Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из клонирования векторов )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схематическое изображение плазмиды pBR322 , одной из первых плазмид, широко используемых в качестве вектора клонирования.

Клонирование вектор представляет собой небольшой кусок ДНК , который может быть стабильно поддерживать в организме, и в которую фрагмент чужеродной ДНК может быть вставлен для клонирования целей. [1] Вектор клонирования может представлять собой ДНК, взятую из вируса , клетки высшего организма или плазмиды бактерии. Вектор содержит функции , которые позволяют для удобной вставки ДНК - фрагмента в вектор или его удаление из вектора, например , посредством присутствия сайтов рестрикции . Вектор и чужеродную ДНК можно обработать рестрикционным ферментом.который разрезает ДНК, и полученные таким образом фрагменты ДНК содержат либо тупые концы, либо выступы, известные как липкие концы, а векторная ДНК и чужеродная ДНК с совместимыми концами затем могут быть соединены вместе посредством молекулярного лигирования . После того, как фрагмент ДНК был клонирован в вектор клонирования, он может быть дополнительно субклонирован в другой вектор, предназначенный для более специфического использования.

Существует много типов векторов клонирования, но наиболее часто используемые из них - это плазмиды, созданные с помощью генной инженерии . Клонирование обычно сначала выполняется с использованием Escherichia coli , а векторы клонирования в E. coli включают плазмиды, бактериофаги (такие как фаг λ ), космиды и бактериальные искусственные хромосомы (ВАС). Однако некоторая ДНК не может стабильно сохраняться в E. coli , например, очень большие фрагменты ДНК, и могут использоваться другие организмы, такие как дрожжи. Клонирующие векторы в дрожжах включают искусственные хромосомы дрожжей (YAC).

Особенности вектора клонирования [ править ]

Все обычно используемые векторы клонирования в молекулярной биологии имеют ключевые особенности, необходимые для их функции, такие как подходящий сайт клонирования и селективный маркер. Другие могут иметь дополнительные функции, специфичные для их использования. Для простоты и удобства клонирование часто выполняется с использованием кишечной палочки . Таким образом, используемые клонирующие векторы часто имеют элементы, необходимые для их размножения и поддержания в E. coli , такие как функциональный источник репликации (ori). ColE1 начало репликации встречается во многих плазмид. Некоторые векторы также включают элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме в дополнение к E. coli , и эти векторы называются челночными векторами..

Клонирование сайта [ править ]

Все клонирующие векторы обладают функциями, которые позволяют удобно вставлять ген в вектор или удалять из него. Это может быть сайт множественного клонирования (MCS) или полилинкер, который содержит множество уникальных сайтов рестрикции . Сайты рестрикции в MCS сначала расщепляются рестрикционными ферментами, затем целевой ген, усиленный ПЦР , также расщепленный теми же ферментами, лигируется в векторы с использованием ДНК-лигазы . При желании последовательность ДНК-мишени может быть вставлена ​​в вектор в определенном направлении. Сайты рестрикции могут быть дополнительно использованы для субклонирования в другой вектор, если необходимо. [2]

Другие клонирующие векторы могут использовать топоизомеразу вместо лигазы, и клонирование может быть выполнено быстрее без необходимости рестрикционного переваривания вектора или вставки. В этом методе клонирования TOPO линеаризованный вектор активируется путем присоединения топоизомеразы I к его концам, и этот «TOPO-активированный» вектор может затем принимать продукт ПЦР, лигируя оба 5'-конца продукта ПЦР, высвобождая топоизомеразу и образуя круговой вектор в процессе. [3] Другим методом клонирования без использования переваривания ДНК и лигазы является рекомбинация ДНК , например, как это используется в системе клонирования Gateway . [4] [5]Ген, однажды клонированный в клонирующий вектор (называемый в этом методе входным клоном), может быть удобно введен во множество экспрессионных векторов путем рекомбинации. [6]

Выбираемый маркер [ править ]

Селективный маркер осуществляется с помощью вектора , чтобы обеспечить выделение положительно трансформированных клеток. Устойчивость к антибиотикам часто используется в качестве маркера, примером является ген бета-лактамазы , который придает устойчивость к пенициллиновой группе бета-лактамных антибиотиков, таких как ампициллин . Некоторые векторы содержат два селектируемых маркера, например плазмида pACYC177 имеет ген устойчивости как к ампициллину, так и к канамицину . [7] Челночный вектор, который разработан для поддержания в двух разных организмах, может также потребовать двух селектируемых маркеров, хотя некоторые селектируемые маркеры, такие как устойчивость к зеоцинуи гигромицин B эффективны в отношении разных типов клеток. Ауксотрофные селективные маркеры , которые позволяют ауксотрофный организм расти в минимальной среде ростов также может быть использован; примерами их являются LEU2 и URA3, которые используются с соответствующими ауксотрофными штаммами дрожжей. [8]

Другой вид селектируемого маркера позволяет проводить положительный отбор плазмиды с клонированным геном. Это может включать использование гена, летального для клеток-хозяев, такого как барназа , [9] Ccda , [10] и токсины parD / parE . [11] [12] Это обычно работает путем разрушения или удаления летального гена в процессе клонирования, а неудачные клоны, где летальный ген все еще остается нетронутым, убивают клетки-хозяева, поэтому отбираются только успешные клоны.

