Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

4Pi микроскоп является лазерным сканирующим флуоресцентным микроскопом с улучшенным осевым разрешением . С его помощью типичный диапазон осевого разрешения 500–700 нм может быть увеличен до 100–150 нм, что соответствует почти сферическому фокусному пятну с объемом в 5–7 раз меньшим, чем у стандартной конфокальной микроскопии . [1]

Принцип работы [ править ]

Улучшение разрешения достигается за счет использования двух противоположных линз объектива, которые фокусируются в одном и том же геометрическом месте. Кроме того, разница в длине оптического пути через каждую из двух линз объектива тщательно совмещена, чтобы быть минимальной. С помощью этого метода молекулы, находящиеся в общей фокальной области обоих объективов, могут когерентно освещаться с обеих сторон, а отраженный или излучаемый свет также может быть когерентно собран, т.е. возможно когерентное наложение излучаемого света на детектор. Телесный угол , который используется для освещения и обнаружения увеличивается и приближается к своему максимуму. В этом случае образец освещается и детектируется со всех сторон одновременно.

Оптическая схема 4Pi микроскопа

Режим работы микроскопа 4Pi показан на рисунке. Лазерный свет разделяется светоделителем и направляется зеркалами на две противоположные линзы объектива. В общей фокусной точке происходит наложение обоих сфокусированных световых лучей. Возбужденные молекулы в этом положении излучают флуоресцентный свет, который собирается обеими линзами объектива, объединяется одним и тем же светоделителем и отклоняется дихроичным зеркалом на детектор. Здесь снова может иметь место наложение обоих излучаемых световых путей.

В идеальном случае каждая линза объектива может собирать свет под телесным углом . С двумя линзами объектива можно собирать со всех сторон (телесного угла ). Название этого типа микроскопии происходит от максимально возможного телесного угла для возбуждения и обнаружения. Практически для линзы объектива можно получить только апертурные углы около 140 °, что соответствует .

Микроскопом можно управлять тремя различными способами: В микроскопе 4Pi типа A когерентная суперпозиция возбуждающего света используется для получения повышенного разрешения. Излучаемый свет обнаруживается либо только с одной стороны, либо в некогерентном наложении с обеих сторон. В микроскопе 4Pi типа B мешает только излучаемый свет. При работе в режиме типа C как возбуждающий, так и испускаемый свет могут интерферировать, что приводит к максимально возможному увеличению разрешения (~ 7 раз вдоль оптической оси по сравнению с конфокальной микроскопией).

В реальном микроскопе с разрешением 4Pi свет нельзя подавать или собирать со всех направлений одинаково, что приводит к так называемым боковым лепесткам в функции рассеяния точки . Обычно (но не всегда) микроскопия с двухфотонным возбуждением используется в микроскопе 4Pi в сочетании с эмиссионным точечным отверстием для снижения этих боковых лепестков до приемлемого уровня.

История [ править ]

В 1971 году Кристоф Кремер и Томас Кремер предложили создать идеальную голограмму , то есть такую , которая несет всю полевую информацию об излучении точечного источника во всех направлениях, так называемую голограмму. [2] [3]

Первое описание практически осуществимой системы 4Pi микроскопии, то есть установки с двумя противоположными интерферирующими линзами, было изобретено Стефаном Хеллом в 1991 году. [4] Он продемонстрировал это экспериментально в 1994 году. [5]

В последующие годы количество применений этого микроскопа выросло. Например, параллельное возбуждение и обнаружение с 64 пятнами в образце одновременно в сочетании с улучшенным пространственным разрешением привело к успешной регистрации динамики митохондрий в дрожжевых клетках с помощью микроскопа 4Pi в 2002 году. [6] Коммерческая версия была запущена под микроскопом. производитель Leica Microsystems в 2004 году [7] и позже прекращен.

До сих пор лучшее качество в микроскопе 4Pi достигалось в сочетании с методами сверхвысокого разрешения, такими как принцип истощения с помощью стимулированного излучения (STED). [8] Используя микроскоп 4Pi с соответствующими пучками возбуждения и снятия возбуждения, можно было создать пятно с равномерным размером 50 нм, что соответствует уменьшенному фокусному объему по сравнению с конфокальной микроскопией в 150–200 раз в фиксированных клетках. Благодаря комбинации микроскопии 4Pi и микроскопии RESOLFT с переключаемыми белками теперь можно получать изображения живых клеток при низких уровнях освещения с изотропным разрешением ниже 40 нм. [9]

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Дж. Беверсдорф; А. Эгнер; SW Ад (2004). «4Pi-конфокальная микроскопия вступает в возраст» (PDF) . Визуализация и микроскопия ЖКТ (4): 24–25.
  2. ^ Кремер К., Кремер Т. (1971)Пунктограмма: Physikalische Grundlagen und Mögliche Anwendungen. Приложение к заявке на патент DE 2116521 „Verfahren zur Darstellung bzw. Modifikation von Objekt-Details, deren Abmessungen außerhalb der sichtbaren Wellenlängen liegen "(Процедура визуализации и модификации деталей объекта с размерами за пределами видимого диапазона длин волн). Подана 5 апреля 1971 года; дата публикации 12 октября 1972 года. Deutsches Patentamt, Берлин. http://depatisnet.dpma.de/DepatisNet/depatisnet?action=pdf&docid=DE000002116521A
  3. ^ Соображения по поводу лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости: К. Кремер и Т. Кремер в MICROSCOPICA ACTA VOL. 81 НОМЕР 1 сентября, с. 31–44 (1978). Базовая конструкция конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа и принцип конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа 4Pi, 1978 г. Архивировано 4 марта 2016 г. в Wayback Machine .
  4. ^ Европейский патент EP 0491289 .
  5. ^ SW Ад; EHK Stelzer; С. Линдек; К. Кремер (1994). «Конфокальная микроскопия с увеличенной апертурой обнаружения: конфокальная микроскопия типа B 4Pi» . Письма об оптике . 19 (3): 222–224. Bibcode : 1994OptL ... 19..222H . CiteSeerX 10.1.1.501.598 . DOI : 10.1364 / OL.19.000222 . PMID 19829598 .  
  6. ^ А. Эгнер; С. Якобс; SW Ад (2002). «Трехмерный микроскоп с быстрым разрешением 100 нм показывает структурную пластичность митохондрий живых дрожжей» (PDF) . PNAS . 99 (6): 3370–3375. Bibcode : 2002PNAS ... 99.3370E . DOI : 10.1073 / pnas.052545099 . PMC 122530 . PMID 11904401 .   
  7. ^ Обзор статьи 4Pi микроскопия .
  8. ^ Р. Шмидт; CA Wurm; С. Якобс; Дж. Энгельгардт; А. Эгнер; SW Ад (2008). «Сферическое наноразмерное фокальное пятно распутывает внутреннюю часть клеток». Методы природы . 5 (6): 539–544. DOI : 10.1038 / nmeth.1214 . hdl : 11858 / 00-001M-0000-0012-DBBB-8 . PMID 18488034 . 
  9. ^ У. Бём; SW Hell; Р. Шмидт (2016). «Наноскопия 4Pi-RESOLFT» . Nature Communications . 7 (10504): 1–8. Bibcode : 2016NatCo ... 710504B . DOI : 10.1038 / ncomms10504 . PMC 4740410 . PMID 26833381 .