Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Белка микрочипов (или белок чип ) является высокой пропускной способностью метода , используемого для отслеживания взаимодействий и активности белков, а также определить их функции, а также функцию определения в больших масштабах. [1] Его главное преимущество заключается в том, что большое количество белков можно отслеживать параллельно. Чип состоит из опорной поверхности , таких как стекло, нитроцеллюлозная мембрана, шарик, или микротитрационного планшет , к которой массив белков захвата связан. [2] Молекулы зондов , обычно помеченные флуоресцентным красителем, добавляются к матрице. Любая реакция между зондом и иммобилизованным белком испускает флуоресцентный сигнал, который считывается лазерным сканером.. [3] Белковые микрочипы являются быстрыми, автоматизированными, экономичными и высокочувствительными, требуют небольшого количества образцов и реагентов. [4] Концепция и методология белковых микрочипов были впервые представлены и проиллюстрированы на микрочипах антител (также называемых матрицей антител ) в 1983 году в научной публикации [5] и в серии патентов. [6] Высокая пропускная способность технологии за белка микрочипов было относительно легко развиваться , поскольку она основана на технологии , разработанной для ДНК - микрочипов , [7] , которые стали наиболее широко используются микрочипы .

Мотивация к развитию [ править ]

Белковые микрочипы были разработаны из-за ограничений использования ДНК-микрочипов для определения уровней экспрессии генов в протеомике . Количество мРНК в клетке часто не отражает уровни экспрессии белков, которым они соответствуют. Поскольку обычно именно белок, а не мРНК играет функциональную роль в клеточном ответе, потребовался новый подход. Кроме того, посттрансляционные модификации , которые часто имеют решающее значение для определения функции белка, не видны на микрочипах ДНК. [8] Белковые микрочипы заменяют традиционные методы протеомики, такие как 2D гель-электрофорез или хроматография., которые отнимали много времени, трудозатратно и плохо подходили для анализа белков с низким содержанием.

Создание массива [ править ]

Белки наносятся на твердую поверхность, такую ​​как предметные стекла микроскопа, мембраны, шарики или микротитровальные планшеты. Функция этой поверхности - обеспечить поддержку, на которой можно иммобилизовать белки. Он должен демонстрировать максимальные связывающие свойства при сохранении белка в его нативной конформации, чтобы его связывающая способность сохранялась. Предметные стекла для микроскопов из стекла или силикона являются популярным выбором, поскольку они совместимы с легко доступными роботизированными матрицами и лазерными сканерами, которые были разработаны для технологии ДНК-микрочипов. Слайды из нитроцеллюлозной пленки широко признаны в качестве субстрата с наивысшим связыванием с белками для приложений с белковыми микрочипами.

Выбранная твердая поверхность затем покрывается покрытием, которое должно одновременно выполнять функции иммобилизации белка, предотвращения его денатурации , ориентации его в соответствующем направлении, чтобы его сайты связывания были доступны, и обеспечения гидрофильной среды, в которой может протекать реакция связывания. происходить. Он также должен отображать минимальное неспецифическое связывание, чтобы минимизировать фоновый шум в системах обнаружения. Кроме того, он должен быть совместим с различными системами обнаружения. Иммобилизирующие агенты включают слои алюминия или золота, гидрофильных полимеров и полиакриламидных гелей или обработку аминами , альдегидом или эпоксидной смолой . Тонкопленочные технологии типаФизическое осаждение из паровой фазы (PVD) и химическое осаждение из паровой фазы (CVD) используются для нанесения покрытия на опорную поверхность.

Водная среда необходима на всех этапах производства и эксплуатации массива для предотвращения денатурации белка. Таким образом, буферы для образцов содержат высокий процент глицерина (для снижения температуры замерзания), а влажность производственной среды тщательно регулируется. Микролунки обладают двойным преимуществом: они обеспечивают водную среду и предотвращают перекрестное загрязнение между образцами.

