С обращенной фазой белка лизат микрочип ( РАПНО ) представляют собой белка микрочип разработан как дот-блот - платформу , что позволяет измерять уровни экспрессии белка в большом количестве биологических образцов одновременно в количественном виде , когда высококачественные антитела доступны. [1]
Технически, незначительные количества (а) клеточных лизатов из интактных клеток или микродиссектированных клеток, полученных с помощью лазерного захвата, (б) биологических жидкостей, таких как сыворотка, спинномозговая жидкость, моча, стекловидное тело, слюна и т. Д., Иммобилизованы на отдельных участках микроматрицы, которая является затем инкубируют с одним специфическим антителом для обнаружения экспрессии целевого белка во многих образцах. [2] Доступно краткое видео RPPA. [3] Одна микроматрица, в зависимости от конструкции, может вместить от сотен до тысяч образцов, которые печатаются в серии копий. Обнаружение выполняется с использованием первичного или вторичного меченого антитела хемилюминесцентным , флуоресцентным или колориметрическим методами.анализы. Затем создается изображение массива и количественно оцениваются полученные данные.
Мультиплексирование достигается за счет одновременного зондирования нескольких массивов, на которые нанесен один и тот же лизат, разными антителами, и может быть реализован как количественный калиброванный анализ. [4] Кроме того, поскольку RPMA может использовать лизаты целых клеток, недиссектированных или микродиссектированных клеток, он может предоставить прямую поддающуюся количественной оценке информацию о посттрансляционно модифицированных белках, недоступных с помощью других высокопроизводительных методов. [5] [6] Таким образом, RPMA обеспечивает высокопроизводительные протеомные данные с высокой пропускной способностью, чувствительностью и количественными показателями. [5] Однако, поскольку сигнал, генерируемый RPMA, может быть получен в результате неспецифического связывания первичных или вторичных антител, как видно из других методов, таких как ELISA или иммуногистохимия, сигнал от одного пятна может быть обусловлен перекрестной реактивностью . Таким образом, антитела, используемые в RPMA, должны быть тщательно проверены на специфичность и эффективность против клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга . [1] [7]
RPMA имеет различные применения, такие как количественный анализ экспрессии белка в раковых клетках, биологических жидкостях или тканях для профилирования биомаркеров , анализ клеточной сигнализации и клинический прогноз, диагностика или терапевтическое прогнозирование. [1] Это возможно, поскольку RPMA с лизатами из разных клеточных линий и / или биопсии микродиссекции ткани с лазерным захватом различных стадий заболевания из различных органов одного или нескольких пациентов могут быть построены для определения относительного или абсолютного количества или дифференциальной экспрессии белка. уровень маркера в одном эксперименте. Он также используется для мониторинга динамики белка в ответ на различные стимулы или дозы лекарств в разные моменты времени. [1] Некоторые другие приложения, для которых используется RPMA, включают изучение и картирование белковых сигнальных путей, оценку молекулярных мишеней лекарств и понимание механизма действия лекарств-кандидатов. [8] Это также было предложено в качестве потенциального раннего скринингового теста у онкологических больных, чтобы облегчить или направить принятие терапевтического решения.
Другие микроматрицы белков включают микроматрицы прямого белка (PMA) и микроматрицы антител (AMA). PMA иммобилизуют отдельные очищенные, а иногда и денатурированные рекомбинантные белки на микрочипе, которые проверяются антителами и другими небольшими соединениями. AMA иммобилизуют антитела, которые захватывают аналиты из образца, нанесенного на микрочип. [4] [6] Целевой белок обнаруживается либо путем прямого мечения, либо вторично меченым антителом против другого эпитопа на целевом белке аналита (сэндвич-подход). И PMA, и AMA можно классифицировать как линейки прямой фазы, поскольку они включают иммобилизацию приманки для захвата анализируемого вещества. В массивах прямой фазы каждый массив инкубируется с одним тестируемым образцом, таким как клеточный лизат или сыворотка пациента, но одновременно тестируются несколько аналитов в образце. [4] На рис. 1 показаны белковые микроматрицы прямой (с использованием антитела в качестве приманки) и обращенной фазы на молекулярном уровне.
