Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

RESOLFT , акроним для RE обратимого S aturable O Ptica L F luorescence T ransitions, обозначает группу оптических методов флуоресцентной микроскопии с очень высоким разрешением. Использование стандартной дальнего поля видимого свет оптики разрешение значительно ниже предела дифракции вплоть до молекулярных масштабов может быть получено.

С помощью традиционных методов микроскопии невозможно различить детали, расположенные на расстояниях менее примерно половины используемой длины волны (то есть около 200 нм для видимого света ). Этот дифракционный предел основан на волновой природе света . В обычных микроскопах предел определяется используемой длиной волны и числовой апертурой оптической системы. Концепция RESOLFT преодолевает этот предел, временно переводя молекулы в состояние, в котором они не могут посылать (флуоресцентный) сигнал при освещении. Эта концепция отличается от, например, электронной микроскопии, где вместо этого используется намного меньшая длина волны.

Принцип работы [ править ]

Микроскопия RESOLFT - это оптическая микроскопия с очень высоким разрешением, которая может отображать детали в образцах, которые невозможно получить с помощью традиционной или конфокальной микроскопии . В RESOLFT обобщены принципы STED-микроскопии [1] [2] и GSD-микроскопии . Структуры, которые обычно слишком близки друг к другу, чтобы их можно было различить, считываются последовательно.

В рамках этой структуры могут быть объяснены все методы, которые работают с молекулами, которые имеют по крайней мере два различимых состояния, где возможно обратимое переключение между двумя состояниями и где по крайней мере один такой переход может быть оптически индуцирован.

В большинстве случаев используются флуоресцентные маркеры, когда одно состояние (A) является ярким, то есть генерирует сигнал флуоресценции, а другое состояние (B) является темным и не дает сигнала. Один переход между ними может быть вызван светом (например, A → B, от яркого к темному).

Образец освещается неоднородно, при этом интенсивность освещения в одном месте очень мала (ноль в идеальных условиях). Только в этом месте молекулы никогда не находятся в темном состоянии B (если A - это ранее существовавшее состояние) и остаются полностью в ярком состоянии A. Область, где молекулы в основном находятся в ярком состоянии, можно сделать очень маленькой (меньше чем обычный дифракционный предел) за счет увеличения интенсивности переходного света (см. ниже). Таким образом, известно, что любой обнаруженный сигнал исходит только от молекул в небольшой области вокруг минимума интенсивности освещения. Изображение с высоким разрешением может быть построено путем сканирования образца, т. Е. Смещения профиля освещения по поверхности. [3]

Обратный переход от B к A может быть спонтанным или вызван светом другой длины волны. Молекулы должны переключаться несколько раз, чтобы находиться в состоянии A или B в разное время во время сканирования образца. Этот метод также работает, если поменять местами яркое и темное состояние, тогда получается негативное изображение.

Разрешение ниже дифракционного предела [ править ]

Принцип RESOLFT: образец неоднородно освещен (красная линия). Интенсивность уменьшается в области, сопоставимой с классическим пределом разрешения, но (в идеале) равна нулю только в одной позиции. Пороговая интенсивность (синяя линия), необходимая для переключения молекул в темное состояние, составляет лишь часть максимальной приложенной интенсивности, поэтому только молекулы, очень близкие к положению минимальной интенсивности, могут находиться в ярком состоянии. Зеленая область в правом кадре показывает размер области, в которой молекулы могут генерировать сигнал.

В RESOLFT область, где молекулы находятся в состоянии A (яркое состояние), можно сделать сколь угодно малой, несмотря на дифракционный предел.

  • Образец необходимо освещать неоднородно, чтобы создать изолированную точку нулевой интенсивности. Это может быть достигнуто, например, с помощью помех.
  • При низкой интенсивности (ниже синей линии на изображении) большинство молекул маркеров находятся в ярком состоянии, если интенсивность выше, большинство маркеров находятся в темном состоянии.