В наиболее распространенном типе массива белков роботы размещают большое количество белков или их лигандов на твердой основе с покрытием по заранее заданной схеме. Это называется роботизированной контактной печатью или роботизированным пятном. Другой метод изготовления - это струйная печать , бесконтактный метод капельного распыления белковых полимеров на твердую поверхность по желаемому рисунку. [9] Пьезоэлектрическое нанесение пятен - это метод, аналогичный струйной печати. Печатающая головка перемещается по матрице, и в каждой точке используется электрическая стимуляция для доставки молекул белка на поверхность с помощью крошечных струй. Это тоже бесконтактный процесс. [10] Фотолитографияэто четвертый метод размещения белков на поверхности. Свет используется в сочетании с фотошаблонами , непрозрачными пластинами с отверстиями или прозрачными пленками, которые позволяют свету проходить через определенный узор. Затем серия химических обработок позволяет нанести белок желаемым образом на материал под фотомаской. [11]

Молекулы захвата, расположенные на твердой поверхности, могут представлять собой антитела , антигены , аптамеры (лиганды на основе нуклеиновых кислот), аффитела (небольшие молекулы , созданные для имитации моноклональных антител) или полноразмерные белки. Источники таких белков включают клеточные системы экспрессии рекомбинантных белков , очистку из природных источников, производство in vitro с помощью систем бесклеточной трансляции и методы синтеза пептидов.. Многие из этих методов могут быть автоматизированы для получения высокой производительности, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать условий синтеза или экстракции, которые приводят к денатурированному белку, который, поскольку он больше не распознает своего партнера по связыванию, делает массив бесполезным.

Белки очень чувствительны к изменениям в их микросреде. Это представляет проблему в поддержании белковых массивов в стабильном состоянии в течение длительных периодов времени. Методы in situ, изобретенные и опубликованные Мингью Хе и Майклом Тауссигом в 2001 году [12] [13], включают в себя синтез белков на кристалле по мере необходимости, непосредственно из ДНК с использованием систем внеклеточной экспрессии белков. Поскольку ДНК представляет собой высокостабильную молекулу, она не разрушается со временем и поэтому подходит для длительного хранения. Этот подход также имеет преимущество в том, что он позволяет обойти трудоемкие и часто дорогостоящие процессы отдельной очистки белка и клонирования ДНК., поскольку белки создаются и иммобилизуются одновременно за один этап на поверхности чипа. Примерами методов in situ являются PISA (матрица белков in situ), NAPPA (матрица белков, программируемых нуклеиновыми кислотами) и DAPA (матрица ДНК в матрицу белков).

Типы массивов [ править ]

Типы белковых массивов

Существует три типа белковых микрочипов, которые в настоящее время используются для изучения биохимической активности белков.

Аналитические микроматрицы также известны как матрицы захвата. В этом методе библиотека антител, аптамеров или аффител размещается на поверхности носителя. Они используются в качестве молекул захвата, поскольку каждая специфично связывается с определенным белком. Массив исследуют сложным белковым раствором, таким как клеточный лизат.. Анализ результирующих реакций связывания с использованием различных систем обнаружения может предоставить информацию об уровнях экспрессии определенных белков в образце, а также измерения аффинности и специфичности связывания. Этот тип микроматрицы особенно полезен для сравнения экспрессии белков в различных растворах. Например, ответ клеток на определенный фактор может быть идентифицирован путем сравнения лизатов клеток, обработанных определенными веществами или выращенных в определенных условиях, с лизатами контрольных клеток. Другое применение - идентификация и профилирование пораженных тканей.

Белковые микроматрицы с обращенной фазой (RPPA) включают сложные образцы, такие как лизаты тканей. Клетки выделяют из различных представляющих интерес тканей и лизируют. Лизат наносят на микроматрицу и исследуют антителами против интересующего целевого белка. Эти антитела обычно обнаруживаются с помощью хемилюминесцентных , флуоресцентных или колориметрических анализов. Эталонные пептиды напечатаны на предметных стеклах, чтобы можно было количественно определить содержание белка в образцах лизатов. RPA позволяют определить присутствие измененных белков или других агентов, которые могут быть результатом заболевания. В частности, посттрансляционные модификации, которые обычно изменяются в результате заболевания, могут быть обнаружены с помощью RPA. [14]

Функциональные белковые микрочипы [ править ]

Функциональные белковые микрочипы (также известные как массивы белков-мишеней) конструируются путем иммобилизации большого количества очищенных белков и используются для идентификации взаимодействий белок-белок, белок-ДНК, белок- РНК , белок- фосфолипид и белок-мелкие молекулы, чтобы анализ ферментативной активности и обнаружение антител и демонстрация их специфичности. Они отличаются от аналитических массивов тем, что функциональные белковые массивы состоят из массивов, содержащих полноразмерные функциональные белки или белковые домены. Эти протеиновые чипы используются для изучения биохимической активности всего протеома в одном эксперименте.

