Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Эта статья о мутагенезе как лабораторном методе. Для мутагенеза как общего процесса см. Мутагенез .
Типы мутаций, которые могут быть внесены случайным, сайт-направленным, комбинаторным или инсерционным мутагенезом.

В молекулярной биологии , мутагенеза является важной лабораторная методика которой ДНК мутации намеренно инженерии для получения библиотеки мутантных генов, белков, штаммов бактерий или других генетически модифицированных организмов. Различные составляющие гена, а также его регуляторные элементы и его генные продукты могут быть мутированы, чтобы можно было детально изучить функционирование генетического локуса, процесса или продукта. Мутация может производить мутантные белки с интересными свойствами или усиленными или новыми функциями, которые могут иметь коммерческое использование. Также могут быть получены мутантные штаммы, которые имеют практическое применение или позволяют исследовать молекулярную основу конкретной функции клетки.

Сегодня существует множество методов мутагенеза. Изначально мутации, искусственно вызванные в лаборатории, были полностью случайными с использованием таких механизмов, как УФ-облучение. Случайный мутагенез не может воздействовать на конкретные области или последовательности генома; однако с развитием сайт-направленного мутагенеза могут быть внесены более специфические изменения. С 2013 года разработка технологии CRISPR / Cas9, основанной на прокариотической системе защиты от вирусов, позволила редактировать или мутагенез генома in vivo . [1]Сайт-направленный мутагенез оказался полезным в ситуациях, когда случайный мутагенез - нет. Другие методы мутагенеза включают комбинаторный и инсерционный мутагенез. Мутагенез, который не является случайным, можно использовать для клонирования ДНК [2], исследования эффектов мутагенов [3] и создания белков. [4] У него также есть медицинские приложения, такие как помощь пациентам с ослабленным иммунитетом, исследование и лечение заболеваний, включая ВИЧ и рак, а также лечение таких заболеваний, как бета-талассемия . [5]

Случайный мутагенез [ править ]

Как библиотеки ДНК генерируются с помощью случайного пространства последовательностей образцов мутагенеза . Показана аминокислота, замещенная в данном положении. Каждая точка или набор связанных точек является одним членом библиотеки. Подверженная ошибкам ПЦР случайным образом изменяет некоторые остатки на другие аминокислоты. Аланиновое сканирование заменяет каждый остаток белка аланином, один за другим. Насыщение сайта заменяет каждую из 20 возможных аминокислот (или некоторые их подмножества) в одном положении, одну за другой.

Ранние подходы к мутагенезу основывались на методах, которые производили полностью случайные мутации. В таких способах клетки или организмы подвергаются воздействию мутагенов, таких как УФ-излучение или мутагенные химические вещества, и затем отбираются мутанты с желаемыми характеристиками. Герман Мюллер обнаружил в 1927 году , что рентгеновские лучи могут вызывать генетические мутации в плодовых мухах , [6] и продолжал использовать мутант он создал для своих исследований в области генетики . [7] Для Escherichia coli мутанты могут быть отобраны сначала путем воздействия УФ-излучения, а затем высеяны на агаризованную среду. Образованные колонии затем помещают в реплики , по одной вбогатая среда , другая - минимальная среда, и мутанты, у которых есть особые потребности в питании, могут быть идентифицированы по их неспособности расти в минимальной среде. Подобные процедуры могут повторяться с другими типами ячеек и с другими средами для выбора.

Позже был разработан ряд методов генерации случайных мутаций в определенных белках для скрининга мутантов с интересными или улучшенными свойствами. Эти методы могут включать использование допированных нуклеотидов в синтезе олигонуклеотидов или проведение реакции ПЦР в условиях, которые усиливают неправильное включение нуклеотидов (подверженная ошибкам ПЦР), например, путем снижения точности репликации или использования аналогов нуклеотидов. [8] Разновидностью этого метода интеграции непредвзятых мутаций в гене является мутагенез с насыщением последовательности . [9] Продукты ПЦР, содержащие мутации, затем клонируются ввектор экспрессии и полученные мутантные белки могут быть затем охарактеризованы.