Экспериментальный план и методика
В зависимости от исследовательского вопроса или типа и цели исследования RPMA может быть разработан путем выбора содержимого массива, количества образцов, размещения образца в микропланшетах, компоновки массива, типа микроматрицы, правильного обнаружения антител, сигнала метод обнаружения, включение контроля и контроль качества образцов. Затем в лаборатории ставится фактический эксперимент, и полученные результаты количественно оцениваются и анализируются. Ниже перечислены этапы эксперимента:
Сбор образцов
Клетки выращивают в колбах Т-25 при 37 градусах и 5% СО2 в соответствующей среде. [1] В зависимости от дизайна исследования, после слияния клеток их можно обработать лекарствами, факторами роста или облучить перед стадией лизиса. Для исследований динамики времени стимулятор добавляется в набор флаконов одновременно, а затем флаконы обрабатываются в разные моменты времени. [1] Для исследования доз лекарственного средства набор флаконов обрабатывают разными дозами препарата, и все флаконы собирают одновременно. [1]
Если необходимо приготовить RPMA, содержащий лизаты клеточной фракции ткани / тканей, для выделения определенных клеток из области ткани под микроскопом используются методы микродиссекции с лазерным захватом (LCM) или тонкоигольной аспирации . [4] [8]
Лизис клеток
Осадок из клеток, собранных любым из вышеперечисленных способов, лизируют буфером для лизиса клеток для получения высокой концентрации белка. [1]
Скрининг антител
Аликвоты лизатов объединяют и разделяют двумерным однополосным SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране. Мембрану разрезают на полоски по четыре миллиметра, и каждую полоску исследуют различным антителом. Полоски с одной полосой указывают на специфические антитела, подходящие для использования RPMA. Перед фактическим сбором образцов для RPMA необходимо также подтвердить эффективность антител с меньшим размером образца в идентичных условиях. [1] [7]
Строительство RPMA
Клеточные лизаты собирают и серийно разбавляют в шесть-десять раз при использовании колориметрических методов или без разбавления при использовании флуорометрического обнаружения (из-за более широкого динамического диапазона флуоресценции, чем колориметрическое обнаружение). Затем последовательные разведения повторно наносят на 384- или 1536-луночный микротитровальный планшет. [1] Затем лизаты печатают на предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозой или PVDF мембраной, с помощью микроматрицы, такой как Aushon BioSystem 2470 или робота Flexys (геномный раствор). [1] [9] Aushon 2470 с системой сплошных штифтов - идеальный выбор, поскольку он может использоваться для производства матриц с очень вязкими лизатами, а также имеет контроль влажности и автоматическую систему подачи слайдов. [1] При этом есть опубликованные статьи, показывающие, что печатные пины Arrayit Microarray также могут использоваться для производства микроматриц с гораздо более высокой производительностью с использованием меньшего количества лизата. [10] Стеклянные слайды с мембранным покрытием коммерчески доступны от нескольких различных компаний, таких как Schleicher и Schuell Bioscience (сейчас принадлежит GE Whatman www.whatman.com), [9] Grace BioLabs (www.gracebio.com), Thermo Scientific, и SCHOTT Nexterion (www.schott.com/nexterion). [11]
Обнаружение иммунохимического сигнала
После печати слайдов сайты неспецифического связывания на массиве блокируются с использованием блокирующего буфера, такого как I-Block, и массивы зондируются первичным антителом, а затем вторичным антителом. Обнаружение обычно проводится с помощью системы усиления сигнала, катализируемой DakoCytomation (CSA). Для усиления сигнала слайды инкубируют с комплексом стрептавидин-биотин-пероксидаза, а затем с биотинилтирамид / пероксидом водорода и стрептавидин-пероксидазой. Проявление завершено с использованием перекиси водорода и получены сканы слайдов (1). Усиление сигнала тирамида работает следующим образом: иммобилизованная пероксидаза хрена (HRP) превращает тирамид в реакционноспособный промежуточный продукт в присутствии перекиси водорода. Активированный тирамид связывается с соседними белками, близкими к сайту, где связывается активирующий фермент HRP. Это приводит к большему отложению молекулы тирамида на этом участке; отсюда усиление сигнала. [12] [13]
Лэнс Лиотта и Эмануал Петрикоин изобрели технику RPMA в 2001 году (см. Раздел «История» ниже) и разработали метод мультиплексного обнаружения с использованием флуоресцентных методов ближнего инфракрасного диапазона. [14] В этом исследовании они сообщают об использовании подхода на основе двойного красителя, который может эффективно удвоить количество конечных точек, наблюдаемых на каждый массив, что позволяет, например, одновременно измерять и анализировать уровни фосфо-специфического и общего белка. .
