Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Схематическое изображение вектора pBR322 с сайтами рестрикции, указанными синим цветом.

pBR322 представляет собой плазмиду и была одним из первых широко используемых векторов клонирования E. coli . Созданный в 1977 году в лаборатории Герберта Бойера в Калифорнийском университете в Сан-Франциско , он был назван в честь Франсиско Боливара Сапаты , доктора наук, исследователя и Раймонда Л. Родригеса. Буква p означает «плазмида», а BR - «Боливар» и «Родригес».

pBR322 имеет длину 4361 пару оснований [1] и имеет два гена устойчивости к антибиотикам - ген bla, кодирующий белок устойчивости к ампициллину (Amp R ) , и ген tetA, кодирующий белок устойчивости к тетрациклину (Tet R ). Он содержит источник репликации pMB1 и ген rop , который кодирует ограничитель числа копий плазмиды. Плазмида имеет уникальные сайты рестрикции для более чем сорока рестрикционных ферментов . Одиннадцать из этих сорока сайтов находятся в пределах Tet Rген. Есть два сайта для ферментов рестрикции HindIII и ClaI в пределах промотора от Tet R гену. Внутри гена Amp R имеется шесть ключевых сайтов рестрикции . [2]

Кольцевая последовательность пронумерована так, что 0 - это середина уникального сайта EcoRI, а количество увеличивается за счет гена Tet R. Ген Amp R представляет собой бета-лактамазу пенициллина . Промоторы P1 и P3 предназначены для гена бета-лактамазы. P3 является естественным промотором, а P1 создается искусственно путем лигирования двух разных фрагментов ДНК для создания pBR322. P2 находится в той же области, что и P1, но на противоположной цепи и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину. [3]

Фон [ править ]

Ранние эксперименты по клонированию могут быть проведены с использованием природных плазмид, таких как ColE1 и pSC101 . Каждая из этих плазмид может иметь свои преимущества и недостатки. Например, плазмида ColE1 и ее производные обладают преимуществом более высокого числа копий и позволяют амплификацию плазмиды хлорамфениколом для получения плазмиды с высоким выходом, однако скрининг на иммунитет к колицину E1 технически непрост . [4] Плазмида pSC101, природная плазмида из Salmonella panama , [5] дает тетрациклинрезистентность, которая позволяет упростить процесс скрининга с отбором антибиотика, но это плазмида с низким числом копий, которая не дает высокого выхода плазмиды. Другая плазмида, RSF 2124, которая является производной ColE1, придает устойчивость к ампициллину, но более крупная.

Многие другие плазмиды были искусственно сконструированы для создания такой, которая была бы идеальной для целей клонирования, и pBR322 был признан многими наиболее универсальным и поэтому был наиболее широко используемым. [4] Он имеет два гена устойчивости к антибиотикам в качестве селективных маркеров и ряд удобных уникальных сайтов рестрикции, которые сделали его пригодным в качестве вектора для клонирования . Плазмида была сконструирована из генетического материала из трех основных источников - гена устойчивости к тетрациклину pSC101, гена устойчивости к ампициллину RSF 2124 и элементов репликации pMB1, близкого родственника плазмиды ColE1 . [6] [7]

С тех пор было сконструировано большое количество других плазмид на основе pBR322, специально разработанных для самых разных целей. [8] [9] Примеры включают PUC серии плазмид. [10] Большинство экспрессионных векторов для экспрессии внехромосомных белков и челночных векторов содержат точку начала репликации pBR322, а фрагменты pBR322 очень популярны при конструировании внутривидовых челночных или бинарных векторов и векторов для направленной интеграции и удаления ДНК из хромосомы. [11]

Последовательность ДНК [ править ]

Последовательность в pBR322 [3]

pBR322
 1 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaappa 61 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 121 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 181 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 241 tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 301 ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 361 cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 421 agtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 481 cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 541 actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 601 caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 661 gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 721 cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 781 ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 841 tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 901 acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt 961 cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc 1021 cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca 1081 tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc 1141 gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat 1201 tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg 1261 ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga 1321 attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac 1381 atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg 1441 tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg 1501 ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc 1561 tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg 1621 taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca 1681 ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga 1741 ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa 1801 cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt 1861 ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc 1921 год aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt 1981 ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac 2041 gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 2101 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 2161 agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 2221 cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 2281 Tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 2341 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 2401 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 2461 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 2521 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 2581 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 2641 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 2701 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 2761 agtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2821 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 2881 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 2941 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3001 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3061 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 3121 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3181 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 3241 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 3301 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 3361 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 3421 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 3481 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 3541 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 3601 ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 3661 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 3721 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 3781 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 3841 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 3901 cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 3961 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 4021 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatctttactttcacc agcgtttctg 4081 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 4141 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 4201 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 4261 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 4321 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga a

См. Также [ править ]

  • Список сайтов разрезания рестрикционных ферментов

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Watson, N. (1988). «Новая ревизия последовательности плазмиды pBR322». Джин . 70 (2): 399–403. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (88) 90212-0 . PMID  3063608 .
  2. ^ Балбас Р, Soberon Х, меринос Е, Зурит М, Lomeli Н, Р Валл, Флорес N, Боливар F (1986). «Плазмидный вектор pBR322 и его производные специального назначения - обзор». Джин . 50 (1–3): 3–40. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (86) 90307-0 . PMID 3034735 . 
  3. ^ a b "Нуклеотидные последовательности pBR322, NCBI Sequence Viewer v2.0" .
  4. ^ a b Р. В. Олд и С. Б. Примроуз. Принципы генной манипуляции (5-е изд.). С. 53–61.
  5. ^ Manen D, Caro L (февраль 1991). «Репликация плазмиды pSC101». Мол. Microbiol . 5 (2): 233–7. DOI : 10.1111 / j.1365-2958.1991.tb02103.x . PMID 2041467 . 
  6. ^ Bolivar F, Родригес RL, Betlach MC Бойер HW (1977). «Создание и характеристика новых носителей клонирования. I. Ампициллин-устойчивые производные плазмиды pMB9». Джин . 2 (2): 75–93. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (77) 90074-9 . PMID 344136 . 
  7. ^ Bolivar F, Родригес RL, Greene PJ, MC Betlach, Heyneker HL, Бойер HW, Crosa JH, Falkow S (1977). «Строительство и характеристика новых клонирующих машин. II. Многоцелевая система клонирования». Джин . 2 (2): 95–113. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (77) 90000-2 . PMID 344137 . 
  8. ↑ SB Primrose и RM Twyman (17 января 2006 г.). Принципы манипуляции генами и геномики (PDF) (7-е изд.). Вили-Блэквелл. С. 64–65. ISBN  978-1405135443.
  9. ^ Балбас Р, Soberon Х, меринос Е, Зурит М, Lomeli Н, Р Валл, Флорес N, Боливар F (1986). «Плазмидный вектор pBR322 и его производные специального назначения - обзор». Джин . 50 (1–3): 3–40. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (86) 90307-0 . PMID 3034735 . 
  10. ^ Yanisch-Перрона С, Виейра - J, J Мессинга (1985). «Улучшенные векторы для клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mp18 и pUC19». Джин . 33 (1): 103–19. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (85) 90120-9 . PMID 2985470 . 
  11. ^ Paulina Балбас; Аргелия Лоренс, ред. (Апрель 2004 г.). Экспрессия рекомбинантных генов: обзоры и протоколы (2-е изд.). Humana Press Inc. стр.  77 -85. ISBN 978-1592597741.

Внешние ссылки [ править ]

  • Карта pBR322
  • pBR322 Особенности
  • pBR322 ДНК