В опытах на животных, алкилирующие агенты , такие как N - этил - N -nitrosourea (ЕНУ), были использованы для создания мутантных мышей. [10] [11] Этилметансульфонат (EMS) также часто используется для создания мутантов животных, растений и вирусов. [12] [13] [14]

В соответствии с законом Европейского Союза (в виде директивы 2001/18) этот вид мутагенеза может использоваться для производства ГМО, но продукты освобождены от регулирования: без маркировки, без оценки. [15]

Сайт-направленный мутагенез [ править ]

Основная статья: Сайт-направленный мутагенез

До разработки методов сайт-направленного мутагенеза все сделанные мутации были случайными, и ученым приходилось использовать отбор по желаемому фенотипу, чтобы найти желаемую мутацию. Методики случайного мутагенеза имеют преимущество с точки зрения того, сколько мутаций может быть произведено; однако, хотя случайный мутагенез может приводить к изменению отдельных нуклеотидов, он не дает особого контроля над тем, какой нуклеотид изменяется. [5] Поэтому многие исследователи стремятся внести отдельные изменения в ДНК точным, специфичным для сайта образом. Ранние попытки использования аналогов нуклеотидов и других химических веществ были впервые использованы для создания локализованных точечных мутаций . [16] К таким химическим веществам относится аминопурин , который вызывает АТ в ГХ.переход , [17] в то время как нитрозогуанидин, [18] бисульфит , [19] и N 4 -гидроксицитидин могут вызывать переход GC в AT. [20] [21] Эти методы позволяют встраивать специфические мутации в белок; однако они не являются гибкими в отношении типов генерируемых мутантов, и они не столь специфичны, как более поздние методы сайт-направленного мутагенеза, и поэтому обладают некоторой степенью случайности. Другие технологии, такие как расщепление ДНК на определенных участках хромосомы, добавление новых нуклеотидов и обмен парами оснований, теперь позволяют решать, куда могут идти мутации. [11] [8]

Упрощенная схема сайт-направленного мутагенного метода с использованием готовых олигонуклеотидов в реакции удлинения праймера с ДНК-полимеразой

Современные методы сайт-специфической мутации происходят от метода удлинения праймера, разработанного в 1978 году. Такие методы обычно включают использование предварительно изготовленных мутагенных олигонуклеотидов в реакции удлинения праймера с ДНК-полимеразой . Эти методы позволяют точечную мутацию, делецию или вставку небольших участков ДНК в определенные участки. Достижения в методологии сделали такой мутагенез теперь относительно простым и эффективным процессом. [3]

Постоянно разрабатываются новые и более эффективные методы сайт-направленного мутагенеза. Например, метод, называемый «экстрактом клонирования с бесшовным лигированием» (или сокращенно SLiCE), позволяет клонировать определенные последовательности ДНК в геноме, и в геном можно вставить более одного фрагмента ДНК одновременно. [2]

Сайт-направленный мутагенез позволяет исследовать эффект конкретной мутации. Есть множество применений; например, его использовали для определения степени восприимчивости определенных видов к химическим веществам, которые часто используются в лабораториях. В эксперименте использовался сайт-направленный мутагенез, чтобы имитировать ожидаемые мутации конкретного химического вещества. Мутация привела к изменению определенных аминокислот, и влияние этой мутации было проанализировано. [3]

Мутагенез с насыщением сайта - это тип сайт-направленного мутагенеза. На этом изображении показан мутагенез насыщения в одном положении теоретического белка с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже.