Количественная оценка и анализ данных
После проведения иммуноокрашивания экспрессия белка должна быть определена количественно. Уровни сигнала могут быть получены с использованием режима отражения обычного оптического планшетного сканера, если используется колориметрический метод обнаружения [1], или путем лазерного сканирования, например, с системой TECAN LS, если используются флуоресцентные методы. Затем можно использовать две доступные онлайн-программы (P-SCAN и ProteinScan) для преобразования отсканированного изображения в числовые значения. [1] Эти программы количественно определяют интенсивность сигнала в каждой точке и используют алгоритм интерполяции дозы (DI 25 ) для вычисления одного нормализованного значения уровня экспрессии белка для каждого образца. Нормализация необходима для учета различий в общей концентрации белка между каждым образцом и для непосредственного сравнения окрашивания антител между образцами. [15] Это может быть достигнуто путем параллельного проведения эксперимента, в котором общие белки окрашиваются путем окрашивания общего белка коллоидным золотом или окрашивания общего белка Sypro Ruby . [1] Когда анализируются несколько RPMA, значения интенсивности сигнала могут быть отображены в виде тепловой карты, что позволяет проводить байесовский кластерный анализ и профилирование сигнальных путей. [15] Оптимальный программный инструмент, специально разработанный для RPMA, называется Microvigene от компании Vigene Tech, Inc.
Сильные стороны
Самая большая сила RPMA заключается в том, что они обеспечивают высокую пропускную способность, мультиплексное, сверхчувствительное обнаружение белков из чрезвычайно небольшого количества входящего материала, что невозможно сделать с помощью обычного вестерн-блоттинга или ELISA . [1] [9] Небольшой размер пятна на микроматрице диаметром от 85 до 200 микрометров позволяет анализировать тысячи образцов с одним и тем же антителом в одном эксперименте. [9] RPMA обладают повышенной чувствительностью и способны обнаруживать белки в диапазоне пикограмм. [9] Некоторые исследователи даже сообщили об обнаружении белков в диапазоне аттограмм. [9] Это значительное улучшение по сравнению с обнаружением белка с помощью ELISA , для которого требуется количество белка в микрограммах (6). Повышение чувствительности RPMA связано с миниатюрным форматом массива, что приводит к увеличению плотности сигнала (интенсивность сигнала / площадь) [9] в сочетании с улучшением с помощью осаждения тирамида. Высокая чувствительность RPMA позволяет обнаруживать белки с низким содержанием или биомаркеры, такие как фосфорилированные сигнальные белки, из очень небольших количеств исходного материала, такого как образцы биопсии , которые часто загрязнены нормальной тканью. [4] С помощью микродиссекции с помощью лазерного захвата можно анализировать лизаты всего из 10 клеток [4], при этом каждое пятно содержит менее одной сотой клеточного эквивалента белка.
Значительным улучшением RPMA по сравнению с традиционными белками прямой фазы является уменьшение количества антител, необходимых для обнаружения белка. В массивах белков с прямой фазой обычно используется сэндвич-метод для захвата и обнаружения желаемого белка. [4] [15] Это означает, что на белке должно быть два эпитопа (один для захвата белка и один для обнаружения белка), для которых доступны специфические антитела. [15] Другие белковые микроматрицы прямой фазы непосредственно метят образцы, однако часто существует вариабельность эффективности метки для разных белков, и часто метка разрушает эпитоп, с которым связывается антитело. [15] Эта проблема решается с помощью RPMA, так как образец не нужно маркировать напрямую.
