Двумерная хроматография - это тип хроматографической техники, при которой вводимый образец разделяется путем прохождения через две разные стадии разделения. Две разные хроматографические колонки подключаются последовательно, и сток из первой системы переносится на вторую колонку. [1] Обычно вторая колонка имеет другой механизм разделения, так что полосы, которые плохо отделяются от первой колонки, могут быть полностью отделены во второй колонке. (Например, обращенно-фазовая хроматография C18за колонкой может следовать фенильная колонка.) С другой стороны, две колонки могут работать при разных температурах. Во время второй стадии разделения скорость, с которой происходит разделение, должна быть выше, чем на первой стадии, поскольку все еще остается только один детектор. Плоская поверхность поддается последовательному проявлению в двух направлениях с использованием двух разных растворителей.
История
Современные методы двумерной хроматографии основаны на результатах ранних разработок бумажной хроматографии и тонкослойной хроматографии, которые включали жидкие подвижные фазы и твердые неподвижные фазы. Эти методы позже позволят создать современный анализ газовой хроматографии и жидкостной хроматографии . Различные комбинации одномерной ГХ и ЖХ позволили получить аналитическую хроматографическую технику, известную как двумерная хроматография.
Самая ранняя форма 2D-хроматографии представляла собой многоступенчатое разделение методом ТСХ, при котором сначала используется тонкий лист целлюлозы с одним растворителем в одном направлении, а затем, после того, как бумага высохла, другой растворитель запускается в направление под прямым углом к первому. Эта методология впервые появилась в литературе в 1944 году в публикации AJP Martin и его сотрудников, в которой подробно описывался эффективный метод разделения аминокислот - «... но двухмерная хроматограмма особенно удобна, поскольку она позволяет с первого взгляда отображать информацию, которая может быть иначе получилось только в результате многочисленных экспериментов »(Biochem J., 1944, 38, 224).
Примеры
Двумерное разделение можно проводить с помощью газовой или жидкостной хроматографии . Были разработаны различные стратегии связывания для «повторной выборки» из первого столбца во второй. Некоторыми важными аппаратными средствами для двумерного разделения являются переключатель Динса и модулятор, которые выборочно переносят элюент первого измерения в колонку второго измерения [2]
Главное преимущество двумерных методов состоит в том, что они позволяют значительно увеличить пиковую мощность, не требуя чрезвычайно эффективного разделения в любой из колонок. (Например, если первая колонка предлагает пиковую емкость (k 1 ), равную 100 для 10-минутного разделения, а вторая колонка предлагает пиковую емкость 5 (k 2 ) при 5-секундном разделении, то объединенный пик емкость может приближаться к k 1 × k 2 = 500, при этом общее время разделения все еще составляет ~ 10 минут). Двухмерное разделение применялось для анализа бензина и других нефтяных смесей, а в последнее время и для белковых смесей. [3] [4]
Тандемная масс-спектрометрия
Тандемная масс-спектрометрия (тандемная МС или МС / МС) использует два масс-анализатора последовательно для разделения более сложных смесей аналитов. Преимущество тандемного МС состоит в том, что он может быть намного быстрее, чем другие двухмерные методы, со временем в диапазоне от миллисекунд до секунд. [5] Поскольку в МС нет разбавления растворителями, вероятность помех меньше, поэтому тандемная МС может быть более чувствительной и иметь более высокое отношение сигнал / шум по сравнению с другими двумерными методами. Основным недостатком тандемной МС является высокая стоимость необходимого оборудования. Цены могут варьироваться от 500 000 до 1 миллиона долларов. [6] Многие формы тандемных МС включают этап массового отбора и этап фрагментации. Первый масс-анализатор можно запрограммировать так, чтобы пропускать только молекулы с определенным отношением массы к заряду. Затем второй масс-анализатор может фрагментировать молекулу, чтобы определить ее идентичность. Это может быть особенно полезно для разделения молекул с одинаковой массой (то есть белков с одинаковой массой или молекулярных изомеров). Для достижения различных эффектов можно объединить различные типы масс-анализаторов. Одним из примеров может быть система TOF - Quadrople . Ионы могут быть последовательно фрагментированы и / или проанализированы в квадруполе по мере того, как они покидают TOF в порядке увеличения m / z. Другой распространенный тандемный масс-спектрометр - четырехквадрупольный-квадрупольный (QQQ) анализатор. Первый квадруполь разделяется по массе, столкновения происходят во второй четверке, а осколки разделяются по массе в третьем квадруполе.