Сайт-направленный подход может применяться систематически с использованием таких методов, как мутагенез с аланиновым сканированием , при котором остатки систематически мутируют в аланин , чтобы идентифицировать остатки, важные для структуры или функции белка. [22] Другим комплексным подходом является мутагенез с насыщением сайта, при котором один кодон или набор кодонов могут быть заменены всеми возможными аминокислотами в определенных положениях. [23] [24]

Комбинаторный мутагенез [ править ]

Комбинаторный мутагенез - это метод сайт-направленной инженерии белка, с помощью которого можно одновременно создавать несколько мутантов белка на основе анализа эффектов дополнительных индивидуальных мутаций. [25] Это полезный метод оценки комбинаторного эффекта большого количества мутаций на функцию белков. [26] Большое количество мутантов может быть проверено на предмет конкретной характеристики с помощью комбинаторного анализа. [25] В этом методе множественные положения или короткие последовательности вдоль цепи ДНК могут быть полностью изменены для получения всеобъемлющей библиотеки мутантных белков. [25]Частоту встречаемости полезных вариантов можно повысить с помощью различных методов построения библиотек мутагенеза. Один из подходов к этой методике заключается в извлечении и замене части последовательности ДНК библиотекой последовательностей, содержащей все возможные комбинации в желаемом сайте мутации. Содержимое вставленного сегмента может включать последовательности, имеющие структурное значение, иммуногенные свойства или ферментативную функцию. Сегмент также может быть вставлен в ген случайным образом для оценки структурной или функциональной значимости конкретной части белка. [25]

Вставной мутагенез [ править ]

Дополнительная информация: Мутагенез с сигнатурной меткой и мутагенез транспозонов

Встраивание одной или нескольких пар оснований, приводящее к мутациям ДНК, также известно как инсерционный мутагенез. [27] Такие искусственно созданные мутации могут предоставить важную информацию в исследованиях рака, например, понимание механизмов развития болезни. Ретровирусы и транспозоны - главные инструменты инсерционного мутагенеза. Ретровирусы, такие как вирус опухоли молочной железы мыши и вирус лейкемии мышей, можно использовать для идентификации генов, участвующих в канцерогенезе, и понимания биологических путей конкретных видов рака. [28] Транспозоны, хромосомные сегменты, которые могут подвергаться транспозиции, могут быть разработаны и применены для инсерционного мутагенеза в качестве инструмента для открытия генов рака. [28]Эти хромосомные сегменты позволяют применять инсерционный мутагенез практически к любой ткани по выбору, а также обеспечивают более полное и беспристрастное секвенирование ДНК. [28]

Исследователи обнаружили четыре механизма инсерционного мутагенеза, которые можно использовать на людях. первый механизм называется вставкой энхансера. Энхансеры усиливают транскрипцию определенного гена, взаимодействуя с промотором этого гена. Этот конкретный механизм был впервые использован для помощи пациентам с тяжелым иммунодефицитом, в которых мне нужен костный мозг. Затем пациентам вводили гаммаретровирусы, несущие усилители. Второй механизм называется вставкой промотора. Промоторы предоставляют нашим клеткам определенные последовательности, необходимые для начала трансляции. Введение промотора помогло исследователям узнать больше о вирусе ВИЧ. Третий механизм - инактивация гена.Примером инактивации гена является использование инсерционного мутагенеза для вставки ретровируса, который разрушает геном Т-лимфоцитов у пациентов с лейкемией, и предоставления им специфического антигена под названием CAR, позволяющего Т-клеткам нацеливаться на раковые клетки. Последний механизм называется заменой 3'-конца мРНК. Наши гены иногда претерпевают точечные мутации, вызывающие бета-талассемию, которая нарушает функцию красных кровяных телец. Чтобы решить эту проблему, вводится правильная последовательность гена для красных кровяных телец и производится замена.Чтобы решить эту проблему, вводится правильная последовательность гена для красных кровяных телец и производится замена.Чтобы решить эту проблему, вводится правильная последовательность гена для красных кровяных телец и производится замена.[5]

Гомологичная рекомбинация [ править ]