Ключевым элементом любого функционального анализа на основе микроматрицы белков является то, что белки в матрице должны сохранять свою природную структуру, чтобы на поверхности матрицы могли иметь место значимые функциональные взаимодействия. Преимущества контроля точного способа прикрепления к поверхности посредством использования соответствующей аффинной метки заключаются в том, что иммобилизованные белки будут иметь гомогенную ориентацию, что приведет к более высокой удельной активности и более высокому отношению сигнал / шум в анализах с меньшим вмешательством из-за отсутствия конкретные взаимодействия. [15] [16]

Обнаружение [ править ]

Методы обнаружения белкового массива должны давать высокий сигнал и низкий фон. Наиболее распространенным и широко используемым методом обнаружения является флуоресцентная маркировка, которая отличается высокой чувствительностью, безопасностью и совместима с легко доступными лазерными сканерами микрочипов. Могут использоваться другие метки, такие как аффинные, фотохимические или радиоизотопные метки. Эти метки прикрепляются к самому зонду и могут мешать реакции белка-мишени. Таким образом, доступен ряд методов обнаружения без меток, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), углеродные нанотрубки, датчики с углеродными нанопроводами (где обнаружение происходит через изменение проводимости) и кантилеверы микроэлектромеханической системы (MEMS). [17]Все эти методы детектирования без метки являются относительно новыми и пока не подходят для детектирования взаимодействия белков с высокой пропускной способностью; тем не менее, они обещают многообещающее будущее. Иммуноанализы на микропиллярных каркасах из тиоленовой «синтетической бумаги» показали, что они генерируют превосходный сигнал флуоресценции. [18]

Для количественного определения белка на предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозой, можно использовать флуоресцентное детектирование в ближнем ИК-диапазоне. Это ограничивает помехи из-за автофлуоресценции нитроцеллюлозы на длинах волн УФ, используемых для стандартных флуоресцентных датчиков. [19]

Приложения [ править ]

Существуют пять основных областей, в которых применяются белковые матрицы: диагностика, протеомика, функциональный анализ белков, характеристика антител и разработка лечения.

Диагностика предполагает обнаружение антигенов и антител в образцах крови; профилирование сывороток для обнаружения новых биомаркеров болезней ; мониторинг болезненных состояний и реакции на терапию в персонализированной медицине; мониторинг окружающей среды и продуктов питания. Цифровой биоанализ является примером использования белковых микрочипов в диагностических целях. В этой технологии массив микролунок на стеклянном / полимерном чипе засевается магнитными шариками (покрытыми флуоресцентными мечеными антителами), подвергается воздействию антигенов-мишеней и затем охарактеризован под микроскопом путем подсчета флуоресцентных лунок. Недавно была продемонстрирована экономически эффективная платформа для изготовления (с использованием полимеров OSTE ) таких массивов микролунок, и была успешно охарактеризована модельная система биологических анализов.[20]

Протеомика относится к профилированию экспрессии белков, то есть к тому, какие белки экспрессируются в лизате конкретной клетки.

Функциональный анализ белков - это идентификация белок-белковых взаимодействий (например, идентификация членов белкового комплекса), белок-фосфолипидных взаимодействий, малых молекул-мишеней, ферментативных субстратов (особенно субстратов киназ ) и лигандов рецепторов.

Характеристика антител характеризует перекрестную реактивность , специфичность и картирование эпитопов .

Разработка лечения включает разработку антиген-специфических методов лечения аутоиммунных заболеваний , рака и аллергии; идентификация малых молекул-мишеней, которые потенциально могут быть использованы в качестве новых лекарств.

Проблемы [ править ]

Несмотря на значительные инвестиции, сделанные несколькими компаниями, белковые чипы еще не наводнили рынок. Производители обнаружили, что с белками на самом деле довольно сложно работать. Производство надежных, последовательных, высокопроизводительных белков, которые правильно сложены и функциональны, сопряжено с трудностями, поскольку они часто приводят к низкому выходу белков из-за пониженной растворимости и образования телец включения. [ необходима цитата ] Для создания белкового чипа требуется гораздо больше шагов, чем для создания ДНК-чипа .