Репортерный ген [ править ]

Репортерные гены используются в некоторых векторах клонирования для облегчения скрининга успешных клонов за счет использования свойств этих генов, которые позволяют легко идентифицировать успешный клон. Такими признаками, присутствующими в клонирующих векторах, могут быть α-фрагмент lacZ для α-комплементации при сине-белой селекции и / или маркерный ген или репортерные гены в рамке с MCS и фланкирующие MCS для облегчения продукции слитых белков . Примерами партнеров слияния, которые могут использоваться для скрининга, являются зеленый флуоресцентный белок (GFP) и люцифераза .

Элементы для выражения [ править ]

Основная статья: Вектор экспрессии

Вектор клонирования не обязательно должен содержать подходящие элементы для экспрессии клонированного целевого гена, такие как промотор и сайт связывания рибосомы (RBS), однако многие из них содержат и могут затем работать как вектор экспрессии . Целевая ДНК может быть вставлена ​​в сайт, который находится под контролем конкретного промотора, необходимого для экспрессии целевого гена в выбранном хозяине. Если промотор присутствует, экспрессия гена предпочтительно строго контролируется и индуцируется, так что белки продуцируются только тогда, когда это необходимо. Некоторые обычно используемые промоторы являются T7 и лаковые промоторы. Присутствие промотора необходимо при использовании таких методов скрининга, как сине-белый отбор .

Иногда используются клонирующие векторы без промотора и RBS для клонированной последовательности ДНК, например, при клонировании генов, продукты которых токсичны для клеток E. coli . Промотор и RBS для клонированной последовательности ДНК также не нужны при первом создании библиотеки клонов геномной или кДНК, поскольку клонированные гены обычно субклонируются в более подходящий вектор экспрессии, если требуется их экспрессия.

Некоторые векторы предназначены только для транскрипции без экспрессии гетерологичного белка, например, для продукции мРНК in vitro . Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для продукции белка.

Типы клонирующих векторов [ править ]

Доступно большое количество векторов клонирования, и выбор вектора может зависеть от ряда факторов, таких как размер вставки, количество копий и метод клонирования. Большая вставка может не сохраняться стабильно в общем векторе клонирования, особенно для тех, которые имеют большое количество копий, поэтому для клонирования больших фрагментов может потребоваться более специализированный вектор клонирования. [13]

Плазмида pUC имеет большое количество копий, содержит сайт множественного клонирования (полилинкер), ген для выбора антибиотика ампициллина и может использоваться для сине-белого экрана.

Плазмид [ править ]

Основная статья: плазмидный вектор

Плазмиды автономно реплицируют кольцевую внехромосомную ДНК. Это стандартные и наиболее часто используемые векторы клонирования. Большинство обычных плазмид можно использовать для клонирования вставки ДНК размером до 15 т.п.н. Одним из наиболее ранних широко используемых векторов клонирования является плазмида pBR322 . Другие клонирующие векторы включают PUC ряд плазмид, а также большое количество различных Клонирование плазмидных векторов имеются. Многие плазмиды имеют высокое число копий, например pUC19, у которого число копий составляет 500-700 копий на клетку [14].и высокое число копий полезно, поскольку оно дает больший выход рекомбинантной плазмиды для последующих манипуляций. Однако плазмиды с низким числом копий могут предпочтительно использоваться в определенных обстоятельствах, например, когда белок из клонированного гена токсичен для клеток. [15]

Некоторые плазмиды содержат ориджин репликации бактериофага M13 и могут использоваться для создания одноцепочечной ДНК. Они называются фагемидами , и их примерами являются серии клонирующих векторов pBluescript .

