Полное внутреннее отражение флуоресцентный микроскоп ( TIRFM ) представляет собой тип микроскопа , с которым , как правило , может быть меньше , чем 200 нм , тонкая область образца, наблюдается .
Фон [ править ]
В клетке и молекулярной биологии , большое количество молекулярных событий в клеточных поверхностей , таких как клеточной адгезии , связывание клеток с помощью гормонов , секреции из нейротрансмиттеров и динамики мембран были исследованы с помощью обычных микроскопов флуоресценции . Однако флуорофоры , которые связаны с поверхностью образца, и флуорофоры в окружающей среде существуют в равновесии.государственный. Когда эти молекулы возбуждаются и обнаруживаются с помощью обычного флуоресцентного микроскопа, результирующая флуоресценция этих флуорофоров, связанных с поверхностью, часто подавляется фоновой флуоресценцией из-за гораздо большей популяции несвязанных молекул. TIRFM позволяет избирательно возбуждать поверхностно-связанные флуорофоры, в то время как несвязанные молекулы не возбуждаются и не флуоресцируют. Из-за субмикронной селективности поверхности TIRFM стал предпочтительным методом обнаружения одиночных молекул.
Обзор [ править ]
Идея использования полного внутреннего отражения для освещения клеток, контактирующих с поверхностью стекла, была впервые описана Э. Дж. Амброузом в 1956 году. [1] Затем эта идея была расширена Дэниелом Аксельродом [2] из Мичиганского университета в Анн-Арборе в начале 1980-х как TIRFM. TIRFM использует исчезающую волну для выборочного освещения и возбуждения флуорофоров в ограниченной области образца, непосредственно примыкающей к границе раздела стекло-вода. Затухающее электромагнитное поле экспоненциально затухает от границы раздела и, таким образом, проникает в среду образца на глубину всего примерно 100 нм. Таким образом, TIRFM позволяет избирательно визуализировать участки поверхности, такие как базальная плазматическая мембрана.(которые имеют толщину около 7,5 нм) клеток, как показано на рисунке выше. Обратите внимание, однако, что визуализируемая область имеет ширину не менее нескольких сотен нанометров, поэтому цитоплазматическая зона непосредственно под плазматической мембраной обязательно визуализируется в дополнение к плазматической мембране во время микроскопии TIRF. Избирательная визуализация плазматической мембраны отображает особенности и события на плазматической мембране живых клеток с высоким осевым разрешением .
TIRF также может быть использован для наблюдения флуоресценции одной молекулы , [3] [4] делает его важным инструментом биофизики и количественной биологии. Микроскопия TIRF также применялась для обнаружения одиночных молекул ДНК-биомаркеров и распознавания SNP. [5]
Было показано, что цис-геометрия (TIRFM через объектив) и транс-геометрия (TIRFM на основе призм и световодов) обеспечивает различное качество эффекта полного внутреннего отражения. В случае транс-геометрии световой путь возбуждения и канал излучения разделены, в то время как в случае TIRFM объективного типа они разделяют объектив и другие оптические элементы микроскопа. Было показано, что геометрия на основе призмы генерирует чистую затухающую волну, экспоненциальное затухание которой близко к теоретически предсказанной функции. [6] В случае объективного TIRFM, однако, исчезающая волна загрязнена интенсивным рассеянным светом.. Было показано, что интенсивность рассеянного света составляет 10-15% от затухающей волны, что затрудняет интерпретацию данных, полученных с помощью TIRFM объективного типа [7] [8]
Ссылки [ править ]
- ↑ Амвросий, EJ (24 ноября 1956). «Поверхностный контактный микроскоп для изучения движений клеток». Природа . 178 (4543): 1194. Bibcode : 1956Natur.178.1194A . DOI : 10.1038 / 1781194a0 . PMID 13387666 . S2CID 4290898 .
- Перейти ↑ Axelrod, D. (1 апреля 1981 г.). «Контакты клетка-субстрат освещаются флуоресценцией полного внутреннего отражения» . Журнал клеточной биологии . 89 (1): 141–145. DOI : 10,1083 / jcb.89.1.141 . PMC 2111781 . PMID 7014571 .
- ^ Yanagida, Тошио; Сако, Ясуши; Миноччи, Сигэру (10 февраля 2000 г.). «Визуализация одной молекулы передачи сигналов EGFR на поверхности живых клеток». Природа клеточной биологии . 2 (3): 168–172. DOI : 10.1038 / 35004044 . PMID 10707088 . S2CID 25515586 .
- ^ Андре и др. Кросс-коррелированный tirf / afm обнаруживает асимметричное распределение генерирующих силу головок вдоль самоорганизующихся синтетических миозиновых филаментов. Биофизический журнал, 96: 1952–1960, 2009.
- ^ Сапкота, К .; и другие. (2019). «Одношаговое обнаружение ДНК фемтомолей на основе FRET» . Датчики . 19 (16): 3495. DOI : 10,3390 / s19163495 . PMID 31405068 .
- ^ Амвросий, Вт; и другие. (1999). «Обнаружение одиночных молекул с возбуждением полного внутреннего отражения: сравнение сигнала с фоновым и суммарным сигналами в различных геометриях». Цитометрия . 36 (3): 224–31. DOI : 10.1002 / (sici) 1097-0320 (19990701) 36: 3 <224 :: aid-cyto12> 3.0.co; 2-j . PMID 10404972 .
- ^ Mattheyses А. и Аксельрод, D. (2006). «Прямое измерение профиля затухающего поля, созданного объективным TIRF». J Biomed Opt . 11 : 014006A. DOI : 10.1117 / 1.2161018 . PMID 16526883 .
- ^ Brunstein М, Teremetz М, Эро К, Tourain С, Oheim, М. (2014). «Устранение нежелательного возбуждения в дальней зоне в TIRF объективного типа. Часть I.» Биофиз. Дж . 106 (5): 1020. Bibcode : 2014BpJ ... 106.1020B . DOI : 10.1016 / j.bpj.2013.12.049 . PMC 4026778 . PMID 24606927 . CS1 maint: multiple names: authors list (link)
- Аксельрод, Даниэль (1 ноября 2001 г.). "Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии" (PDF) . Трафик . 2 (11): 764–774. DOI : 10.1034 / j.1600-0854.2001.21104.x . ЛВП : 2027,42 / 72779 . PMID 11733042 . S2CID 15202097 .
Внешние ссылки [ править ]
- Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров Carl Zeiss Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров.
- Микроскопия TIRF: Введение и применение Учебное пособие по TIRF от Microscopy U
- TIRF Microscopy: Обзор TIRF Tutorial from Olympus Microscopy Resource Center
- Olympus TIRFM Microscopes коммерческие системы микроскопов TIRF
- Carl Zeiss Laser TIRF 3 коммерческие микроскопы TIRF
- TIRF-микроскопия на основе световодов и призм TIRF-Labs.com: Коммерческая TIRF-микроскопия и спектроскопия. Выбор геометрии TIRFM для вашего приложения
- TIRF FLIM микроскопия Lambert Instruments TIRF - FLIM микроскопия
- Schwartz Research Group, CU-Boulder Исследовательская группа по визуализации одиночных молекул
