Одномолекулярный FRET

Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул (или smFRET ) - это биофизический метод, используемый для измерения расстояний в масштабе 1-10 нанометров в отдельных молекулах , обычно биомолекулах . Это приложение FRET, в котором пара донорных и акцепторных флуорофороввозбуждаются и детектируются на уровне отдельной молекулы. В отличие от «ансамбля FRET», который обеспечивает сигнал FRET большого числа молекул, FRET одиночной молекулы способен разрешать сигнал FRET каждой отдельной молекулы. Изменение сигнала smFRET полезно для выявления кинетической информации, которую не может предоставить ансамблевое измерение, особенно когда система находится в состоянии равновесия. Также можно наблюдать неоднородность между различными молекулами.

Методология [ править ]

Схема типичного эксперимента smFRET (A), кривая расстояния FRET (B) и временная траектория (C).

Измерения FRET одиночных молекул обычно выполняются на флуоресцентных микроскопах с использованием либо поверхностно иммобилизованных, либо свободно диффундирующих молекул. Одиночные пары FRET освещаются с помощью источников интенсивного света, обычно лазеров , чтобы генерировать достаточный сигнал флуоресценции, позволяющий обнаруживать отдельные молекулы. Широкопольная многофотонная микроскопия обычно сочетается с флуоресцентным микроскопом полного внутреннего отражения (TIRF) . Это избирательно возбуждает пары FRET на поверхности измерительной камеры и устраняет шум от основной массы образца. В качестве альтернативы конфокальная микроскопия минимизирует фон, фокусируя флуоресцентный свет на точечное отверстие, чтобы отклонить свет вне фокуса.^[1] Конфокальный объем имеет диаметр около 220 нм, поэтому его необходимо сканировать поперек, если требуется изображение образца. При конфокальном возбуждении можно проводить измерения на гораздо большей глубине образца, чем при использовании TIRF. Сигнал флуоресценции обнаруживается либо с помощью сверхчувствительных ПЗС- матриц, либо научных КМОП-камер для широкопольной микроскопии или SPAD для конфокальной микроскопии.^[2] Как только доступны зависимости интенсивности отдельных молекул от времени, эффективность FRET может быть вычислена для каждой пары FRET как функция времени, что позволяет отслеживать кинетические события в масштабе отдельных молекул и строить гистограммы FRET.показывает распределение состояний в каждой молекуле. Однако данные из многих пар FRET должны быть записаны и объединены, чтобы получить общую информацию об образце ^[3] или динамической структуре. ^[4]

Поверхностно-иммобилизованный [ править ]

В экспериментах с иммобилизацией на поверхности биомолекулы, меченные флуоресцентными метками, связываются с поверхностью покровного стекла, и получаются изображения флуоресценции (обычно с помощью CCD или научных камер CMOS ). ^{[5] При} сборе данных с помощью камер будут сняты видеозаписи образца, которые необходимо обработать для определения интенсивности отдельных молекул с течением времени. Если используется конфокальный микроскоп с детектором SPAD , сначала выполняется поиск молекул путем сканирования образца. Затем конфокальная точка располагается на молекуле и напрямую собирает данные интенсивности-времени, что дает пренебрежимо малым дрейфом образца или используется активная петля обратной связи для отслеживания молекулы.

Преимущество экспериментов с иммобилизацией на поверхности состоит в том, что многие молекулы можно наблюдать параллельно в течение длительного периода времени до фотообесцвечивания (обычно 1-30 с). Это позволяет удобно изучать переходы, происходящие на медленных временных масштабах. Недостатком являются дополнительные биохимические модификации, необходимые для связывания молекул с поверхностью, и возмущения, которые поверхность может потенциально оказывать на молекулярную активность. Кроме того, максимальное временное разрешение интенсивностей одиночных молекул ограничено временем захвата камеры (> 1 мс).

Свободно-распространяющийся [ править ]

SmFRET может также использоваться для изучения конформации молекул, свободно диффундирующих в жидком образце. В экспериментах с свободно распространяющимся smFRET (или smFRET на основе диффузии) одни и те же биомолекулы могут свободно диффундировать в растворе, будучи возбужденными небольшим объемом возбуждения (обычно пятном, ограниченным дифракцией ). Всплески фотонов, вызванные пересечением одной молекулой пятна возбуждения, регистрируются с помощью SPAD.детекторы. Конфокальное пятно обычно фиксируется в заданном положении (сканирование и изображение не производится). Вместо этого фотоны флуоресценции, испускаемые отдельными молекулами, пересекающими объем возбуждения, записываются и накапливаются, чтобы построить распределение различных популяций, присутствующих в образце. В зависимости от сложности этого распределения время сбора данных варьируется от ~ 5 минут до нескольких часов.

Отличительным преимуществом установок, использующих детекторы SPAD, является то, что они не ограничены «частотой кадров» или фиксированным временем интеграции, как при использовании камер. Фактически, в отличие от камер, SPAD генерируют импульс каждый раз, когда обнаруживается фотон, в то время как дополнительная электроника необходима для «отметки времени» каждого импульса с разрешением 10-50 нс. Высокое временное разрешение измерений FRET конфокальных одиночных молекул позволяет потенциально обнаруживать динамику во временных масштабах от 10 мкс. Однако обнаружение "медленных" переходов во временном масштабе, превышающем время диффузии (обычно ~ 1 мс), труднее, чем в экспериментах с иммобилизацией на поверхности, и обычно требует гораздо более длительных наблюдений.