Гомологичная рекомбинация может использоваться для создания специфической мутации в организме. Вектор, содержащий последовательность ДНК, подобную изменяемому гену, вводится в клетку и в процессе рекомбинации заменяет целевой ген в хромосоме. Этот метод можно использовать для введения мутации или нокаута гена, например, при получении мышей с нокаутом . [29]

CRISPR [ править ]

Основная статья: редактирование генов CRISPR

С 2013 года разработка технологии CRISPR -Cas9 позволила эффективно вводить различные типы мутаций в геном самых разных организмов. Для этого метода не требуется сайт вставки транспозона, он не оставляет маркера, а его эффективность и простота сделали его предпочтительным методом редактирования генома . [30] [31]

Синтез генов [ править ]

Поскольку стоимость синтеза ДНК-олигонуклеотидов падает, искусственный синтез полного гена в настоящее время является жизнеспособным методом введения мутаций в ген. Этот метод допускает обширную мутацию в нескольких сайтах, включая полную переработку использования кодонов в гене, чтобы оптимизировать его для конкретного организма. [32]

См. Также [ править ]

  • Генная инженерия
  • Oncomouse
  • Насыщенный мутагенез
  • Направленная эволюция

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии» . Cell . 157 (6): 1262–78. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.05.010 . PMC  4343198 . PMID  24906146 .
  2. ^ a b Мотохаши К. (июнь 2015 г.). «Простой и эффективный метод бесшовного клонирования ДНК с использованием SLiCE из лабораторных штаммов Escherichia coli и его применение для сайт-направленного мутагенеза SLiP» . BMC Biotechnology . 15 : 47. DOI : 10,1186 / s12896-015-0162-8 . PMC 4453199 . PMID 26037246 .  
  3. ^ a b c Деринг Дж. А., Ли С., Кристиансен К., Эвенсет Л., Бэррон М. Г., Силте I, Лалоне, Калифорния (ноябрь 2018 г.). «Сайт-направленный мутагенез In Silico информирует видоспецифичные прогнозы химической восприимчивости, полученные на основе выравнивания последовательностей для прогнозирования межвидовой восприимчивости (SeqAPASS)» . Токсикологические науки . 166 (1): 131–145. DOI : 10.1093 / toxsci / kfy186 . PMC 6390969 . PMID 30060110 .  
  4. ↑ Choi GC, Zhou P, Yuen CT, Chan BK, Xu F, Bao S и др. (Август 2019 г.). «Комбинаторный мутагенез в массе оптимизирует деятельность по редактированию генома SpCas9». Методы природы . 16 (8): 722–730. DOI : 10.1038 / s41592-019-0473-0 . PMID 31308554 . 
  5. ^ a b c Bushman FD (февраль 2020 г.). «Ретровирусный инсерционный мутагенез у людей: данные о четырех генетических механизмах, способствующих расширению клеточных клонов» . Молекулярная терапия . 28 (2): 352–356. DOI : 10.1016 / j.ymthe.2019.12.009 . PMC 7001082 . PMID 31951833 .  
  6. ^ Мюллер HJ (июль 1927). «Искусственная трансмутация гена» (PDF) . Наука . 66 (1699): 84–7. Bibcode : 1927Sci .... 66 ... 84M . DOI : 10.1126 / science.66.1699.84 . PMID 17802387 .  
  7. ^ Crow JF, Abrahamson S (декабрь 1997). «Семьдесят лет назад: мутация становится экспериментальной» . Генетика . 147 (4): 1491–6. PMC 1208325 . PMID 9409815 .  
