Объединение создано 17 июля 1940 года из управления, кораблей и частей переименованной Днепровской военной флотилии. Главная база — Пинск, тыловая — Киев[1].
В оперативном отношении флотилия состояла из отрядов речных кораблей (Березинский, Припятский, Днепровский, уже в ходе войны были сформированы Киевский и Черниговский отряды). В строю находились 27 боевых кораблей и 30 катеров[3]
Штатная численность личного состава флотилии до мобилизации насчитывала 2 307 человек[5], в ходе войны численность личного состава возросла до 3 386 человек (346 командиров, 110 лиц политсостава, 650 старшин и сержантов, 2 290 краснофлотцев и красноармейцев)[2].
В ходе Великой Отечественной войны пополнилась 45 кораблями, катерами и вспомогательными судами, переданными из народного хозяйства по плану мобилизации (план предусматривал передачу около 60 судов). Вооружить и ввести в строй из переданных судов сумели не все из-за резкого развития неблагоприятной обстановки на фронте (по некоторым данным, всего 18 кораблей).[6]
Военный комиссар — полковой комиссар Г. В. Татарченко (22 июня — 14 июля 1941 года), умер от сердечного приступа
Пинская военная флотилия действовала на стыке Западного и Юго-Западного фронтов. Подразделения гидрографов флотилии, занимавшиеся промерами русла реки Западный Буг, оказались застигнуты войной у Бреста и вступили в бой в первые минуты войны[8]. К 11 июля 1941 года основные силы флотилии были сведены в 3 отряда: Березинский, Припятский (на Березине и Припяти в оперативном подчинении Западному фронту) и Днепровский (на Днепре в оперативном подчинении Юго-Западному фронту). Березинский отряд взаимодействовал с 21-й армией, Припятский — с частями 4-й и 5-й армий, Днепровский — с частями 26-й и 38-й армий. В августе 1941 года были сформированы Киевский и Черниговский отряды.