Обычно флуоресцентное излучение как донорных, так и акцепторных флуорофоров обнаруживается двумя независимыми детекторами, а сигнал FRET вычисляется из отношения интенсивностей в двух каналах. Некоторые конфигурации установки дополнительно разделяют каждый спектральный канал (донор или акцептор) на две ортогональные поляризации (поэтому требуется 4 детектора) и могут одновременно измерять как FRET, так и анизотропию флуоресценции . В других конфигурациях одновременно регистрируются 3 или 4 спектральных канала для одновременного измерения нескольких пар FRET. Как непрерывные, так и импульсные лазерыможет использоваться как источник возбуждения. При использовании импульсных лазеров подходящее оборудование для сбора данных может измерять время прихода фотонов по отношению к последнему лазерному импульсу с пикосекундным разрешением в так называемом сборе с коррелированным по времени счетом одиночных фотонов (TCSPC). В этой конфигурации каждый фотон характеризуется макро-временем (т. Е. Грубой временной меткой 10-50 нс) и микровремени (т. Е. Задержкой относительно последнего лазерного импульса). Последний может использоваться для извлечения информации о сроке службы и получения сигнала FRET.

Анализ данных smFRET с иммобилизацией на поверхности [ править ]

Типичные данные smFRET для системы с двумя красителями - это временные траектории интенсивностей флуоресцентного излучения донорного красителя и акцепторного красителя, называемые двумя каналами. В основном используются два метода для получения излучения двух красителей: (1) накопительное измерение использует фиксированное время экспозиции камер для каждого кадра, таких как PMT, APD, EMCCD и CMOS-камера; (2) временная последовательность прихода одиночного фотона, измеренная с помощью детекторов PMT или APD. Принцип заключается в использовании оптических фильтров для разделения выбросов двух красителей и измерения в двух каналах. Например, в литературе объясняется установка, использующая две половины камеры устройства с зарядовой связью (ПЗС). ^[6]

Для системы с двумя красителями затем используются сигналы излучения для расчета эффективности FRET между красителями с течением времени. Эффективность FRET - это количество фотонов, испускаемых акцепторным красителем, по сравнению с суммой выбросов донорного и акцепторного красителей. Обычно возбуждается только донорный краситель, но еще более точную информацию можно получить, если поочередно возбуждают донорный и акцепторный красители. ^[7]В схеме с одним возбуждением испускание донорного и акцепторного красителей представляет собой просто количество фотонов, собранных для двух красителей, деленное на эффективности сбора фотонов двух каналов соответственно, которые являются функциями эффективности сбора, фильтра и оптической эффективности. , а также эффективность камеры в двух диапазонах длин волн. Эти коэффициенты полезного действия могут быть откалиброваны для данной инструментальной установки.

{\ displaystyle FRET = {\ frac {\ tfrac {I_ {A}} {\ eta _ {A} Q_ {A}}} {{\ tfrac {I_ {A}} {\ eta _ {A} Q_ {A} }}} + {\ tfrac {I_ {D}} {\ eta _ {D} Q_ {D}}}}}.}

где FRET - это эффективность FRET системы с двумя красителями в определенный период времени, и - это измеренные числа фотонов акцепторного и донорного каналов соответственно за тот же период времени, и - эффективности сбора фотонов двух каналов, и - квантовый выход двух красителей. Таким образом вычисляется фактическое количество фотонов, испускаемых красителем. Если эффективность сбора фотонов двух каналов схожа и фактическое расстояние FRET не интересует, можно установить два = 1, а два квантовых выхода также равны 1. ${\ displaystyle I_ {A}}$ ${\ displaystyle I_ {D}}$ ${\ displaystyle \ eta _ {A}}$ ${\ displaystyle \ eta _ {D}}$ ${\ displaystyle Q_ {A}}$ ${\ displaystyle Q_ {D}}$ $I/\eta$ $\eta$

(A) Пример временной траектории счетчиков фотонов акцепторного (красный) и донорного (синий) каналов, собранных с разрешением по времени 1 мс. (B) Данные сгруппированы с временным разрешением 10 мс для уменьшения шума. На вставке показана временная траектория smFRET, рассчитанная с помощью уравнения. Большая часть фотоотсчетов имеет большой шум, в котором преобладает зависящий от счета гауссов шум, а в небольшой области фотоотсчетов преобладает шум Пуассона.

Для данных накопленного излучения smFRET временные траектории содержат в основном следующую информацию: (1) переходы состояний, (2) шум, (3) размытие камеры (аналог размытия при движении ), (4) фотомигание и фотообесцвечивание красителей. Информация о переходе между состояниями - это информация, необходимая для типичного измерения. Однако остальные сигналы мешают анализу данных, поэтому необходимо устранить их.

Шум [ править ]