Существует несколько подходов к этой проблеме, которые фундаментально различаются в зависимости от того, иммобилизуются ли белки посредством неспецифических, плохо определенных взаимодействий или посредством определенного набора известных взаимодействий. Первый подход привлекателен своей простотой и совместим с очищенными белками, полученными из нативных или рекомбинантных источников [21] [22], но имеет ряд рисков. Наиболее заметные из них относятся к неконтролируемому характеру взаимодействий между каждым белком и поверхностью; в лучшем случае это могло бы дать начало гетерогенной популяции белков, в которых активные центры иногда закрываются поверхностью; в худшем случае он может полностью уничтожить активность из-за частичного или полного поверхностного разворачивания иммобилизованного белка.

Задачи включают: 1) поиск поверхности и метода прикрепления, который позволяет белкам сохранять свою вторичную или третичную структуру.и, следовательно, их биологическая активность и их взаимодействия с другими молекулами, 2) создание массива с длительным сроком хранения, чтобы белки на чипе не денатурировались в течение короткого времени, 3) идентификация и выделение антител или других молекул захвата против каждого белка в геноме человека, 4) количественное определение уровней связанного белка при обеспечении чувствительности и избегании фонового шума, 5) извлечение детектируемого белка из чипа для его дальнейшего анализа, 6) снижение неспецифического связывания захватывающими агентами, 7 ) емкость чипа должна быть достаточной для визуализации максимально полного представления протеома; обильные белки подавляют обнаружение менее обильных белков, таких как сигнальные молекулы и рецепторы, которые обычно представляют больший терапевтический интерес.[23]

См. Также [ править ]

  • Импринтинг микроматриц и формирование поверхностной энергии
  • Методы обнаружения без использования этикеток для белковых микрочипов

Ссылки [ править ]