Бактериофаг [ править ]

Бактериофаги , используемые для клонирования являются λ фага и M13 фага . Существует верхний предел количества ДНК, которое может быть упаковано в фаг (максимум 53 т.п.н.), поэтому, чтобы позволить встраивать чужеродную ДНК в ДНК фага, в векторах клонирования фага может потребоваться удаление некоторых несущественных генов. , например гены лизогении, поскольку использование фага λ в качестве вектора клонирования включает только литический цикл. [16] Есть два типа λ-фаговых векторов - вектор вставки и вектор замены. Инсерционные векторы содержат уникальный сайт расщепления, посредством которого может быть вставлена ​​чужеродная ДНК размером 5–11 т.п.н. В замещающих векторах сайты расщепления фланкируют область, содержащую гены, не существенные для литического цикла, и эта область может быть удалена и заменена вставкой ДНК в процессе клонирования, а также может быть вставлена ​​ДНК большего размера размером 8–24 т.п. [17]

Существует также более низкий предел размера ДНК, которая может быть упакована в фаг, а векторная ДНК, которая слишком мала, не может быть должным образом упакована в фаг. Это свойство можно использовать для выделения - вектор без вставки может быть слишком маленьким, поэтому для распространения могут быть выбраны только векторы с вставкой. [18]

Космид [ править ]

Космиды - это плазмиды, которые включают в себя сегмент ДНК бактериофага λ, имеющий когезионный концевой сайт ( cos ), который содержит элементы, необходимые для упаковки ДНК в частицы λ. Обычно он используется для клонирования больших фрагментов ДНК размером от 28 до 45 килобайт. [13]

Бактериальная искусственная хромосома [ править ]

Вставка размером до 350 т.п.н. может быть клонирована в бактериальную искусственную хромосому (ВАС). BAC поддерживаются в E. coli с числом копий только 1 на клетку. [17] ВАС основаны на плазмиде F , другая искусственная хромосома, называемая РАС , основана на фаге P1 .

Искусственная хромосома дрожжей [ править ]

Искусственные хромосомы дрожжей используются в качестве векторов для клонирования фрагментов ДНК размером более 1 мега оснований (1Mb = 1000kb). Они полезны для клонирования более крупных фрагментов ДНК, необходимых для картирования геномов, например, в проекте генома человека. Он содержит теломерную последовательность, автономно реплицирующуюся последовательность (функции, необходимые для репликации линейных хромосом в дрожжевых клетках). Эти векторы также содержат подходящие сайты рестрикции для клонирования чужеродной ДНК, а также гены, которые будут использоваться в качестве селектируемых маркеров.

Искусственная хромосома человека [ править ]

Искусственная хромосома человека может быть потенциально полезной в качестве векторов для переноса генов для доставки генов в клетки человека, а также в качестве инструмента для исследований экспрессии и определения функции хромосомы человека. Он может нести очень большой фрагмент ДНК (для практических целей нет верхнего предела размера), поэтому он не имеет проблемы ограниченной способности клонирования других векторов, а также позволяет избежать возможного инсерционного мутагенеза, вызванного интеграцией в хромосомы хозяина вирусами. вектор. [19] [20]

Вирусные векторы животных и растений Вирусы, инфицирующие клетки растений и животных, также подвергались манипуляции для введения чужеродных генов в клетки растений и животных. Естественная способность вирусов адсорбироваться на клетках, вводить свою ДНК и воспроизводиться сделала их идеальными носителями для переноса чужеродной ДНК в эукариотические клетки в культуре. Вектор на основе обезьяньего вируса 40 (SV40) был использован в первом эксперименте по клонированию с участием клеток млекопитающих. Ряд векторов, основанных на других типах вирусов, таких как аденовирусы и вирус папилломы, был использован для клонирования генов у млекопитающих. В настоящее время популярны ретровирусные векторы для клонирования генов в клетки млекопитающих. В случае таких растений, как вирус мозаики цветной капусты, вирус мозаики табака и вирусы Близнецов, были использованы с ограниченным успехом.

Чашка с агаром LB показывает результат сине-белого экрана. Белые колонии могут содержать вставку в несущую плазмиду, а синие - неудачные клоны.

Скрининг: пример синего / белого экрана [ править ]

Основная статья: Синий белый экран

Многие векторы общего назначения, такие как pUC19, обычно включают систему для обнаружения присутствия клонированного фрагмента ДНК на основе потери легко оцениваемого фенотипа. Наиболее широко используется ген, кодирующий β-галактозидазу E. coli , активность которого можно легко определить по способности кодируемого фермента гидролизовать растворимый бесцветный субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3 -индолил-бета-d-галактозид) в нерастворимый голубой продукт (5,5'-дибром-4,4'-дихлориндиго). Клонирование фрагмента ДНК в векторной lacZαпоследовательность β-галактозидазы предотвращает выработку активного фермента. Если X-gal включен в чашки с селективным агаром, колонии трансформантов обычно имеют синий цвет в случае вектора без вставленной ДНК и белый цвет в случае вектора, содержащего фрагмент клонированной ДНК.