Шумовой сигнал эмиссии красителя обычно содержит шум считывания камеры, дробовой шум и белый шум , а также шум реальной выборки, каждый из которых следует своему распределению шума из-за разных источников. Шум реального образца возникает из-за теплового возмущения системы, которое приводит к расширению расстояния FRET, неравномерному распределению ориентации красителя, вариациям эмиссии красителя, быстрому миганию и кинетике, превышающей время интегрирования. Медленные изменения испускания красителя, вероятно, считаются ложноположительными состояниями, которых следует экспериментально избегать, выбирая разные красители. Другие шумы исходят от тракта возбуждения и тракта обнаружения, особенно от камеры. В конце концов, шум исходных данных о выбросах представляет собой комбинацию шумов с распределением Пуассона.и гауссово распределение. Шумы в каждом канале иногда (например, для однофотонных детекторов) можно упростить до суммирования гауссова шума, зависящего от интенсивности (чем выше счет, тем больше шум; это комбинация гауссова шума и шума Пуассона большей амплитуды, который может быть представлена функцией Гаусса) и фоновым шумом Пуассона (не зависящим от количества сигналов). Последний шум преобладает, когда канал выключен или находится в состоянии низкой интенсивности (правый рисунок). Затем шумы в двух каналах объединяются в нелинейное уравнение, указанное выше, для расчета значений FRET. Таким образом, шум на траекториях smFRET очень сложен. Шум асимметричен выше и ниже средних значений FRET, и его величина изменяется по направлению к двум концам (0 и 1) значений FRET из-за изменяющихся неопределенностей каналов A и D.Большинство шумов можно уменьшить путем объединения данных (см. Рисунок) за счет потери разрешения по времени. См. GitHub (postFRET) для примера кодов MATLAB для моделирования временных траекторий smFRET без шума и с шумом (ссылка на GitHub^[8] ).

Размытие камеры [ править ]

Размытие камеры смоделировано на примере smFRET с 3 состояниями с использованием имитатора postFRET ^[8] (два моделирования). Отношение сигнал / шум установлено на уровне около 20 для обоих симуляций. Временное разрешение моделируется на уровне 1 мс, затем дискретизируется до 10 мс, времени интегрирования смоделированных экспериментов. Константы скорости моделирования перечислены слева, небольшая часть траектории показана в середине (альтернативные цвета представляют разные молекулы), а гистограмма FRET всех молекул (100) показана справа.

Сигнал размытия камеры исходит из дискретного характера измерений. Сигнал излучения не соответствует реальному сигналу перехода, потому что один или оба являются стохастическими (случайными). Когда переход состояния происходит между считыванием двух интервалов считывания выбросов, сигнал представляет собой среднее значение двух частей в одном и том же измерительном окне, что затем влияет на точность идентификации состояния и, в конечном итоге, на анализ константы скорости. Это меньше проблема, когда частота измерения намного выше, чем скорость перехода, но становится реальной проблемой, когда они приближаются друг к другу (рисунок справа). Чтобы отразить эффект размытия камеры в смоделированных траекториях smFRET, необходимо моделировать данные с более высоким временным разрешением (например, в 10 раз быстрее), чем время сбора данных, а затем объединить данные в окончательные траектории.См. GitHub (postFRET)^[8] для примера кодов MATLAB для моделирования временных траекторий smFRET с более быстрым временным разрешением, а затем объединить его с разрешением измерения времени (время интегрирования), чтобы имитировать эффект размытия камеры.

Фотомигание и фотообесцвечивание [ править ]

Временные траектории также содержат информацию о фотообесцвечивании и фотообесцвечивании двух красителей. Эта информация должна быть удалена, что создает промежутки во временной траектории, когда информация FRET теряется. Информация о фото-мигании и фотообесцвечивании может быть удалена для типичной системы красителей с относительно длинными интервалами фото-мигания и сроками жизни фотообесцвечивания, которые были выбраны при измерении. Таким образом, они представляют меньшую проблему для анализа данных. Однако использование красителя с короткими интервалами мигания или длительным временем жизни в темном состоянии станет большой проблемой.

Алгоритмы государственной идентификации [ править ]

Для анализа данных было разработано несколько методов анализа данных, таких как методы пороговой обработки, методы скрытой марковской модели (HMM) и методы идентификации точки перехода. Методы пороговой обработки просто устанавливают порог между двумя соседними состояниями на траекториях smFRET. Значения FRET выше порога принадлежат одному состоянию, а значения ниже - другому. Этот метод работает для данных с очень высоким отношением сигнал / шум, поэтому они имеют различимые состояния FRET. Этот метод интуитивно понятен и имеет долгую историю применения. Пример исходного кода можно найти в ПО postFRET. ^[8]HMM основаны на алгоритмах, которые статистически вычисляют функции вероятности каждого присвоения состояний, т. Е. Добавляют штрафы к менее вероятному назначению. Типичные программные пакеты с открытым исходным кодом можно найти в Интернете, такие как HaMMy, vbFRET, ebFRET, SMART, SMACKS, MASH-FRET и т. Д. ^[9]^[10]^[11] Анализ точки перехода или анализ точки изменения (CPA ) использует алгоритмы для определения перехода по временной траектории с помощью статистического анализа. Например, CPA на основе теории информации Фишера и метода t-критерия Стьюдента (STaSI, открытый исходный код, ссылка на GitHub ^[12])) идентифицирует переходы между состояниями и минимизирует длину описания, выбирая оптимальное количество состояний, т. е. балансируя штраф за шум и общее количество состояний.

Список программных пакетов можно найти на сайте KinSoftChallenge. ^[13]

Анализ оценок [ править ]

После того, как состояния идентифицированы, их можно использовать для расчета расстояний передачи энергии резонанса Фёрстера и констант скорости переходов между состояниями. Для параллельной матрицы реакций между состояниями константы скорости каждого перехода не могут быть взяты из среднего времени жизни каждого перехода, которое фиксируется как обратная сумма констант скорости. Время жизни переходов из одного состояния во все другие состояния "одинаково" для одной молекулы. Однако константы скорости можно вычислить из функций вероятности, числа каждого перехода за общее время состояния, из которого он переходит. ^[14]

k_{if}={\frac {N_{if}}{\sum _{f=1}^{f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}

Пример определенной траектории состояния и гистограмма времени ожидания каждого перехода. Время жизни - это среднее значение всех времен пребывания, которое является обратной суммой всех констант скорости состояния по отношению к другим состояниям.