  1. ^ Мелтон, Лиза (2004). «Белковые массивы: протеомика в мультиплексе». Природа . 429 (6987): 101–107. Bibcode : 2004Natur.429..101M . DOI : 10.1038 / 429101a . ISSN  0028-0836 . PMID  15129287 . S2CID  62775434 .
  2. ^ Марк Шена (2005). Белковые микрочипы . Джонс и Бартлетт Обучение. С. 47–. ISBN 978-0-7637-3127-4.
  3. ^ Марк Шена (2005). Белковые микрочипы . Джонс и Бартлетт Обучение. стр. 322–. ISBN 978-0-7637-3127-4.
  4. ^ Митчелл, Питер (2002). «Взгляд на белковые микрочипы». Природа Биотехнологии . 20 (3): 225–229. DOI : 10.1038 / nbt0302-225 . ISSN 1087-0156 . PMID 11875416 . S2CID 5603911 .   
  5. ↑ Чанг TW (декабрь 1983 г.). «Связывание клеток с матриксами различных антител, нанесенных на твердую поверхность». J. Immunol. Методы . 65 (1–2): 217–23. DOI : 10.1016 / 0022-1759 (83) 90318-6 . PMID 6606681 . 
  6. ^ US 4591570  ; US 4829010  ; США 5100777  .
  7. ^ Холл, DA; Птачек, Дж; Снайдер, М. (12 декабря 2012 г.). «Технология протеиновых микрочипов» . Мех. Aging Dev . 128 (1): 161–7. DOI : 10.1016 / j.mad.2006.11.021 . PMC 1828913 . PMID 17126887 .  
  8. ^ Талапатра, Анупам; Роуз, Ричард; Хардиман, Гэри (2002). «Белковые микрочипы: вызовы и перспективы». Фармакогеномика . 3 (4): 527–536. DOI : 10.1517 / 14622416.3.4.527 . ISSN 1462-2416 . PMID 12164775 .  
  9. ^ Калверт, Пол (2001). «Струйная печать на материалах и устройствах». Химия материалов . 13 (10): 3299–3305. DOI : 10.1021 / cm0101632 . ISSN 0897-4756 . 
  10. ^ "ДНК-микрочипы: методы" . Arabidopsis.info. Архивировано из оригинального 28 августа 2008 года . Проверено 19 января 2013 года .
  11. ^ Шин, DS; Ким, DH; Чанг, WJ; Ли, Ю.С. (30 сентября 2005 г.). «Комбинаторный твердофазный пептидный синтез и биоанализы». Журнал биохимии и молекулярной биологии . 38 (5): 517–25. DOI : 10.5483 / bmbrep.2005.38.5.517 . PMID 16202229 . 
  12. ^ Патент США 7674752 , Mingyue Хэ & Michael John Taussig, "Функциональные белковые массивы", опубликованные 2004-08-15, выпущенные 2010-03-10, назначен Discema Limited 
  13. ^ Он, М; Тауссиг, MJ (июнь 2001 г.). «Одностадийное создание белковых массивов из ДНК путем бесклеточной экспрессии и иммобилизации in situ (метод PISA)» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (15): E73–3. DOI : 10.1093 / NAR / 29.15.e73 . PMC 55838 . PMID 11470888 .  
  14. ^ Холл, DA; Птачек, Дж; Снайдер, М (2007). «Технология белковых микрочипов» . Мех. Aging Dev . 128 (1): 161–7. DOI : 10.1016 / j.mad.2006.11.021 . PMC 1828913 . PMID 17126887 .  
  15. ^ Купманн, JO; Блэкберн, Дж (2003). «Высокоаффинная поверхность захвата для белковых микрочипов, совместимых с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы». Быстрые коммуникации в масс-спектрометрии . 17 (5): 455–62. Bibcode : 2003RCMS ... 17..455K . DOI : 10.1002 / rcm.928 . PMID 12590394 . 
  16. ^ Блэкберн, JM; Шоко, А; Битон-Кемпен, Н. (2012). Миниатюрные анализы на основе микрочипов для химических протеомных исследований функции белков . Методы молекулярной биологии. 800 . С. 133–62. DOI : 10.1007 / 978-1-61779-349-3_10 . ISBN 978-1-61779-348-6. PMID  21964787 .
  17. ^ Рэй, Сандипан; Мехта, Гунджан; Шривастава, Санджива (2010). «Методы обнаружения белковых микрочипов без этикеток: перспективы, достоинства и проблемы» . Протеомика . 10 (4): 731–748. DOI : 10.1002 / pmic.200900458 . ISSN 1615-9861 . PMC 7167936 . PMID 19953541 .   
  18. ^ Го, Вт; Вилаплана, L; Hansson, J; Marco, P; ван дер Вейнгарт, Вт (2020). «Иммуноанализ на тиол-еновой синтетической бумаге генерирует превосходный сигнал флуоресценции». Биосенсоры и биоэлектроника . 163 : 112279. дои : 10.1016 / j.bios.2020.112279 . PMID 32421629 . 
  19. ^ Уильямс, Ричард Дж .; Нараянан, Нарасимхачари .; Casay, Guillermo A .; Lipowska, Malgorzata .; Перальта, Хосе Мауро .; Цанг, Виктор CW; Strekowski, Lucjan .; Патонай, Габор. (1994). «Инструмент для обнаружения ближней инфракрасной флуоресценции в твердофазном иммуноанализе». Аналитическая химия . 66 (19): 3102–3107. DOI : 10.1021 / ac00091a018 . ISSN 0003-2700 . PMID 7978305 .  
  20. ^ Decrop, Дебора (2017). «Одношаговый импринтинг массивов микролунок Femtoliter позволяет проводить цифровые биоанализы с аттомолярным пределом обнаружения». Прикладные материалы и интерфейсы ACS . 9 (12): 10418–10426. DOI : 10.1021 / acsami.6b15415 . PMID 28266828 . 
  21. ^ MacBeath, G; Шрайбер, SL (8 сентября 2000 г.). «Печать белков в виде микрочипов для определения функции высокой производительности». Наука . 289 (5485): 1760–3. Bibcode : 2000Sci ... 289.1760M . doi : 10.1126 / science.289.5485.1760 (неактивен 20 января 2021 г.). PMID 10976071 . CS1 maint: DOI inactive as of January 2021 (link)
  22. ^ Angenendt, P; Glökler, J; Собек, Дж; Lehrach, H; Кэхилл, ди-джей (15 августа 2003 г.). «Следующее поколение поддерживающих материалов для белковых микрочипов: оценка применения микрочипов для белков и антител». Журнал хроматографии A . 1009 (1–2): 97–104. DOI : 10.1016 / s0021-9673 (03) 00769-6 . PMID 13677649 . 
  23. ^ Фунг, Эрик Т; Туласираман, Ванита; Weinberger, Scot R; Далмассо, Энрике А (2001). «Белковые биочипы для дифференциального профилирования». Текущее мнение в области биотехнологии . 12 (1): 65–69. DOI : 10.1016 / S0958-1669 (00) 00167-1 . ISSN 0958-1669 . PMID 11167075 .