Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из Cosmids )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Космиды представляет собой тип гибридной плазмиды , которая содержит фага лямбда сов последовательности. [1] Их часто используют в качестве вектора клонирования в генной инженерии . Космиды можно использовать для создания геномных библиотек . Впервые они были описаны Коллинзом и Хоном в 1978 году. [2] Космиды могут содержать от 37 до 52 (обычно 45) т.п.н. ДНК, пределы основаны на нормальном размере упаковки бактериофага. Они могут реплицироваться в виде плазмид, если они имеют подходящую точку начала репликации (ori): например, SV40 ori в клетках млекопитающих, ColE1ori для репликации двухцепочечной ДНК или f1 ori для репликации одноцепочечной ДНК в прокариотах . Они часто также содержат ген селекции, такой как устойчивость к антибиотикам , так что трансформированные клетки можно идентифицировать путем посева на среду, содержащую антибиотик. Те клетки, которые не захватили космиду, не смогли бы расти. [3]

В отличие от плазмид, они также могут быть упакованы in vitro в фаговые капсиды , этап, на котором требуются когезионные концы , также известные как сайты cos, также используемые при клонировании с фагом лямбда в качестве вектора, однако почти все гены лямбда были удалены, за исключением из сов последовательности. Гибридная космидная ДНК в капсидах затем может быть перенесена в бактериальные клетки путем трансдукции.. Поскольку существует потребность в упаковке in vitro, при которой требуется по крайней мере 38 т.п.н. ДНК между сайтами cos, вектор без ДНК вставки не будет упакован (нестабильность плазмид увеличивается, если новая вставленная ДНК содержит много прямых повторов или палиндромных (инвертированных) повторов) ДНК. Этой нестабильности можно в значительной степени противодействовать, используя бактерию-хозяин со специфическими мутациями, влияющими на рекомбинацию ДНК (NB. Отсутствие инвертированных повторов было отмечено в первой цитированной выше публикации Hohn & Collins; см. также [4] ).

Последовательности Cos [ править ]

Последовательности Cos имеют длину ~ 200 пар оснований и необходимы для упаковки. Они содержат сайт cosN, где ДНК разрывается на каждой цепи на расстоянии 12 п.н., с помощью терминазы . Это вызывает линеаризацию кругового космида с двумя «связными» или «липкими концами» по 12 п.н. (ДНК должна быть линейной, чтобы соответствовать головке фага.) Сайт cosB удерживает терминазу, пока она надрезает и разделяет нити. Сайт cosQ следующей космиды (поскольку репликация по катящемуся кругу часто приводит к линейным конкатемерам ) удерживается терминазой после того, как предыдущая космида была упакована, чтобы предотвратить деградацию клеточными ДНКазами .

Особенности и использование Cosmid [ править ]

Схема клонирования ДНК в космидном векторе.

Космиды - это преимущественно плазмиды с бактериальным oriV , маркером селекции антибиотика и сайтом клонирования, но они несут один или, в последнее время, два сайта cos, происходящие от лямбда бактериофага. В зависимости от конкретной цели эксперимента доступны космиды широкого круга хозяев, космиды челноков или космиды «млекопитающих» (связанные с SV40 oriV и маркерами селекции млекопитающих). Нагрузочная способность космид варьируется в зависимости от размера самого вектора, но обычно составляет около 40–45 кб. Процедура клонирования включает создание двух векторных ветвей, которые затем присоединяются к чужеродной ДНК. Отбор против космидной ДНК дикого типа просто осуществляется путем исключения размера. Следовательно, космиды всегда образуют колонии, а не бляшки. Также плотность клонов намного ниже - около 10 5 - 10.6 КОЕ на мкг лигированной ДНК.

После создания библиотек рекомбинантных лямбда или космид общая ДНК переносится в подходящего хозяина E. coli с помощью метода, называемого упаковкой in vitro. Необходимые упаковочные экстракты получают из лизогенов E. coli cI857 (red-gam-Sam и Dam (головной узел) и Eam (хвостовой узел) соответственно). Эти экстракты распознают и упаковывают рекомбинантные молекулы in vitro., генерируя либо зрелые фаговые частицы (векторы на основе лямбда), либо рекомбинантные плазмиды, содержащиеся в фаговых оболочках (космиды). Эти различия отражаются в различной частоте инфицирования, наблюдаемой в пользу векторов с заменой лямбда. Это компенсирует их немного меньшую грузоподъемность. Библиотеки фагов также легче хранить и проверять, чем библиотеки космид.

Целевая ДНК: клонируемая геномная ДНК должна быть разрезана на рестрикционные фрагменты соответствующего размера. Обычно это делается путем частичного ограничения с последующим фракционированием по размеру или дефосфорилированием (с использованием фосфатазы из кишечника теленка), чтобы избежать скремблирования хромосом, то есть лигирования физически несвязанных фрагментов.

Примеры космидных векторов [ править ]

Обычно используемые векторы включают "SuperCos 1".

Ссылки [ править ]

  1. ^ Хон B, Мюррей K (август 1977). «Упаковка рекомбинантных молекул ДНК в частицы бактериофага in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (8): 3259–63. Bibcode : 1977PNAS ... 74.3259H . DOI : 10.1073 / pnas.74.8.3259 . PMC  431522 . PMID  333431 .
  2. ^ Collins J, Хон B (сентябрь 1978). «Космиды: тип вектора клонирования плазмидного гена, который упаковывается in vitro в лямбда-головки бактериофага» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (9): 4242–6. Bibcode : 1978PNAS ... 75.4242C . DOI : 10.1073 / pnas.75.9.4242 . PMC 336088 . PMID 360212 .  
  3. ^ "Космиды" . Филипп МакКлин . Проверено 4 апреля 2014 года .
  4. Перейти ↑ Collins J (1981). «Нестабильность палиндромной ДНК у Escherichia coli». Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии . 45 Пет 1: 409–16. DOI : 10.1101 / SQB.1981.045.01.055 . PMID 6271486 . 

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Страйер, Люберт (1995) Биохимия, 4-е изд. ISBN 0-7167-2009-4 
  • Коллекция Eurekah Biosciences: вирусы, @NCBI