где i - начальное состояние, f - конечное состояние перехода, N - количество этих переходов на временных траекториях, n - общее количество состояний, k - константа скорости, t - время каждого состояния перед переход происходит. Например, можно измерить 130 секунд временных траекторий smFRET. Общее время пребывания молекулы в состоянии один составляет t ₁ = 100 секунд (с), в состоянии два - t ₂ = 20 с, а в третьем состоянии - t _3.= 10 с. Среди 100 с молекула остается в состоянии один, она переходит в состояние два 70 раз и переходит в состояние три 30 раз в конце своего времени пребывания, константа скорости из состояния 1 в состояние 2, таким образом, k ₁₂ = 70/100 = 0,7 с ^-1 , константа скорости из состояния 1 в состояние 3 составляет k ₁₃ = 30/100 = 0,3 с ^-1 . Обычно вероятности продолжительности 70-кратного или 30-кратного перехода (время задержки) распределены экспоненциально (правый рисунок). Средние времена пребывания двух распределений состояния один, то есть два времени жизни, τ ₁₂ и τ ₁₃ , одинаковы при 1 с для этих двух переходов (правый рисунок). Количество переходовN может быть общим числом переходов состояний или подобранной амплитудой экспоненциальной функции затухания накопленной гистограммы времен пребывания в состоянии. Последнее работает только для хорошо настроенных распределений времени пребывания. Система, находящаяся в равновесии с каждым состоянием, параллельным переходом ко всем остальным в реакциях первого порядка, является особым случаем для облегчения понимания. Когда система не находится в состоянии равновесия, это уравнение все еще сохраняется, но при его использовании следует проявлять осторожность.

Интерпретация приведенного выше уравнения просто основана на предположении, что все молекулы одинаковы, - эргодической гипотезе . Существование каждого состояния просто представлено его общим временем, которое является его «концентрацией». Таким образом, скорость перехода в любое другое состояние - это количество переходов, нормированное этой концентрацией. Численно временную концентрацию можно преобразовать в числовую концентрацию для имитации ансамблевого измерения. ^[14] Поскольку отдельные молекулы такие же, как и все другие молекулы, мы можем предположить, что временная траектория представляет собой случайную комбинацию множества молекул, каждая из которых занимает очень короткий промежуток времени, скажем 𝛿 t . Таким образом, «концентрация» молекулы в состоянии n равна c _n =т _н / 𝛿 т . Среди всех этих «молекул», если N _nf переходит в состояние f в течение этого времени измерения 𝛿 t , скорость перехода по определению равна r = N _nf / 𝛿 t = k _nf c _n . Таким образом, k _nf = N _nf / t _n .

Можно видеть, что измерение константы скорости отдельной молекулы зависит только от эргодической гипотезы, о которой можно судить, если измерено статистически достаточное количество отдельных молекул и наблюдаются ожидаемые хорошие распределения времени пребывания. Неоднородность между отдельными молекулами также может наблюдаться, если каждая молекула имеет различимый набор состояний или набор констант скорости.

Уменьшите уровень неопределенности [ править ]

Уровень неопределенности анализа скорости может быть оценен на основе нескольких экспериментальных испытаний, анализа начальной загрузки и анализа ошибок подгонки. Неправильное назначение состояний - распространенный источник ошибок во время анализа данных, который возникает из-за расширения состояния, шума и размытия камеры. Объединение данных , скользящее среднее и вейвлет-преобразование могут помочь уменьшить эффект расширения состояния и шума, но улучшат эффект размытия камеры.

Эффект размытия камеры может быть уменьшен за счет более высокой частоты дискретизации, что зависит от разработки более чувствительной камеры, специального анализа данных или того и другого. Традиционно в HMM точка данных до и после перехода специально назначается, чтобы уменьшить частоту неправильного присвоения этих точек данных состояниям между переходами. Однако у этого метода есть ограничение на работу. Когда частота перехода приближается к частоте дискретизации, слишком много данных размывается для того, чтобы этот метод работал (см. Выше рисунок размытия камеры).

Сообщается, что двухэтапный метод анализа данных повышает точность анализа таких данных. Идея состоит в том, чтобы смоделировать траекторию методом моделирования Монте-Карло и сравнить ее с экспериментальными данными. В правильных условиях и моделирование, и экспериментальные данные будут содержать одинаковую степень размытия информации и шума. Эта смоделированная траектория является лучшим ответом, чем необработанные экспериментальные данные, потому что ее истинное значение «известно». Этот метод имеет открытый исходный код, доступный как postFRET ^[15] (ссылка на GitHub ^[8] ) и MASH-FRET. ^[10] Этот метод также может немного скорректировать эффект негауссовского шума, который вызвал проблемы с точной идентификацией состояний с использованием статистических методов.

Текущий анализ данных для smFRET по-прежнему требует большой осторожности и специальной подготовки, которая требует, чтобы алгоритмы глубокого обучения играли роль, освобождая рабочую силу при анализе данных.

Преимущества smFRET [ править ]

Ансамблевый FRET-анализ неоднородной популяции

SmFRET позволяет проводить более точный анализ гетерогенных популяций и имеет несколько преимуществ по сравнению с ансамблевым FRET.