Газовая хроматография-масс-спектрометрия
Газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) - это метод двумерной хроматографии, который сочетает в себе метод разделения газовой хроматографии с методом идентификации масс-спектрометрии . ГХ-МС - единственный наиболее важный аналитический инструмент для анализа летучих и полулетучих органических соединений в сложных смесях. [7] Сначала образец вводится во вход ГХ, где он испаряется и проталкивается через колонку газом-носителем, обычно гелием. Анализируемые вещества в образце разделяются на основе их взаимодействия с покрытием колонки или неподвижной фазой и газом-носителем или подвижной фазой. [8] Соединения, элюированные из колонки, преобразуются в ионы посредством электронного удара (EI) или химической ионизации (CI) перед прохождением через масс-анализатор. [9] Масс-анализатор служит для разделения ионов на основе массы к заряду. Популярные варианты выполняют ту же функцию, но отличаются способом разделения. [10] Анализаторы, обычно используемые с ГХ-МС, - это времяпролетный масс-анализатор и квадрупольный масс-анализатор . [8] После выхода из масс-анализатора аналиты достигают детектора и вырабатывают сигнал, который считывается компьютером и используется для создания газовой хроматограммы и масс-спектра. Иногда ГХ-МС использует два газовых хроматографа в особенно сложных образцах для получения значительной разделительной способности и возможности однозначно отнести конкретные частицы к соответствующим пикам с помощью метода, известного как GCxGC- (MS). [11] В конечном счете, ГХ-МС - это метод, используемый во многих аналитических лабораториях, и это очень эффективный и адаптируемый аналитический инструмент.
Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия
Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ / МС) сочетает хроматографическое разделение высокого разрешения с детектированием МС. Поскольку в системе используется ВЭЖХ с высоким разделением, аналиты, находящиеся в жидкой подвижной фазе, часто ионизируются различными методами мягкой ионизации, включая химическую ионизацию при атмосферном давлении (APCI), ионизацию электрораспылением (ESI) или лазерную десорбцию / ионизацию с использованием матрицы (MALDI ), который обеспечивает ионизацию газовой фазы, необходимую для взаимодействия с МС. [ необходима цитата ] Эти методы ионизации позволяют анализировать более широкий диапазон биологических молекул, включая молекулы с большей массой, термически нестабильные или нелетучие соединения, анализ которых с помощью ГХ-МС обычно невозможен.
ЖХ-МС обеспечивает высокую селективность, поскольку неразрешенные пики можно выделить, выбрав определенную массу. Кроме того, лучшая идентификация также достигается с помощью масс-спектров, и пользователю не нужно полагаться исключительно на время удерживания аналитов. В результате информация о молекулярной массе и структуре, а также количественные данные могут быть получены с помощью ЖХ-МС. [9] Таким образом, ЖХ-МС может применяться в различных областях, таких как идентификация примесей и профилирование при разработке лекарств и фармацевтическом производстве, поскольку ЖХ обеспечивает эффективное разделение примесей, а МС обеспечивает структурную характеристику для профилирования примесей. [12]
Обычные растворители, используемые в нормальной или обращенно-фазовой ЖХ, такие как вода, ацетонитрил и метанол, все совместимы с ESI, но растворитель класса ЖХ может не подходить для МС. Кроме того, следует избегать использования буферов, содержащих неорганические ионы, поскольку они могут загрязнять источник ионов. [13] Тем не менее, проблема может быть решена с помощью 2D ЖХ-МС, а также других различных проблем, включая коэлюзию аналита и реакцию УФ-обнаружения. [14]
Жидкостная хроматография-жидкостная хроматография
Двумерная жидкостная хроматография (2D-ЖХ) объединяет два отдельных анализа жидкостной хроматографии в один анализ данных. Современная двухмерная жидкостная хроматография зародилась в конце 1970-х - начале 1980-х годов. В это время гипотетические принципы 2D-ЖХ доказывались с помощью экспериментов, проводимых наряду с дополнительной концептуальной и теоретической работой. Было показано, что 2D-ЖХ может предложить немного большую разрешающую способность по сравнению с традиционными методами одномерной жидкостной хроматографии. В 1990-х годах техника 2D-ЖХ сыграла важную роль в разделении чрезвычайно сложных веществ и материалов, используемых в исследованиях протеомики и полимеров. К сожалению, было показано, что этот метод имеет существенный недостаток, когда дело касалось времени анализа. Ранняя работа с 2D-ЖХ ограничивалась небольшой частью разделения жидкой фазы из-за длительного времени анализа оборудования. Современные методы 2D-ЖХ решают этот недостаток и значительно сокращают то, что когда-то было опасным. Современная 2D-ЖХ имеет инструментальные возможности для разделения с высоким разрешением, которое может быть выполнено за час или меньше. Из-за растущей потребности в инструментах для выполнения анализа веществ растущей сложности с лучшими пределами обнаружения, развитие 2D-ЖХ продвигается вперед. Инструментальные партии стали основным направлением отрасли, и их стало намного проще получить, чем раньше. До этого 2D-ЖХ выполнялась с использованием компонентов приборов 1D-ЖХ и приводила к результатам разной степени как по точности, так и по прецизионности. Снижение нагрузки на инструментальную инженерию позволило провести новаторские работы в области и технике 2D-ЖХ.