  8. ^ a b Блэкберн GM, изд. (2006). Нуклеиновые кислоты в химии и биологии (3-е изд.). Королевское химическое общество. С. 191–192. ISBN 978-0854046546.
  9. Перейти ↑ Wong TS, Tee KL, Hauer B, Schwaneberg U (февраль 2004 г.). «Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM): новый метод направленной эволюции» . Исследования нуклеиновых кислот . 32 (3): 26e – 26. DOI : 10.1093 / NAR / gnh028 . PMC 373423 . PMID 14872057 .  
  10. ^ Справедливость MJ, Noveroske JK, Вебер JS, Чжэн B, Брэдли A (1999). «Мутагенез ENU мыши» . Молекулярная генетика человека . 8 (10): 1955–63. DOI : 10.1093 / HMG / 8.10.1955 . PMID 10469849 . 
  11. ^ a b Hrabé de Angelis M, Balling R (май 1998 г.). «Крупномасштабные экраны ENU в мышах: генетика встречается с геномикой». Мутационные исследования . 400 (1–2): 25–32. DOI : 10.1016 / s0027-5107 (98) 00061-X . PMID 9685575 . 
  12. ^ Flibotte S, Edgley ML, Chaudhry I, Taylor J, Neil SE, Rogula A и др. (Июнь 2010 г.). «Полногеномное профилирование мутагенеза у Caenorhabditis elegans» . Генетика . 185 (2): 431–41. DOI : 10.1534 / genetics.110.116616 . PMC 2881127 . PMID 20439774 .  
  13. ^ Bokel C (2008). Скрининг EMS: от мутагенеза до скрининга и картирования . Методы молекулярной биологии. 420 . С. 119–38. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-583-1_7 . PMID 18641944 . 
  14. ^ Favor AH, Льянос CD, MD, Youngblut Bardales JA (2020). «Оптимизация инженерии бактериофагов с помощью платформы ускоренной эволюции» . Научные отчеты . 10 : 1–10. DOI : 10.1038 / s41598-020-70841-1 . PMC 7438504 . PMID 32814789 .  
  15. ^ Krinke C (март 2018). «Директива по ГМО: истоки исключения мутагенеза» . Inf'OGM .
  16. ^ Shortle D, DiMaio D, Натанс D (1981). «Направленный мутагенез». Ежегодный обзор генетики . 15 : 265–94. DOI : 10.1146 / annurev.ge.15.120181.001405 . PMID 6279018 . 
  17. ^ Карас IW, MacInnes М.А., Персинг DH, Coffino P, Мартин DW (сентябрь 1982). «Механизм 2-аминопуринового мутагенеза в клетках Т-лимфосаркомы мыши» . Молекулярная и клеточная биология . 2 (9): 1096–103. DOI : 10.1128 / mcb.2.9.1096 . PMC 369902 . PMID 6983647 .  
  18. ↑ McHugh GL, Miller CG (октябрь 1974 г.). «Выделение и характеристика мутантов пролинпептидазы Salmonella typhimurium» . Журнал бактериологии . 120 (1): 364–71. DOI : 10.1128 / JB.120.1.364-371.1974 . PMC 245771 . PMID 4607625 .  
  19. ^ Shortle D, Натанс D (май 1978). «Местный мутагенез: метод создания вирусных мутантов с заменами оснований в предварительно выбранных областях вирусного генома» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (5): 2170–4. Bibcode : 1978PNAS ... 75.2170S . DOI : 10.1073 / pnas.75.5.2170 . PMC 392513 . PMID 209457 .  
  20. ^ Флэйвелл RA, Сабо DL, Bandle EF, Вейсман C (январь 1975). «Сайт-направленный мутагенез: влияние экстрацистронной мутации на распространение РНК бактериофага Qbeta in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (1): 367–71. Полномочный код : 1975PNAS ... 72..367F . DOI : 10.1073 / pnas.72.1.367 . PMC 432306 . PMID 47176 .  