При слабом освещении мы видим, что область, где молекулы остаются в состоянии A, все еще довольно велика, потому что освещение настолько низкое, что большинство молекул находится в состоянии A. Форму профиля освещения не нужно изменять. Увеличение яркости освещения уже приводит к уменьшению площади, где интенсивность ниже величины для эффективного переключения в темное состояние. Следовательно, также уменьшается область, где молекулы могут находиться в состоянии A. Сигнал (флуоресценции) во время последующего считывания исходит из очень маленького пятна, и можно получить очень четкие изображения.

В концепции RESOLFT разрешение может быть аппроксимировано выражением , посредством чего является характеристической интенсивностью, необходимой для насыщения перехода (половина молекул остается в состоянии A, а половина - в состоянии B), и обозначает приложенную интенсивность. Если минимумы создаются фокусирующей оптикой с числовой апертурой , минимальное расстояние, на котором могут быть различимы два идентичных объекта, можно рассматривать как расширение уравнения Аббе . Неограниченный дифракцией характер концепции семейства RESOLFT отражается в том факте, что минимальное разрешимое расстояние можно непрерывно уменьшать, увеличивая. Следовательно, поиск наноразмерного разрешения сводится к максимальному увеличению этого количества. Это возможно путем увеличения или уменьшения .

Варианты [ править ]

При переключении молекулярных состояний используются разные процессы. Однако все они имеют общее, что используются по крайней мере два различимых состояния. Обычно используемое свойство флуоресценции отмечает различие состояний, однако это не является существенным, поскольку также можно использовать свойства поглощения или рассеяния. [4]

STED Microscopy [ править ]

(Основная статья STED-микроскопия )

В рамках STED-микроскопии (STimulated Emission Depletion Microscopy) [1] [2] молекула флуоресцентного красителя движется между своим основным электронным состоянием и возбужденным состоянием, при этом испуская фотоны флуоресценции. Это стандартный режим работы флуоресцентной микроскопии, отображающий состояние A. В состоянии B краситель постоянно поддерживается в своем основном электронном состоянии за счет стимулированного излучения . Если краситель может флуоресцировать в состоянии A, но не в состоянии B, применяется концепция RESOLFT.

GSD-микроскопия [ править ]

(Основная статья GSD-микроскопия )

GSD-микроскопия (микроскопия истощения основного состояния) также использует флуоресцентные маркеры. В состоянии A молекула может свободно перемещаться между основным и первым возбужденным состоянием, и может излучаться флуоресценция. В темном состоянии B основное состояние молекулы опустошено, происходит переход в долгоживущее возбужденное состояние, из которого флуоресценция не испускается. Пока молекула находится в темном состоянии, она не может переключаться между основным и возбужденным состояниями, поэтому флуоресценция отключается.

SPEM и SSIM [ править ]

SPEM (микроскопия с возбуждением с насыщенным паттерном) [5] и SSIM (микроскопия с насыщенным структурированным освещением) [6] используют концепцию RESOLFT с использованием насыщенного возбуждения для создания «негативных» изображений, то есть флуоресценция возникает отовсюду, за исключением очень небольшой области вокруг геометрического объекта. фокус микроскопа. Также для освещения используются неточечные узоры. Чтобы снова получить позитивные изображения, необходима математическая реконструкция изображения.

RESOLFT с переключаемыми белками [ править ]

Некоторые флуоресцентные белки можно включать и выключать светом соответствующей длины волны. Их можно использовать в микроскопе типа RESOLFT. [7] При освещении светом эти белки меняют свою конформацию. В процессе они приобретают или теряют способность излучать флуоресценцию. Состояние флуоресценции соответствует состоянию A, состояние отсутствия флуоресценции - состоянию B, и снова применяется концепция RESOLFT. Обратимый переход (например, от B обратно к A) происходит либо спонтанно, либо снова за счет света. Индуцирование конформационных изменений в белках может быть достигнуто уже при гораздо более низких интенсивностях переключения света по сравнению со стимулированным излучением или истощением основного состояния (несколько Вт / см²). В сочетании с микроскопией 4Piизображения живых клеток с изотропным разрешением ниже 40 нм были получены при низких уровнях освещенности. [8]

RESOLFT с переключаемыми органическими красителями [ править ]

Как и в случае с белками, некоторые органические красители могут изменять свою структуру при освещении. [9] [10] Способность таких органических красителей к флуоресценции может быть включена и отключена с помощью видимого света. И снова применяемая сила света может быть довольно низкой (около 100 Вт / см²).