Целью использования этого метода является разделение смесей, которые в противном случае невозможно разделить эффективно при одномерной жидкостной хроматографии. Двумерная жидкостная хроматография лучше подходит для анализа сложных смесей образцов, таких как моча, вещества из окружающей среды и судебно-медицинские доказательства, такие как кровь.
Трудности разделения смесей можно объяснить сложностью смеси в том смысле, что разделение не может происходить из-за количества различных стоков в соединении. Другая проблема, связанная с одномерной жидкостной хроматографией, связана с трудностями, связанными с разделением близкородственных соединений. Близкородственные соединения обладают схожими химическими свойствами, которые может оказаться трудным для разделения в зависимости от полярности, заряда и т. Д. [15] Двумерная жидкостная хроматография обеспечивает разделение на основе более чем одного химического или физического свойства. Используя пример от Nagy и Vekey, смесь пептидов может быть разделена на основе их основности, но аналогичные пептиды могут плохо элюироваться. Используя последующую технику ЖХ, сходную основность между пептидами можно дополнительно разделить, используя различия в неполярном характере. [16]
В результате, чтобы иметь возможность более эффективно разделять смеси, последующий ЖХ-анализ должен использовать совершенно другую селективность разделения по сравнению с первой колонкой. Согласно Буши и Йоргенсону, еще одним требованием для эффективного использования двухмерной жидкостной хроматографии является использование высоко ортогональных методов, что означает, что эти два метода разделения должны быть как можно более разными. [17]
Есть две основные классификации 2D жидкостной хроматографии. К ним относятся: комплексная двухмерная жидкостная хроматография (LCxLC) и двумерная жидкостная хроматография Heart-Cut (ЖХ-ЖХ). [18] В комплексной 2D-ЖХ все пики от элюирования колонки полностью отбираются, но не было сочтено необходимым переносить всю пробу из первой колонки во вторую. Часть пробы отправляется в отходы, а остальная часть отправляется в пробоотборный клапан. При двумерной ЖХ с резким сокращением сердца нацеливаются специфические пики, при этом только небольшая часть пика вводится во вторую колонку. 2D-ЖХ с разрезанием сердца оказалась весьма полезной для анализа проб веществ, которые не являются очень сложными, при условии, что они имеют схожие характеристики удерживания. По сравнению с комплексным методом 2D-ЖХ, 2D-ЖХ с разрезом сердца представляет собой эффективный метод с гораздо меньшими затратами на настройку системы и гораздо более низкими эксплуатационными расходами. Множественное вырезание сердца (mLC-LC) можно использовать для выборки множественных пиков из анализа первого измерения без риска временного перекрытия анализа во втором измерении. [18] Многократное вырезание сердца (mLC-LC) использует установку нескольких петель отбора проб.
Для 2D-ЖХ пиковая емкость является очень важным вопросом. Его можно получить, используя разделение градиентным элюированием, с гораздо большей эффективностью, чем изократическое разделение при разумном количестве времени. Хотя изократическое элюирование намного проще в быстрой шкале времени, предпочтительно выполнять разделение градиентным элюированием во втором измерении. Сила подвижной фазы варьируется от слабого состава элюента до более сильного. На основе линейной теории силы растворителя (LSST) градиентного элюирования для обращенно-фазовой хроматографии ниже показана взаимосвязь между временем удерживания, инструментальными переменными и параметрами растворенного вещества. [18]
t R = t 0 + t D + t 0 / b * ln (b * (k 0 -t d / t 0 ) + 1)
Несмотря на то, что за годы, прошедшие с тех пор, как 2D-ЖХ стала основной аналитической хроматографической техникой, было выполнено много новаторских работ, остается еще много современных проблем, которые необходимо учитывать. Еще предстоит определиться с большим количеством экспериментальных переменных, и методика постоянно находится в стадии разработки.
Газовая хроматография - газовая хроматография
Комплексная двухмерная газовая хроматография - это аналитический метод разделения и анализа сложных смесей. Он использовался в таких областях, как ароматизация, ароматизаторы, исследования окружающей среды, фармацевтика, нефтепродукты и судебная медицина. GCxGC обеспечивает высокий диапазон чувствительности и большую мощность разделения за счет увеличенной пиковой емкости.
Смотрите также
- Двумерный гель-электрофорез
Рекомендации
- ^ Vékey, Кара; Вертес, Акос; Телекес, Андраш (2008). Медицинские применения масс-спектрометрии . ISBN Elsevier BV 9780444519801.