Одним из преимуществ изучения расстояний в отдельных молекулах является то, что гетерогенные популяции можно изучать более точно со значениями, специфичными для каждой молекулы, а не вычислять среднее значение на основе ансамбля. Это позволяет изучать конкретные однородные популяции внутри гетерогенной популяции. Например, если две существующие гомологичные популяции в гетерогенной популяции имеют разные значения FRET, ансамблевый анализ FRET даст взвешенное усредненное значение FRET для представления совокупности в целом. Таким образом, полученное значение FRET не дает данных о двух разных популяциях. Напротив, smFRET сможет различать две популяции и позволит анализировать существующие гомологичные популяции. ^[16]

SmFRET также обеспечивает динамическое временное разрешение отдельной молекулы, которое не может быть достигнуто с помощью ансамблевых измерений FRET. Ансамбль FRET обладает способностью обнаруживать хорошо заполненные переходные состояния, которые накапливаются в популяции, но ему не хватает возможности характеризовать промежуточные продукты , которые недолговечны и не накапливаются. Этот предел устраняется с помощью smFRET, который предлагает прямой способ наблюдения за промежуточными соединениями отдельных молекул независимо от накопления. Таким образом, smFRET демонстрирует способность захватывать временные субпопуляции в гетерогенной среде. ^[17]

Кинетическая информация в системе, находящейся в состоянии равновесия, теряется на уровне ансамбля, потому что ни одна из концентраций реагентов и продуктов не изменяется с течением времени. Однако на уровне одной молекулы перенос между реагентами и продуктами может происходить с измеримо высокой скоростью и стохастически сбалансирован во времени. Таким образом, отслеживание временной траектории конкретной молекулы позволяет напрямую измерять константу скорости каждого шага перехода, включая промежуточные соединения, которые скрыты на уровне ансамбля из-за их низких концентраций. Это позволяет использовать smFRET для изучения динамики сворачивания РНК . Подобно сворачиванию белка, сворачивание РНК проходит через множество взаимодействий, путей сворачивания и промежуточных звеньев, прежде чем достичь своего нативного состояния.

Также показано, что SmFRET использует трехцветную систему лучше, чем ансамбль FRET. Используя два акцепторных флуорофора, а не один, FRET может наблюдать несколько сайтов для коррелированных движений и пространственных изменений в любой сложной молекуле. Об этом свидетельствуют исследования на перекрестке Холлидей . SmFRET с трехцветной системой дает представление о синхронизированных движениях трех спиральных узлов соединения и о почти несуществовании его параллельных состояний. Ансамбль FRET также может использовать трехцветную систему. Однако любые очевидные преимущества перевешиваются требованиями трехцветной системы, которая включает четкое разделение сигналов флуорофоров. Для четкого различения сигналов перекрытия FRET должны быть небольшими, но это также ослабляет силу FRET. SmFRET исправляет ограничения перекрытия с помощью полосовых фильтров.и дихроичные зеркала, которые усиливают сигнал между двумя акцепторами флуоресценции и устраняют любые эффекты просачивания. ^[18]

Приложения [ править ]

Основное применение smFRET - анализ мельчайших биохимических нюансов, которые способствуют сворачиванию белков . В последние годы было разработано множество методов для исследования взаимодействий отдельных молекул, которые участвуют в сворачивании и разворачивании белков. Техника силового зонда с использованием атомно-силовой микроскопии и лазерного пинцета, предоставили информацию о стабильности белка. smFRET позволяет исследователям исследовать молекулярные взаимодействия с помощью флуоресценции. Форстеровский резонансный перенос энергии (FRET) был впервые применен к одиночным молекулам Ha et al. и применен к фолдингу белков в работе Hochstrasser, Weiss, et al. Преимущество smFRET в целом для анализа молекулярных взаимодействий заключается в возможности напрямую тестировать взаимодействия отдельных молекул без усреднения ансамблей данных. В анализе сворачивания белков ансамблевые эксперименты включают измерения множества белков, которые находятся в различных переходных состояниях между их свернутым и развернутым состоянием.. При усреднении структура белка, которую можно вывести из совокупности данных, дает только элементарную структурную модель сворачивания белка. Однако истинное понимание сворачивания белков требует расшифровки последовательности структурных событий вдоль путей сворачивания между свернутым и развернутым состояниями. SMFRET особенно применим именно в этой области исследований.

Исследования FRET рассчитывают соответствующие эффективности FRET в результате наблюдения событий сворачивания белков с временным разрешением . Затем эти эффективности FRET можно использовать для определения расстояний между молекулами как функции от времени. Когда белок переходит между свернутым и развернутым состояниями, соответствующие расстояния между молекулами могут указывать на последовательность молекулярных взаимодействий, которые приводят к сворачиванию белка. ^[19]

Еще одно применение smFRET - это динамика сворачивания ДНК и РНК. ^[20] Обычно два разных местоположения нуклеотида помечаются донорным и акцепторным красителями. Изменение расстояния между двумя точками изменяется со временем из-за сворачивания и разворачивания нуклеотида, а также случайной диффузии двух точек с течением времени в пределах каждого окна измерения и между разными окнами. Из-за сложности траектории складывания / развертывания чрезвычайно сложно измерить процесс на уровне ансамбля. Таким образом, smFRET становится ключевым методом в этой области. Помимо задач анализа данных smFRET, одна задача состоит в том, чтобы пометить несколько представляющих интерес позиций, другая - в двухточечной динамике для расчета общих путей сворачивания.