См. Также [ править ]

  • Вектор (молекулярная биология)
  • Вектор трансформации растений
  • ИЗОБРАЖЕНИЕ клонов кДНК
  • фосмид
  • Клонирование Золотых Ворот

Ссылки [ править ]

  1. ^ "Определение вектора клонирования" . Словарь генома . Проверено 18 октября 2012 .
  2. ^ Горман; и другие. (2015). «Адаптивность и воспроизводимость альтернативных сайтов сплайсинга и рестрикции в дифференциальных векторах клонирования: исследование и обзор литературы». Журнал биомолекулярной технологии . 30 (19): 120–142.
  3. ^ «Технология клонирования TOPO®» . Invitrogen .
  4. ^ Эспозито D, Гарви LA, Chakiath CS (2009). «Шлюз клонирования для экспрессии белка» . Высокопроизводительная экспрессия и очистка белков . Методы молекулярной биологии. 498 . С.  31–54 . DOI : 10.1007 / 978-1-59745-196-3_3 . ISBN 978-1-58829-879-9. PMID  18988017 .
  5. ^ «Методы клонирования - системы клонирования рекомбинации» . EMBL .
  6. ^ "Технология клонирования рекомбинации Gateway®" . Invitrogen .
  7. ^ Никола Казали; Эндрю Престон (2003).Плазмидные векторы E. coli . Методы молекулярной биологии. 235 . п. 23. ISBN 978-1-58829-151-6.
  8. Перейти ↑ Romanos MA, Scorer CA, Clare JJ (1992). «Экспрессия чужеродных генов в дрожжах: обзор» (PDF) . Дрожжи . 8 (6): 423–88. DOI : 10.1002 / yea.320080602 . PMID 1502852 . S2CID 15674832 .   
  9. ^ Yazynin С.А., Деев С.М., Jucovic M, Хартли RW (1996). «Плазмидный вектор с положительной селекцией и направленным клонированием на основе условно летального гена» . Джин . 169 (1): 131–2. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00814-4 . PMID 8635737 . 
  10. ^ Филипп Бернар (1996). «Положительный отбор рекомбинантной ДНК по CcdB» (PDF) . Биотехнологии . 21 (2): 320–323. DOI : 10.2144 / 96212pf01 . PMID 8862819 . Архивировано из оригинального (PDF) 16 мая 2017 года . Проверено 14 октября 2013 .  
  11. ^ Gabant Р, Ван Reeth Т, Dreze PL, Faelen М, Szpirer С, Szpirer J (2000). «Новая система позитивной селекции на основе системы parD (kis / kid) плазмиды R1». Биотехнологии . 28 (4): 784–8. PMID 10769758 . 
  12. ^ Ким HG, Ким HS, Hwang HJ, Chung SK, Lee JM, Chung DK (2004). «Конструирование вектора pTOC-T с использованием токсина GST-ParE для прямого клонирования и отбора продуктов ПЦР». Письма о биотехнологии . 26 (21): 1659–63. DOI : 10.1007 / s10529-004-3518-Z . PMID 15604816 . S2CID 10312859 .  
  13. ^ а б Эндрю Престон (2003-07-03). Плазмидные векторы E. coli . Методы молекулярной биологии. 235 . С. 19–20. ISBN 978-1-58829-151-6.
  14. ^ Никола Казали; Эндрю Престон (2003). Плазмидные векторы E. Coli: методы и применение . Humn Press. п. 22 . ISBN 978-1588291516.
  15. ^ "Копировать номер" . Генетика Институт, Inc . Архивировано из оригинала на 2013-04-19 . Проверено 6 марта 2013 .
  16. ^ Б. Р. Глик; JJ Пастернак (2005). Принципы молекулярной биотехнологии и применения рекомбинантной ДНК (3-е изд.). ASM Press. ISBN 9781555816124.
  17. ^ а б Эндрю Престон (2003-07-03).Плазмидные векторы E. coli (PDF) . Методы молекулярной биологии. 235 . С. 21–22. ISBN 978-1-58829-151-6.
  18. ^ ТА Браун (2010-04-19). Клонирование генов и анализ ДНК: Введение . Вили-Блэквелл. п. 100. ISBN 978-1444334074.
  19. ^ Ким И. Н., Кононенко А, Erliandri я, Ким Т.А., Накано М, Иида Y, Барретта JC, Oshimura М, Масумото Н, Ирншоу туалет, Ларионов В, Kouprina Н (13 декабря 2011). «Вектор искусственной хромосомы человека (HAC) с условной центромерой для коррекции генетических дефектов в клетках человека» . Proc Natl Acad Sci USA . 108 (50): 20048–53. Bibcode : 2011PNAS..10820048K . DOI : 10.1073 / pnas.1114483108 . PMC 3250132 . PMID 22123967 .  
  20. ^ Kouprina N, Ирншоу туалет, Масумото Н, Ларионов В (2013). «Новое поколение искусственных хромосом человека для функциональной геномики и генной терапии» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 70 (7): 1135–48. DOI : 10.1007 / s00018-012-1113-3 . PMC 3522797 . PMID 22907415 .