- ^ Шариф К.М., Чин С.Т., Кульсинг К., Marriott PJ (сентябрь 2016 г.). «Микрожидкостный переключатель Дина: 50 лет прогресса, инноваций и применения». Направления аналитической химии . 82 : 35–54. DOI : 10.1016 / j.trac.2016.05.005 .
- ^ Бломберг Дж., Шенмакерс П. Дж., Бинс Дж., Тейссен Р. (1997). «Комплексная двумерная газовая хроматография (ГХ × ГХ) и ее применимость для характеристики сложных (нефтехимических) смесей». Журнал хроматографии высокого разрешения . 20 (10): 539–544. DOI : 10.1002 / jhrc.1240201005 .
- ^ Столл Д.Р., Ван X, Карр П.В. (январь 2008 г.). «Сравнение практической разрешающей способности одно- и двумерного высокоэффективного жидкостного хроматографического анализа метаболомных образцов». Аналитическая химия . 80 (1): 268–78. DOI : 10.1021 / ac701676b . PMID 18052342 .
- ^ а б в Скуг Д.А., Западный DM (2014). Основы аналитической химии . Соединенные Штаты Америки: Cengage Learning. п. 816. ISBN 978-0-495-55828-6.
- ^ Маклаферти, Фред В. (октябрь 1981 г.). «Тандемная масс-спектрометрия». Наука . 214 (4518): 280–287. Bibcode : 1981Sci ... 214..280M . DOI : 10.1126 / science.7280693 . JSTOR 1686862 . PMID 7280693 .
- ^ Хайтс, Рональд (1986). "Газовая хроматография и масс-спектрометрия" (PDF) . Аналитическая химия . 58 . DOI : 10.1021 / ac00292a767 . ЛВП : 2445/32139 . S2CID 42703412 . Архивировано из оригинального (PDF) 4 декабря 2018 года . Проверено 3 декабря 2018 .
- ^ а б «Газовая хроматография и масс-спектрометрия (ГХ / МС)» . Бристольский университет . Бристольский университет . Проверено 3 декабря 2018 .
- ^ а б Скуг Д.А., Западный DM, Холлер Ф.Дж., Крауч С.Р. (2014). Основы аналитической химии (9-е изд.). Brooks / Cole Cengage Learning. С. 895–920. ISBN 978-0-495-55828-6.
- ^ Хуссейн С.З., Макбул К. (2014). «GS-MS: принцип, техника и его применение в пищевой науке». Международный журнал современной науки . 13 : 116–126.
- ^ Онг RC, Marriott PJ (2002). «Обзор основных концепций комплексной двумерной газовой хроматографии» . Журнал хроматографической науки . 40 (5): 276–291. DOI : 10.1093 / chromsci / 40.5.276 . PMID 12049157 .
- ^ Гу ГК, Дэвид Р., Питер Й (2016). «Применение LCMS в разработке низкомолекулярных лекарств» . Европейский фармацевтический обзор . 21 (4).
- ^ Питт Дж. Дж. (Февраль 2009 г.). «Принципы и применения жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии в клинической биохимии» . Клинический биохимик. Обзоры . 30 (1): 19–34. PMC 2643089 . PMID 19224008 .
- ^ Делобель, Эрик Ларджи Анисет Кэтрен Гери Ван Винхт Арно. «2D-ЖХ-МС для анализа моноклональных антител и конъюгатов антитело-лекарственное средство в регулируемой среде» . www.spectroscopyonline.com . Проверено 3 декабря 2018 .
- ^ а б в Столл Д. Р., Карр П. В. (январь 2017 г.). «Двумерная жидкостная хроматография: современное учебное пособие». Аналитическая химия . 89 (1): 519–531. DOI : 10.1021 / acs.analchem.6b03506 . PMID 27935671 .
- ^ НАДЬ, КОРНЕЛЬ; VÉKEY, Кароли (2008), "Методы разделения", медицинские применения масс - спектрометрии , Elsevier, стр 61-92,. DOI : 10.1016 / b978-044451980-1.50007-0 , ISBN 9780444519801
- ^ Буши М. М., Йоргенсон Дж. В. (15 мая 1990 г.). «Автоматизированная аппаратура для комплексной двухмерной высокоэффективной жидкостной хроматографии / капиллярного зонального электрофореза». Аналитическая химия . 62 (10): 978–984. DOI : 10.1021 / ac00209a002 . ISSN 0003-2700 .
- ^ а б в Карр П. У., Столл Д. Р. (2016). Двухмерная жидкостная хроматография: принципы, практическая реализация и применение . Германия: Agilent Technologies, Inc. стр. 1.