Одномолекулярный FRET также может применяться для изучения конформационных изменений соответствующих мотивов каналов в определенных каналах . Например, меченые тетрамерные калиевые каналы KirBac были помечены донорными и акцепторными флуорофорами в определенных местах, чтобы понять структурную динамику внутри липидной мембраны , что позволило им обобщить аналогичную динамику для аналогичных мотивов в других эукариотических каналах Kir или даже в катионе.каналы в целом. Использование smFRET в этом эксперименте позволяет визуализировать конформационные изменения, которые нельзя увидеть, если просто усреднить макроскопические измерения. Это приведет к ансамблевому анализу, а не к анализу отдельных молекул и конформационных изменений внутри, что позволит нам обобщить подобную динамику для подобных мотивов в других эукариотических каналах.

Структурная динамика канала KirBac была тщательно проанализирована как в открытом, так и в закрытом состояниях, в зависимости от присутствия лиганда PIP2 . Часть результатов на основе smFRET продемонстрировала структурную жесткость внеклеточной области. Фильтр селективности и внешняя петля области фильтра селективности были помечены флуорофорами, и наблюдали конформационное связывание. Отдельные траектории smFRET убедительно продемонстрировали эффективность FRET около 0,8 без флуктуаций, независимо от состояния канала. ^[21]

Недавно одномолекулярный FRET был применен для количественного обнаружения ДНК-мишени и для распознавания однонуклеотидного полиморфизма. В отличие от ансамбля FRET, одномолекулярный FRET позволяет в реальном времени отслеживать события связывания мишени. Кроме того, низкий фон, высокое отношение сигнал / шум, наблюдаемое с помощью метода одномолекулярного FRET, приводит к сверхчувствительности (предел обнаружения в диапазоне фемтомолей). предел обнаружения.

Ограничения [ править ]

Несмотря на приблизительные оценки, ограничением smFRET является сложность определения правильного расстояния, связанного с передачей энергии. Требование точной оценки расстояния создает серьезную проблему, потому что флуоресценция донорных и акцепторных флуорофоров, а также передача энергии зависят от окружающей среды и ориентации красителей, которые могут варьироваться в зависимости от гибкости того, где находится флуорофоры связаны. Этот вопрос, однако, не особенно актуален, если оценку расстояния между двумя флуорофорами не нужно определять с точной и абсолютной точностью. ^[6]

Извлечение кинетической информации из сложной биологической системы со скоростью перехода около нескольких миллисекунд или ниже остается сложной задачей. Текущее временное разрешение таких измерений обычно находится на уровне миллисекунд, а несколько отчетов - на уровне микросекунд. Есть теоретическое ограничение со стороны фотофизики красителя. Время жизни возбужденного состояния типичной молекулы органического красителя составляет около 1 наносекунды. Для получения статистической достоверности значений FRET требуются от десятков до сотен фотонов, что обеспечивает наилучшее возможное временное разрешение порядка 1 микросекунды. Чтобы достичь этого предела, требуется очень сильный свет (плотность мощности порядка 1 × 10 ¹⁰ Вт / м ² , 10 ⁷Солнце обычно достигается путем фокусировки лазерного луча с помощью микроскопа), что часто приводит к фотоповреждению органических молекул. Другим ограничением является время жизни красителя при фотообесцвечивании, которое зависит от интенсивности света и окислительно-восстановительного стресса окружающей среды. Время жизни фотообесцвечивания типичного органического красителя в типичных экспериментальных условиях (плотность мощности лазера всего несколько солнечных лучей) составляет несколько секунд или несколько минут с помощью растворов поглотителей кислорода. Таким образом, кинетические события продолжительностью более нескольких минут трудно исследовать с помощью органических красителей. Вместо органических красителей следует использовать другие зонды с более длительным сроком службы, такие как квантовые точки, полимерные точки и полностью неорганические красители.

Ссылки [ править ]

