК представляет собой комбинацию из клонированной кДНК ( комплементарной ДНК ) фрагментов , вставленных в набор клеток - хозяев, которые представляют собой некоторую часть транскриптома организма и сохраняются как « библиотеки ». кДНК производится из полностью транскрибированной мРНК, обнаруженной в ядре, и поэтому содержит только экспрессированные гены организма. Аналогичным образом могут быть получены тканеспецифичные библиотеки кДНК. В эукариотических клетках зрелая мРНК уже сплайсирована , поэтому полученная кДНК не имеет интронов.и может легко экспрессироваться в бактериальной клетке. Хотя информация в библиотеках кДНК является мощным и полезным инструментом, поскольку генные продукты легко идентифицируются, в библиотеках отсутствует информация об энхансерах , интронах и других регуляторных элементах, обнаруженных в библиотеке геномной ДНК .
Создание библиотеки кДНК [ править ]
кДНК создается из зрелой мРНК эукариотической клетки с использованием обратной транскриптазы . У эукариот поли- (A) хвост (состоящий из длинной последовательности адениновых нуклеотидов) отличает мРНК от тРНК и рРНК и, следовательно, может использоваться в качестве сайта праймера для обратной транскрипции. Проблема заключается в том, что не все транскрипты, например, для гистона , кодируют поли-А-хвост .
извлечение мРНК [ править ]
Во-первых, мРНК получают и очищают от остальных РНК. Существует несколько методов очистки РНК, таких как экстракция тризолом и очистка на колонке . Очистку колонки проводят с использованием смол, покрытых олигомерными нуклеотидами dT, где будет связываться только мРНК, имеющая поли-А-хвост. Остальные РНК элюируются. МРНК элюируют с использованием буфера для элюирования и некоторого нагрева для отделения цепей мРНК от олиго-dT.
конструкция кДНК [ править ]
После очистки мРНК олиго-dT (короткая последовательность дезокситимидиновых нуклеотидов) маркируется как комплементарный праймер, который связывается с поли-A-хвостом, обеспечивая свободный 3'-OH-конец, который может быть удлинен обратной транскриптазой для создания комплементарная цепь ДНК. Теперь мРНК удаляется с помощью фермента РНКазы, оставляя одноцепочечную кДНК (оскДНК). Эта оскДНК превращается в двухцепочечную ДНК с помощью ДНК-полимеразы . Однако для ДНК-полимеразы для синтеза комплементарной цепи необходим свободный 3'-ОН-конец. Это обеспечивается самой оскДНК путем создания петли в виде шпильки на 3'-конце путем наматывания на себя. Полимераза удлиняет 3'-ОН конец, и позже петля на 3'-конце открывается за счет ножничного действияНуклеаза S 1 . Затем для клонирования последовательностей в бактериальные плазмиды используют эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигазу .
Затем отбирают клонированные бактерии, обычно с помощью селекции антибиотиков. После выбора создаются запасы бактерий, которые впоследствии можно выращивать и секвенировать для компиляции библиотеки кДНК.
Библиотека кДНК использует [ править ]
Библиотеки кДНК обычно используются при воспроизведении геномов эукариот, поскольку объем информации сокращается для удаления большого количества некодирующих областей из библиотеки. Библиотеки кДНК используются для экспрессии эукариотических генов в прокариотах. Прокариоты не имеют интронов в своей ДНК и, следовательно, не обладают какими-либо ферментами, которые могут вырезать ее в процессе транскрипции. кДНК не имеет интронов и поэтому может экспрессироваться в прокариотических клетках. Библиотеки кДНК наиболее полезны в обратной генетике, где дополнительная геномная информация менее полезна . Кроме того, библиотеки кДНК часто используются при функциональном клонировании.для идентификации генов на основе функции кодируемого белка. При изучении эукариотической ДНК библиотеки экспрессии конструируются с использованием комплементарной ДНК (кДНК), чтобы гарантировать, что вставка действительно является геном. [1]
Библиотека кДНК против библиотеки геномной ДНК [ править ]
В библиотеке кДНК отсутствуют некодирующие и регуляторные элементы, обнаруженные в геномной ДНК. Библиотеки геномной ДНК предоставляют более подробную информацию об организме, но их создание и хранение требуют больших ресурсов.
Клонирование кДНК [ править ]
Молекулы кДНК можно клонировать с использованием линкеров сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой короткие двухцепочечные фрагменты ДНК ( олигодезоксирибонуклеотид ) длиной от 8 до 12 пар нуклеотидов, которые включают сайт расщепления рестрикционной эндонуклеазой, например BamHI. Как кДНК, так и линкер имеют тупые концы, которые можно лигировать вместе с использованием высокой концентрации ДНК-лигазы Т4. Затем в молекуле кДНК образуются липкие концы путем расщепления концов кДНК (которые теперь имеют линкеры со встроенным сайтом) соответствующей эндонуклеазой. Затем клонирующий вектор ( плазмида ) также расщепляется соответствующей эндонуклеазой. После " липкого конца"«лигирование вставки в вектор». Полученная молекула рекомбинантной ДНК переносится в клетку-хозяин E. coli для клонирования.
См. Также [ править ]
- Функциональное клонирование
Ссылки [ править ]
- ^ П., Кларк, Дэвид (2009). Биотехнология: применение генетической революции . Паздерник, Нанетт Жан. Амстердам: Academic Press / Elsevier. ISBN 9780121755522. OCLC 226038060 .
Внешние ссылки [ править ]
- Функциональная аннотация базы данных мыши ( FANTOM )
- примеры синтеза и клонирования кДНК