Еще одним преимуществом RPMA по сравнению с белковыми микрочипами прямой фазы и вестерн-блоттингом является единообразие результатов, поскольку все образцы на чипе зондируются одними и теми же первичными и вторичными антителами и одинаковой концентрацией реагентов для амплификации в течение одного и того же периода времени. [9] Это позволяет количественно оценить различия в уровнях белка во всех образцах. Кроме того, печать каждого образца на чипе в серийном разведении (колориметрическом) обеспечивает внутренний контроль, гарантирующий, что анализ выполняется только в линейном динамическом диапазоне анализа. [4] Оптимально, если печать калибраторов и контрольных значений высокого и низкого уровня непосредственно на одном чипе обеспечит непревзойденную возможность количественного измерения каждого белка во времени и между экспериментами. Проблема, с которой сталкиваются с тканевыми микрочипами, заключается в поиске антигена и присущей иммуногистохимии субъективности. Антитела, особенно фосфоспецифические реагенты, часто обнаруживают линейные пептидные последовательности, которые могут быть замаскированы из-за трехмерной конформации белка. [15] Эта проблема решается с помощью RPMA, поскольку образцы можно денатурировать, обнаруживая любые скрытые эпитопы. [15]
Слабые стороны
Самым большим ограничением RPMA, как и всех иммуноанализов, является его зависимость от антител для обнаружения белков. В настоящее время существует ограниченное, но быстро растущее число сигнальных белков, для которых существуют антитела, дающие анализируемый сигнал. [15] Кроме того, для поиска подходящего антитела может потребоваться обширный скрининг многих антител с помощью вестерн-блоттинга перед началом анализа RPMA. [1] Чтобы решить эту проблему, были созданы две базы данных открытых ресурсов для отображения результатов вестерн-блоттинга для антител, которые имеют хорошую специфичность связывания в ожидаемом диапазоне. [1] [16] [17] Кроме того, RPMA, в отличие от вестерн-блоттинга, не разделяют белковые фракции по молекулярной массе. [1] Таким образом, очень важно провести предварительную проверку антител.
История
RPMA была впервые представлена в 2001 году в статье Лэнса Лиотты и Эмануэля Петрикоина, которые изобрели эту технологию. [8] Авторы использовали эту технику для успешного анализа состояния белка контрольной точки выживания на микроскопической переходной стадии с использованием лазерной микродиссекции гистологически нормального эпителия простаты, интраэпителиальной неоплазии простаты и подобранного пациенту инвазивного рака простаты. [8] С тех пор RPMA использовался во многих фундаментальных биологических, трансляционных и клинических исследованиях. Кроме того, эта методика впервые была запущена в клинические испытания, при этом пациенты с метастатическим колоректальным раком и раком молочной железы выбираются для лечения на основе результатов RPMA. Этот метод был коммерциализирован для применения в персонализированной медицине компанией Theranostics Health, Inc.
Рекомендации
- ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s Б. Спурье, С. Рамалингам, С. Нишизука (2008). "Обратно-фазовые белковые микрочипы для анализа клеточной сигнализации" . Протоколы природы . Издательская группа "Природа". 3 (11): 1796–1808. DOI : 10.1038 / nprot.2008.179 . PMID 18974738 .CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
- ^ Гагауа, Мохаммед; Боннет, Мюриэль; Эллис-Ури, Мари-Пьер; Конинг, Линн Де; Пикард, Бриджит (2018). «Белковые матрицы с обращенной фазой для идентификации / проверки биомаркеров текстуры говядины и их использование для ранней классификации туш». Пищевая химия . 250 : 245–252. DOI : 10.1016 / j.foodchem.2018.01.070 . PMID 29412918 .
- ^ О'Махони, ФК, Нанда, Дж., Лэрд, А., Маллен, П., Колдуэлл, Х., Овертон, И.М. и др. Использование протеиновых массивов с обращенной фазой (RPPA) для изучения вариаций экспрессии протеина при индивидуальном раке почечных клеток. J. Vis. Exp. (71), e50221. DOI: 10.3791/50221 (2013) http://www.jove.com/video/50221/the-use-reverse-phase-protein-arrays-rppa-to-explore-protein .
- ^ Б с д е е г ч KM Sheehan; В. С. Калверт; EW Kays; Y. Lu; Д. Фишман; В. Эспина; Дж. Акино; Р. Спир; Р. Араужо; GB Mills; Л.А. Лиотта; EF Petricoin III; JD Wulfkuhle (2005). «Использование микрочипов белков с обратной фазой и разработка эталонных стандартов для анализа молекулярной сети метастатической карциномы яичников» . Молекулярная и клеточная протеомика . Американское общество биохимии и молекулярной биологии, Inc. 4 (4): 346–355. DOI : 10.1074 / mcp.T500003-MCP200 . PMID 15671044 .
- ^ а б Б. Спурриер; С. Рамалингам; С. Нисизука (2008). «Обращенно-фазовые микроматрицы лизата белка для анализа клеточной сигнализации» . Протоколы природы . Издательская группа "Природа". 3 (11): 1796–1808. DOI : 10.1038 / nprot.2008.179 . PMID 18974738 .