^ Мёрнер В.Е., Фромм Д.П. (01.08.2003). «Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул» . Обзор научных инструментов . 74 (8): 3597–3619. DOI : 10.1063 / 1.1589587 . ISSN 0034-6748 .
^ Michalet X, Colyer RA, Scalia G, Ingargiola A, Lin R, Millaud JE, Weiss S, Siegmund OH, Tremsin AS, Vallerga JV, Cheng A, Levi M, Aharoni D, Arisaka K, Villa F, Guerrieri F, Panzeri F, Rech I, Gulinatti A, Zappa F, Ghioni M, Cova S (февраль 2013 г.). «Разработка новых детекторов счета фотонов для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул» . Философские труды Лондонского королевского общества. Серия B, Биологические науки . 368 (1611): 20120035. DOI : 10.1098 / rstb.2012.0035 . PMC 3538434 . PMID 23267185 .
^ Ха - T, T Эндерл, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Вайс S (июнь 1996). «Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (13): 6264–8. DOI : 10.1073 / pnas.93.13.6264 . PMC 39010 . PMID 8692803 .
^ Hellenkamp В, Вортмане Р, Р Kandzia, Захаеся М, Hugel Т (февраль 2017 г.). «Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемая самосогласованными сетями FRET» . Методы природы . 14 (2): 176–182. DOI : 10.1038 / nmeth.4081 . PMC 5289555 . PMID 27918541 .
^ Kastantin M, Шварц DK (декабрь 2011). «Соединение редких конформаций ДНК и динамики поверхности с помощью одномолекулярного резонансного переноса энергии» . САУ Нано . 5 (12): 9861–9. DOI : 10.1021 / nn2035389 . PMC 3246573 . PMID 21942411 .
^ а б Рой Р., Хунг С., Ха Т (июнь 2008 г.). «Практическое руководство по одномолекулярному FRET» . Методы природы . 5 (6): 507–16. DOI : 10.1038 / nmeth.1208 . PMC 3769523 . PMID 18511918 .
^ Hellemkamp B, Schmid S и др. (Сентябрь 2018 г.). «Прецизионность и точность измерений FRET одиночных молекул - эталонное исследование в нескольких лабораториях» . Методы природы . 15 (9): 669–676. DOI : 10.1038 / s41592-018-0085-0 . PMC 6121742 . PMID 30171252 .
^ а б в г д https://github.com/nkchenjx/postFRET
^ Даниал JS, Гарсиа-Sáez AJ (октябрь 2017). «Повышение достоверности визуализации отдельных молекул». Текущее мнение в структурной биологии . 46 : 24–30. DOI : 10.1016 / j.sbi.2017.04.007 . PMID 28482279 .
^ a b Börner R, Kowerko D, Hadzic MC, König SL, Ritter M, Sigel RK (2018). "Моделирование экспериментов по флуоресценции одиночных молекул на основе камеры" . PLOS ONE . 13 (4): e0195277. DOI : 10.1371 / journal.pone.0195277 . PMC 5898730 . PMID 29652886 .
Перейти ↑ Schmid S, Goetz M, Hugel T (2016). "Анализ одиночных молекул вне времени пребывания: демонстрация и оценка в и из равновесия" . Биофизический журнал . 111 (7): 1375–1384. DOI : 10.1016 / j.bpj.2016.08.023 . PMC 5052450 . PMID 27705761 .
^ https://github.com/LandesLab/STaSI
^ https://sites.google.com/view/kinsoftchallenge/tools
^ а б Чен, Цзисинь; Пайл, Джозеф Р .; Си Пьекко, Курт Вальдо; Коломейский, Анатолий Б .; Ландес, Кристи Ф. (2016). «Дополнительная информация для: Двухэтапного метода анализа данных smFRET» (PDF) . Журнал физической химии B . 120 (29): 7128–7132. DOI : 10.1021 / acs.jpcb.6b05697 . PMID 27379815 .
^ Chen J, Пайл JR, Sy Piecco KW, Kolomeisky AB, Ланды CF (июль 2016). «Двухэтапный метод анализа данных smFRET» . Журнал физической химии B . 120 (29): 7128–32. DOI : 10.1021 / acs.jpcb.6b05697 . PMID 27379815 .
↑ Ha T (сентябрь 2001 г.). «Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул» . Методы . 25 (1): 78–86. DOI : 10,1006 / meth.2001.1217 . PMID 11558999 .
^ Hinterdorfer P, van Oijen A, ред. (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул (1-е изд.). Дордрехт: Спрингер. ISBN 978-0-387-76497-9.
^ Hohng S, Joo C, T Ha (август 2004). «Одномолекулярный трехцветный FRET» . Биофизический журнал . 87 (2): 1328–37. DOI : 10.1529 / biophysj.104.043935 . PMC 1304471 . PMID 15298935 .
↑ Schuler B, Eaton WA (февраль 2008 г.). «Сворачивание белков изучено с помощью одномолекулярного FRET» . Текущее мнение в структурной биологии . Сворачивание и связывание / Взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. 18 (1): 16–26. DOI : 10.1016 / j.sbi.2007.12.003 . PMC 2323684 . PMID 18221865 .
↑ Chen J, Poddar NK, Tauzin LJ, Cooper D, Kolomeisky AB, Landes CF (25 сентября 2014 г.). "Одномолекулярные FRET исследования динамики разворачивания шпильки ВИЧ TAR – ДНК" . Журнал физической химии B . 118 (42): 12130–12139. DOI : 10.1021 / jp507067p . PMC 4207534 . PMID 25254491 .
^ Ван S, R Vafabakhsh, Borschel ВФ, Ха Т, Николс CG (январь 2016). «Структурная динамика стробирования калиевого канала, выявленная с помощью одномолекулярного FRET» . Структурная и молекулярная биология природы . 23 (1): 31–36. DOI : 10.1038 / nsmb.3138 . PMC 4833211 . PMID 26641713 .

Внешние ссылки [ править ]

Лаборатория Нильса Уолтера, Мичиганский университет
Центр анализа отдельных молекул в режиме реального времени (SMART), Мичиганский университет
Лаборатория Ха, Медицинская школа Джонса Хопкинса
Лаборатория Бланшара, Корнельский университет
Schuler Research Group, Цюрихский университет
Лаборатория Венингера, Государственный университет Северной Каролины
Группа исследований Капанидиса, Оксфордский университет
Zhuang Research Group, Гарвардский университет
Schwartz Research Group, CU-Boulder
Landes Research Group, Университет Райса
Chen Research Group, Университет Огайо
Янская исследовательская группа, Принстонский университет
Komatsuzaki Research Group, Университет Хоккайдо
Weiss Research Group, Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе
Gonzalez Research Group, Колумбийский университет
Исследовательская группа Hugel, Фрайбургский университет

[1] Мёрнер В.Е., Фромм Д.П. (01.08.2003). «Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул» . Обзор научных инструментов . 74 (8): 3597–3619. DOI : 10.1063 / 1.1589587 . ISSN 0034-6748 .

[2] Michalet X, Colyer RA, Scalia G, Ingargiola A, Lin R, Millaud JE, Weiss S, Siegmund OH, Tremsin AS, Vallerga JV, Cheng A, Levi M, Aharoni D, Arisaka K, Villa F, Guerrieri F, Panzeri F, Rech I, Gulinatti A, Zappa F, Ghioni M, Cova S (февраль 2013 г.). «Разработка новых детекторов счета фотонов для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул» . Философские труды Лондонского королевского общества. Серия B, Биологические науки . 368 (1611): 20120035. DOI : 10.1098 / rstb.2012.0035 . PMC 3538434 . PMID 23267185 .