  21. Перейти ↑ Müller W, Weber H, Meyer F, Weissmann C (сентябрь 1978 г.). «Сайт-направленный мутагенез в ДНК: создание точечных мутаций в клонированной бета-глобиновой комплементарной ДНК в положениях, соответствующих аминокислотам со 121 по 123». Журнал молекулярной биологии . 124 (2): 343–58. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (78) 90303-0 . PMID 712841 . 
  22. ^ Ванесса Э. Грей; Рональд Дж. Хауз; Дуглас М. Фаулер (1 сентября 2017 г.). «Анализ данных крупномасштабного мутагенеза для оценки влияния одиночных аминокислотных замен» . Генетика . 207 (1): 53–61. DOI : 10.1534 / genetics.117.300064 . PMC 5586385 . PMID 28751422 .  
  23. ^ Reetz, MT; Carballeira JD (2007). «Итерационный мутагенез насыщения (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Протоколы природы . 2 (4): 891–903. DOI : 10.1038 / nprot.2007.72 . PMID 17446890 . 
  24. ^ Черчионе, Дерек; Лавлак, Кэтрин; Тиллотсон, Эрик Л .; Харбински, Фред; DaSilva, Jen; Келли, Чейз П .; Кестон-Смит, Элиза; Fernandez, Cecilia A .; Myer, Vic E .; Джаярам, ​​Харихаран; Steinberg, Barrett E .; Сюй, Шуан-юн (16 апреля 2020 г.). «Библиотеки SMOOT и индуцированная фагом направленная эволюция Cas9 для создания сниженной активности вне мишени» . PLOS ONE . 15 (4): e0231716. DOI : 10.1371 / journal.pone.0231716 . PMC 7161989 . PMID 32298334 .  
  25. ↑ a b c d Parker AS, Griswold KE, Bailey-Kellogg C (ноябрь 2011 г.). «Оптимизация комбинаторного мутагенеза» . Журнал вычислительной биологии . 18 (11): 1743–56. Bibcode : 2011LNCS.6577..321P . DOI : 10,1089 / cmb.2011.0152 . PMC 5220575 . PMID 21923411 .  
  26. ↑ Choi GC, Zhou P, Yuen CT, Chan BK, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong AS (август 2019). «Комбинаторный мутагенез в массе оптимизирует деятельность по редактированию генома SpCas9». Методы природы . 16 (8): 722–730. DOI : 10.1038 / s41592-019-0473-0 . PMID 31308554 . 
  27. ↑ Uren AG, Kool J, Berns A, van Lohuizen M (ноябрь 2005 г.). «Ретровирусный инсерционный мутагенез: прошлое, настоящее и будущее» . Онкоген . 24 (52): 7656–72. DOI : 10.1038 / sj.onc.1209043 . PMID 16299527 . 
  28. ^ a b c Vassiliou G, Rad R, Bradley A (01.01.2010). Вассарман П.М., Сориано П.М. (ред.). «Использование транспозонов ДНК для открытия гена рака у мышей». Методы в энзимологии . Руководство по методам развития мышей, Часть B: Молекулярная генетика мышей (2-е изд.). Академическая пресса. 477 : 91–106. DOI : 10.1016 / s0076-6879 (10) 77006-3 . ISBN 9780123848802. PMID  20699138 .
  29. ^ «Метод гомологичной рекомбинации (и нокаут-мышь)» . Колледж Дэвидсона .
  30. ^ Дэмиен Био-Пеллетье; Винсент Дж. Дж. Мартин (2016). «Бесшовный сайт-направленный мутагенез генома Saccharomyces cerevisiae с использованием CRISPR-Cas9» . Журнал биологической инженерии . 10 : 6. DOI : 10,1186 / s13036-016-0028-1 . PMC 4850645 . PMID 27134651 .  
  31. ↑ Xu S (20 августа 2015 г.). «Применение редактирования генома CRISPR-Cas9 у Caenorhabditis elegans» . J Genet Genomics . 42 (8): 413–21. DOI : 10.1016 / j.jgg.2015.06.005 . PMC 4560834 . PMID 26336798 .  
  32. ^ Худяков Ю.Е., Филдс HA, ред. (25 сентября 2002 г.). Искусственная ДНК: методы и приложения . CRC Press. п. 13. ISBN 9781420040166.

Внешние ссылки [ править ]

Библиотечные ресурсы о
мутагенезе
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках