 | Эта статья требует дополнительных ссылок для проверки . ( октябрь 2009 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения ) |
Дифференциальное центрифугирование (также известное как центрифугирование с дифференциальной скоростью ) - очень распространенная процедура в биохимии и клеточной биологии , которая используется для разделения органелл и других субклеточных частиц в зависимости от скорости их оседания . Хотя дифференциальное центрифугирование часто применяется в биологическом анализе, оно является общим методом, также подходящим для грубой очистки неживых взвешенных частиц (например, наночастиц , коллоидных частиц, вирусов ). В типичном случае, когда дифференциальное центрифугирование используется для анализа клеточно-биологических явлений (например, распределения органелл), тканьобразец сначала лизируется, чтобы разрушить клеточные мембраны и высвободить органеллы и цитозоль . Затем лизат подвергают повторным центрифугированию , при этом частицы, которые достаточно быстро осаждаются при заданной центробежной силе в течение заданного времени, образуют компактный «осадок» на дне центрифугированной пробирки. [1]
После каждого центрифугирования супернатант (не осажденный раствор) удаляют из пробирки и повторно центрифугируют при увеличенной центробежной силе и / или увеличении времени. Дифференциальное центрифугирование подходит для разделения сырой нефти на основе скорости осаждения, но более мелкозернистая очистка может быть проведена на основе плотности посредством центрифугирования в равновесном градиенте плотности . [2] Таким образом, метод дифференциального центрифугирования представляет собой последовательное осаждение частиц из предыдущего супернатанта с использованием все более высоких сил центрифугирования. [3]Клеточные органеллы, разделенные дифференциальным центрифугированием, поддерживают относительно высокую степень нормального функционирования до тех пор, пока они не подвергаются денатурирующим условиям во время выделения. [4] [5]
Теория [ править ]
В вязкой жидкости, тем скорости по седиментации данной взвешенной частицы (при условии, что частица является более плотным , чем жидкость) в значительной степени зависит от следующих факторов:
- Сила гравитации
- Разница в плотности
- Вязкость жидкости
- Размер и форма частиц
Более крупные частицы оседают быстрее и при меньших центробежных силах. Если частица менее плотная, чем жидкость (например, жиры в воде), частица не будет осаждаться, а скорее будет плавать, независимо от силы перегрузки, испытываемой частицей. Центробежная сила разделяет компоненты не только по плотности, но также по размеру и форме частиц. Напротив, более специализированное центрифугирование в равновесном градиенте плотности дает профиль разделения, зависящий только от плотности частиц, и поэтому подходит для более мелкозернистого разделения.
Высокая перегрузка делает осаждение мелких частиц намного быстрее, чем броуновская диффузия , даже для очень маленьких (наноразмерных) частиц. При использовании центрифуги закон Стокса должен быть изменен, чтобы учесть изменение силы перегрузки с расстоянием от центра вращения. [6]
где
- D - минимальный диаметр частиц, которые, как ожидается, осаждаются (м)
- η (или μ) - динамическая вязкость жидкости (Па · с)
- R f - конечный радиус вращения (м)
- R i - начальный радиус вращения (м)
- ρ p - объемная массовая плотность частиц (кг / м 3 )
- ρ f - объемная массовая плотность жидкости (кг / м 3 )
- ω - угловая скорость (рад / с)
- t - время, необходимое для осаждения от R i до R f (с)
Процедура [ править ]
Дифференциальное центрифугирование может использоваться с интактными частицами (например, биологическими клетками, микрочастицами, наночастицами) или использоваться для разделения составных частей данной частицы. [7] Используя пример отделения эукариотических органелл от интактных клеток, клетка должна быть сначала лизирована и гомогенизирована (в идеале щадящим методом, таким как гомогенизация Даунса ; более жесткие методы или чрезмерная гомогенизация приведут к снижению доли интактных органелл. ). После получения неочищенного экстракта органелл его можно подвергнуть центрифугированию с различными скоростями для разделения органелл:
| Пример ввода | G сила | Время | Необходим инструмент | Содержание пеллет | Содержание супернатанта |
|---|---|---|---|---|---|
| Нелизированные (эукариотические) клетки | 100 мкг | 5 мин | Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с поворотным ковшом | Интактные (эукариотические) клетки, макроскопический мусор | Зависит от образца |
| Аккуратно лизированные клетки (например, гомогенизатор Даунса) | 600 мкг | 10 минут | Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с поворотным ковшом | Ядра | Цитозоль, неядерные органеллы |
| Супернатант предыдущего ряда | 15000 мкг | 20 мин. | Настольная центрифуга с фиксированным углом | Митохондрии, хлоропласты, лизосомы, пероксисомы | Цитозоль, микросомы (известный как пост-митохондриальный супернатант) |
| Супернатант предыдущего ряда | 50 000 мкг - 100 000 мкг | 60 мин. | Высокоскоростная центрифуга с фиксированным углом или вакуумная ультрацентрифуга | Плазматическая мембрана, микросомальная фракция, большие полирибосомы | Цитозоль, рибосомные субъединицы, малые полирибосомы, ферментные комплексы |
| Супернатант предыдущего ряда | 50 000 мкг - 100 000 мкг | 120 мин. | Вакуумная ультрацентрифуга | Рибосомные субъединицы, небольшие полирибосомы, некоторые растворимые ферментные комплексы | Цитозоль |
Ультрацентрифугирование [ править ]
Теперь лизированный образец готов к центрифугированию в ультрацентрифуге . Ультрацентрифуга состоит из охлаждаемой камеры низкого давления, содержащей ротор, который приводится в действие электродвигателем, способным к высокоскоростному вращению. Образцы помещают в пробирки внутри ротора или прикрепляют к нему. Скорость вращения может достигать 100 000 об / мин для напольной модели, 150 000 об / мин для настольной модели (Beckman Optima Max-XP или Sorvall MTX150), создавая центробежные силы скорости от 800 000 до 1 000 000 g. Эта сила вызывает осаждение макромолекул и даже может вызвать неравномерное распределение небольших молекул. [8]
Поскольку разные фрагменты клетки имеют разные размеры и плотность, каждый фрагмент будет оседать в осадок с разными минимальными центробежными силами. Таким образом, разделение образца на разные слои может быть выполнено, сначала центрифугируя исходный лизат под действием слабых сил, удаляя осадок, а затем подвергая последующие супернатанты последовательно более сильным центробежным полям. Каждый раз порция разной плотности оседает на дно контейнера и извлекается, а повторное нанесение создает ряд слоев, включающих различные части исходного образца. Могут быть предприняты дополнительные шаги для дальнейшей очистки каждой из полученных гранул.
Осаждение зависит от массы, формы и частичного удельного объема макромолекулы, а также от плотности растворителя, размера ротора и скорости вращения. Скорость седиментации можно контролировать во время эксперимента для расчета молекулярной массы . Значения коэффициента седиментации (S) могут быть рассчитаны. Большие значения S (более высокая скорость седиментации) соответствуют большей молекулярной массе. Плотные частицы оседают быстрее. Удлиненные белки имеют больший коэффициент трения и медленнее осаждаются для обеспечения точности.[9]
Различия между дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в градиенте плотности [ править ]
Разница между методами дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности заключается в том, что в последнем методе используются растворы различной плотности (например, сахароза, фиколл) или гели, через которые проходит образец. Это разделяет образец на слои по относительной плотности, основываясь на том принципе, что молекулы оседают под действием центробежной силы, пока не достигнут среды с такой же плотностью, как у них. [10]Степень разделения или количество слоев зависит от раствора или геля. С другой стороны, дифференциальное центрифугирование не использует градиент плотности, и центрифугирование происходит с возрастающей скоростью. Различная скорость центрифугирования часто приводит к разделению не более чем на две фракции, поэтому супернатант может быть дополнительно отделен на дополнительных этапах центрифугирования. Для этого на каждом этапе скорость центрифугирования должна увеличиваться до тех пор, пока желаемые частицы не будут отделены. Напротив, центрифугирование в градиенте плотности обычно выполняется только с одной скоростью центрифугирования. [11]
См. Также [ править ]
| Ресурсы библиотеки об ультрацентрифугировании |
|
- Ультрацентрифугирование с плавучестью
- Жером Виноград
Ссылки [ править ]
- ^ Олендик, Кей; Хардинг, Стивен Э. (19 апреля 2018 г.). «Центрифугирование и ультрацентрифугирование». Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии Уилсона и Уокера : 424–453. DOI : 10.1017 / 9781316677056.014 . ISBN 9781107162273.
- ^ a b Дарнелл, Джеймс; Балтимор, Дэвид; Мацудаира, Пол; Зипурский, С. Лоуренс; Берк, Арнольд; Лодиш, Харви (2000). «Очистка клеток и их частей» . Цитировать журнал требует
|journal=( помощь ) - ^ Гриффит, Оуэн Митч (2010). Практические методы центробежного разделения - Руководство по применению (PDF) . Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. п. 1-27.
- ↑ Джеральд Карп (19 октября 2009 г.). Клеточная и молекулярная биология: концепции и эксперименты . Джон Вили и сыновья. С. 28–. ISBN 978-0-470-48337-4.
- ^ Лившиц, Михаил А .; Хомякова, Елена; Евтушенко Евгений Г .; Лазарев, Василий Н .; Кулемин, Николай А .; Семина, Светлана Е .; Генерозов, Эдуард В .; Говорун, Вадим М. (30 ноября 2015 г.). «Выделение экзосом с помощью дифференциального центрифугирования: теоретический анализ обычно используемого протокола» . Научные отчеты . 5 (1): 17319. Bibcode : 2015NatSR ... 517319L . DOI : 10.1038 / srep17319 . ISSN 2045-2322 . S2CID 14200669 .
- ^ Хардинг, Стивен Э .; Скотт, Дэвид; Роу, Артер (16 декабря 2007 г.). Аналитическое ультрацентрифугирование: методы и методы . Королевское химическое общество. ISBN 978-1-84755-261-7.
- ^ Фрей, Марк. «Центрифугирование разделения» . Биофайлы . 6 (5): 6–7.
- ^ Тейлор, Дуглас Д .; Шах, Сахил (1 октября 2015 г.). «Методы выделения внеклеточных везикул влияют на последующий анализ их грузов». Методы . 87 : 3–10. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2015.02.019 . PMID 25766927 .
- ^ Вэнс, Деннис Э .; Вэнс, Дж. Э. (6 августа 1996 г.). «Структура, сборка и секреция липопротеинов» . Биохимия липидов, липопротеинов и мембран . Эльзевир. ISBN 978-0-08-086092-3.
- ^ Сапкот, Анупам (3 сентября 2020). «Типы центрифуг и центрифугирования (определение, принцип, использование)» . Заметки о микробах .
- ^ Ю, Ли-Ли; Чжу, Цзин; Лю, Цзинь-Ся; Цзян, Фэн; Ни, Вен-Кай; Цюй Ли-Шуай; Ни, Рун-Чжоу; Лу, Цуй-Хуа; Сяо, Мин-Бин (2018). «Сравнение традиционных и новых методов отделения экзосом от образцов человека» . BioMed Research International . 2018 : 1–9. DOI : 10.1155 / 2018/3634563 . PMC 6083592 . PMID 30148165 .