- ^ а б К. Хульцхиг; Дж. Кройцбергер; Х. Зейтц; Z. Konthur; К. Буссоу; Х. Лехрах (2006). «Последние достижения белковых микрочипов» . Текущее мнение в химической биологии . Elsevier Ltd. 10 (1): 4–10. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2005.12.011 . hdl : 11858 / 00-001M-0000-0010-84B0-3 . PMC 7108394 . PMID 16376134 .
- ^ а б Б. Спурриер; FL Washburn; С. Асин; С. Рамалингам; С. Нисидзука (2007). «База данных скрининга антител для моделирования кинетики белков» . Протеомика . WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Вайнхайм. 7 (18): 3259–3263. DOI : 10.1002 / pmic.200700117 . PMID 17708592 .[ мертвая ссылка ]
- ^ а б в г С. П. Павелец; Л. Шарбоно; В.Е. Бихсель; Н.Л. Симоне; Т. Чен; Дж. В. Гиллеспи; Г-н Эммерт-Бак; MJ Roth; EF Petricoin III; Л.А. Лиотта (2001). «Белковые микроматрицы с обращенной фазой, которые фиксируют прогрессирование заболевания, показывают активацию путей выживания на фронте инвазии рака» . Онкоген . Издательская группа "Природа". 20 (16): 1981–9. DOI : 10.1038 / sj.onc.1204265 . PMID 11360182 .
- ^ Б с д е е г ч А. Рамасвами; Э. Линь; И. Чен; Р. Митра; Дж. Моррисетт; К. Кумбс; Z. Ju; М. Капур (2005). «Применение микроматриц белкового лизата для проверки и количественного определения молекулярных маркеров» (PDF) . Протеомная наука . Ramaswamy et al .; лицензиат БиоМед Централ Лтд. 9 (3).
- ^ Наука протеома | Полный текст | Разработка микрочипов белков с обращенной фазой для проверки кластерина, биомаркера крови со средним содержанием
- ^ Грюнвальд I; Groth E; Вирт I; Шумахер Дж; Maiwald M; Zoellmer V; Буссе М. Капур (2010). «Биофункциональность поверхности и производство миниатюрных сенсорных структур с использованием технологий аэрозольной печати». Биофабрикация . 2 (1): 014106. Bibcode : 2010BioFa ... 2a4106G . DOI : 10.1088 / 1758-5082 / 2/1/014106 . PMID 20811121 .
- ^ «Вопросы и ответы об усилении тирамидного сигнала (TSA) - США» . Архивировано из оригинала на 2009-03-04 . Проверено 27 февраля 2009 .
- ^ Подробный протокол техники см. Спурриер, Рамалингам С., Нисизука С. (2008). «Обращенно-фазовые микроматрицы лизата белка для анализа клеточной сигнализации» . Протоколы природы . 3 (11): 1796–1808. DOI : 10.1038 / nprot.2008.179 . PMID 18974738 .CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
- ^ Калверт, В. Тан, Ю. Boveia, В. Wulfkuhle, Дж Schutz-Geschwender, А оливковое, Д. Лиотта, Л. и Petricoin, Е. (2004). Разработка мультиплексного профилирования и детектирования белков с использованием микрочипов белков с обращенной фазой в ближнем инфракрасном диапазоне. Журнал клинической протеомики . (1): 81–89 [1] Архивировано 13 июля 2011 г. в Wayback Machine.
- ^ Б с д е е г ч Л. А. Лиотта; В. Эспина; А. И. Мехта; В. Калверт; К. Розенблатт; Д. Гехо; П. Дж. Мансон; Л. Янг; Дж. Вульфкуле; Э. Ф. Петрикоин (2003). «Белковые микрочипы: решение аналитических задач для клинического применения». Раковая клетка . ЯЧЕЙНЫЙ ПРЕСС. 3 (4): 317–325. DOI : 10.1016 / S1535-6108 (03) 00086-2 . PMID 12726858 .
- ^ AbMiner
- ^ «Архивная копия» . Архивировано из оригинала на 2016-03-03 . Проверено 6 мая 2019 .CS1 maint: заархивированная копия как заголовок ( ссылка )
Внешние ссылки
- http://www.bio-itworld.com/BioIT_Article.aspx?id=97660
- http://discover.nci.nih.gov/abminer