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Стефан В. Хелл и Ян Вихманн (1994). «Преодоление предела дифракционного разрешения с помощью стимулированного излучения: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированного излучения» . Письма об оптике . 19 (11): 780–2. Bibcode : 1994OptL ... 19..780H . DOI : 10.1364 / OL.19.000780 . PMID  19844443 .
  2. ^ a b Томас А. Клар; Стефан В. Ад (1999). «Субдифракционное разрешение в флуоресцентной микроскопии дальнего поля» . Письма об оптике . 24 (14): 954–956. Bibcode : 1999OptL ... 24..954K . DOI : 10.1364 / OL.24.000954 . PMID 18073907 . 
  3. ^ См. Также Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия .
  4. ^ Стефан В. Ад (2004). «Стратегия для получения оптических изображений и записи в дальней зоне без дифракционного предела». Физика Буквы A . 326 (1–2): 140–145. Bibcode : 2004PhLA..326..140H . DOI : 10.1016 / j.physleta.2004.03.082 .
  5. ^ Райнер Хайнцманн; Томас М. Джовин; Кристоф Кремер (2002). «Насыщенная узорчатая микроскопия возбуждения - концепция улучшения оптического разрешения» . Журнал Оптического общества Америки A . 19 (8): 15991609. Bibcode : 2002JOSAA..19.1599H . DOI : 10.1364 / JOSAA.19.001599 . hdl : 11858 / 00-001M-0000-0029-2C24-9 .
  6. Перейти ↑ Mats GL Gustafsson (2005). «Нелинейная микроскопия со структурированным освещением: широкопольная флуоресцентная визуализация с теоретически неограниченным разрешением» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (37): 13081–6. Bibcode : 2005PNAS..10213081G . DOI : 10.1073 / pnas.0406877102 . PMC 1201569 . PMID 16141335 .  
  7. ^ Майкл Хофманн; Кристиан Эггелинг; Стефан Якобс; Стефан В. Ад (2005). «Нарушение дифракционного барьера в флуоресцентной микроскопии при низкой интенсивности света за счет использования обратимо фотопереключаемых белков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (49): 17565–9. Bibcode : 2005PNAS..10217565H . DOI : 10.1073 / pnas.0506010102 . PMC 1308899 . PMID 16314572 .  
  8. ^ Ульрике Бём; Стефан В. Ад; Роман Шмидт (2016). «Наноскопия 4Pi-RESOLFT» . Nature Communications . 7 (10504): 1–8. Bibcode : 2016NatCo ... 710504B . DOI : 10.1038 / ncomms10504 . PMC 4740410 . PMID 26833381 .  
  9. ^ Мариано Босси; Йонас Фёллинг; Маркус Дайба; Фолькер Вестфаль; Стефан В. Ад (2006). «Преодоление барьера дифракционного разрешения в микроскопии дальнего поля за счет молекулярной оптической бистабильности» . Новый журнал физики . 8 (11): 275. Bibcode : 2006NJPh .... 8..275B . DOI : 10,1088 / 1367-2630 / 8/11/275 .
  10. ^ Дживун Квон; Джихи Хван; Jaewan Park; Ги Рим Хан; Кю Ён Хан; Сеонг Гын Ким (2015). «Наноскопия RESOLFT с фотопереключаемыми органическими флуорофорами» . Научные отчеты . 5 : 17804. Bibcode : 2015NatSR ... 517804K . DOI : 10.1038 / srep17804 . PMC 4671063 . PMID 26639557 .