[3] Ха - T, T Эндерл, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Вайс S (июнь 1996). «Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (13): 6264–8. DOI : 10.1073 / pnas.93.13.6264 . PMC 39010 . PMID 8692803 .

[4] Hellenkamp В, Вортмане Р, Р Kandzia, Захаеся М, Hugel Т (февраль 2017 г.). «Многодоменная структура и коррелированная динамика, определяемая самосогласованными сетями FRET» . Методы природы . 14 (2): 176–182. DOI : 10.1038 / nmeth.4081 . PMC 5289555 . PMID 27918541 .

[5] Kastantin M, Шварц DK (декабрь 2011). «Соединение редких конформаций ДНК и динамики поверхности с помощью одномолекулярного резонансного переноса энергии» . САУ Нано . 5 (12): 9861–9. DOI : 10.1021 / nn2035389 . PMC 3246573 . PMID 21942411 .

[Roy_2008-6] а б Рой Р., Хунг С., Ха Т (июнь 2008 г.). «Практическое руководство по одномолекулярному FRET» . Методы природы . 5 (6): 507–16. DOI : 10.1038 / nmeth.1208 . PMC 3769523 . PMID 18511918 .

[7] Hellemkamp B, Schmid S и др. (Сентябрь 2018 г.). «Прецизионность и точность измерений FRET одиночных молекул - эталонное исследование в нескольких лабораториях» . Методы природы . 15 (9): 669–676. DOI : 10.1038 / s41592-018-0085-0 . PMC 6121742 . PMID 30171252 .

[postFRET_Github-8] а б в г д https://github.com/nkchenjx/postFRET

[9] Даниал JS, Гарсиа-Sáez AJ (октябрь 2017). «Повышение достоверности визуализации отдельных молекул». Текущее мнение в структурной биологии . 46 : 24–30. DOI : 10.1016 / j.sbi.2017.04.007 . PMID 28482279 .

[e0195277-10] Börner R, Kowerko D, Hadzic MC, König SL, Ritter M, Sigel RK (2018). "Моделирование экспериментов по флуоресценции одиночных молекул на основе камеры" . PLOS ONE . 13 (4): e0195277. DOI : 10.1371 / journal.pone.0195277 . PMC 5898730 . PMID 29652886 .

[11] Перейти ↑ Schmid S, Goetz M, Hugel T (2016). "Анализ одиночных молекул вне времени пребывания: демонстрация и оценка в и из равновесия" . Биофизический журнал . 111 (7): 1375–1384. DOI : 10.1016 / j.bpj.2016.08.023 . PMC 5052450 . PMID 27705761 .

[12] ttps://github.com/LandesLab/STaSI

[13] ttps://sites.google.com/view/kinsoftchallenge/tools

[postFRET-14] а б Чен, Цзисинь; Пайл, Джозеф Р .; Си Пьекко, Курт Вальдо; Коломейский, Анатолий Б .; Ландес, Кристи Ф. (2016). «Дополнительная информация для: Двухэтапного метода анализа данных smFRET» (PDF) . Журнал физической химии B . 120 (29): 7128–7132. DOI : 10.1021 / acs.jpcb.6b05697 . PMID 27379815 .

[15] Chen J, Пайл JR, Sy Piecco KW, Kolomeisky AB, Ланды CF (июль 2016). «Двухэтапный метод анализа данных smFRET» . Журнал физической химии B . 120 (29): 7128–32. DOI : 10.1021 / acs.jpcb.6b05697 . PMID 27379815 .

[16] Ha T (сентябрь 2001 г.). «Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул» . Методы . 25 (1): 78–86. DOI : 10,1006 / meth.2001.1217 . PMID 11558999 .

[17] Hinterdorfer P, van Oijen A, ред. (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул (1-е изд.). Дордрехт: Спрингер. ISBN 978-0-387-76497-9.

[18] Hohng S, Joo C, T Ha (август 2004). «Одномолекулярный трехцветный FRET» . Биофизический журнал . 87 (2): 1328–37. DOI : 10.1529 / biophysj.104.043935 . PMC 1304471 . PMID 15298935 .

[19] Schuler B, Eaton WA (февраль 2008 г.). «Сворачивание белков изучено с помощью одномолекулярного FRET» . Текущее мнение в структурной биологии . Сворачивание и связывание / Взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. 18 (1): 16–26. DOI : 10.1016 / j.sbi.2007.12.003 . PMC 2323684 . PMID 18221865 .

[20] Chen J, Poddar NK, Tauzin LJ, Cooper D, Kolomeisky AB, Landes CF (25 сентября 2014 г.). "Одномолекулярные FRET исследования динамики разворачивания шпильки ВИЧ TAR – ДНК" . Журнал физической химии B . 118 (42): 12130–12139. DOI : 10.1021 / jp507067p . PMC 4207534 . PMID 25254491 .

[21] Ван S, R Vafabakhsh, Borschel ВФ, Ха Т, Николс CG (январь 2016). «Структурная динамика стробирования калиевого канала, выявленная с помощью одномолекулярного FRET» . Структурная и молекулярная биология природы . 23 (1): 31–36. DOI : 10.1038 / nsmb.3138 . PMC 4833211 . PMID 26641713 .

[1]