Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Основная статья: 2 базовые кодировки
Подготовка библиотеки для платформы SOLiD
Двухбазовая схема кодирования. При двухбазовом кодировании каждой уникальной паре оснований на 3'-конце зонда назначается один из четырех возможных цветов. Например, «AA» назначен синему, «AC» назначен зеленому и так далее для всех 16 уникальных пар. Во время секвенирования каждая база в шаблоне секвенируется дважды, и полученные данные декодируются по этой схеме.

SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) - это технология секвенирования ДНК нового поколения, разработанная Life Technologies и коммерчески доступная с 2006 года. Эта технология следующего поколения генерирует 10 8 - 10 9 небольших считываний последовательностей за один раз. Он использует 2 базовых кодирования для декодирования необработанных данных, сгенерированных платформой секвенирования, в данные последовательности.

Этот метод не следует путать с «секвенированием путем синтеза», принципом, используемым пиросеквенированием Roche-454 (введенным в 2005 году, генерирующим миллионы считываний 200-400 пар оснований в 2009 году) и системой Solexa (теперь принадлежащей Illumina) (представленной в 2006 г., генерируя сотни миллионов операций чтения 50-100 б.п. в 2009 г.)

Эти методы позволили снизить стоимость с 0,01 доллара на базу в 2004 году до почти 0,0001 доллара на базу в 2006 году и увеличили производительность секвенирования с 1 000 000 баз на машину в день в 2004 году до более чем 5 000 000 000 баз на машину в день в 2009 году. Существует более 30 публикаций с описанием его использование сначала для позиционирования нуклеосом от Valouev et al. [1] транскрипционного профилирования или чувствительной к цепи РНК-Seq с Cloonan et al. [2] одноклеточного транскрипционного профилирования с Tang et al. [3] и, в конечном итоге, повторное секвенирование человека с помощью McKernan et al. [4]

Сообщается, что метод, используемый этой машиной (секвенирование путем лигирования), имеет некоторые проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [5]

Химия [ править ]

Библиотека фрагментов ДНК готовится из образца, подлежащего секвенированию, и используется для приготовления клональных популяций гранул. То есть на поверхности каждой магнитной бусины будет присутствовать только один вид фрагментов. Фрагменты, прикрепленные к магнитным шарикам, будут иметь присоединенную универсальную последовательность адаптера P1, так что начальная последовательность каждого фрагмента известна и идентична. ПЦР эмульсии проводится в микрореакторах, содержащих все необходимые для ПЦР реагенты. Гранулы с полученными продуктами ПЦР помещают на предметное стекло.

Праймеры гибридизуются с последовательностью адаптера P1 в матрице библиотеки. Набор из четырех флуоресцентно меченных двухосновных зондов конкурирует за связывание с праймером для секвенирования. Специфичность зонда с двумя основаниями достигается путем опроса каждого 1-го и 2-го оснований в каждой реакции лигирования. Выполняется несколько циклов лигирования, обнаружения и расщепления, количество циклов определяет конечную длину считывания. После серии циклов лигирования продукт удлинения удаляют, а матрицу сбрасывают с помощью праймера, комплементарного положению n-1, для второго раунда циклов лигирования.

Для каждого тега последовательности завершается пять раундов сброса праймера. В процессе сброса праймеров каждое основание опрашивается в двух независимых реакциях лигирования двумя разными праймерами. Например, основание в позиции считывания 5 анализируется праймером номер 2 в цикле лигирования 2 и праймером номер 3 в цикле лигирования 1.

Пропускная способность и точность [ править ]

По данным ABI, платформа SOLiD 3plus дает 60 гигабаз пригодных для использования данных ДНК за цикл. Благодаря двум базовым системам кодирования в технологию встроена внутренняя проверка точности, которая обеспечивает точность 99,94%. Химия систем также означает, что гомополимеры не препятствуют ей, в отличие от системы Roche 454 FLX, и поэтому большие и сложные гомополимерные повторяющиеся области больше не являются проблемой для секвенирования.

Приложения [ править ]

Естественно, эта технология будет использоваться для секвенирования ДНК, но из-за высокой параллельности всех технологий следующего поколения они также найдут применение в транскриптомике и эпигеномике .

Микроматрицы когда-то были основой транскриптомики последние десять лет, а технология на основе массивов впоследствии распространилась на другие области. Однако они ограничены тем, что информация может быть получена только для датчиков, которые находятся на микросхеме. Можно получить только информацию об организмах, для которых доступны чипы, и они связаны со всеми проблемами гибридизации большого количества молекул (разные температуры гибридизации). Транскриптомика RNA-Seq при секвенировании следующего поколения будет означать, что эти барьеры больше не действуют. Полный транскриптом любого организма может быть потенциально секвенирован за один прогон (для очень маленьких бактериальных геномов), и будет доступна не только идентификация каждого транскрипта, но и профилирование экспрессии, поскольку также может быть достигнуто количественное считывание.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) - это метод определения сайтов связывания факторов транскрипции и взаимодействий ДНК-белок. В прошлом он с некоторым успехом сочетался с технологией массивов (ChIP-chip). В этой области также может применяться секвенирование следующего поколения. Иммунопреципитация метилированием (MeDIP) также может выполняться на массивах.

Возможность узнать больше о сайтах метилирования и связывания TF в масштабе всего генома является ценным ресурсом и может многому научить нас о болезнях и молекулярной биологии в целом.

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Valouev А, Итикава Дж, Tonthat Т, и др. (Июль 2008 г.). «Карта положения нуклеосом C. elegans с высоким разрешением показывает отсутствие универсального позиционирования, определяемого последовательностью» . Геномные исследования . 18 (7): 1051–63. DOI : 10.1101 / gr.076463.108 . PMC  2493394 . PMID  18477713 .
  2. ^ Cloonan N, Forrest AR, Kolle G и др. (Июль 2008 г.). «Профилирование транскриптома стволовых клеток с помощью массового секвенирования мРНК». Методы природы . 5 (7): 613–9. DOI : 10.1038 / nmeth.1223 . PMID 18516046 . S2CID 19790151 .  
  3. ^ Тан Ф., Барбачору С, Ван И и др. (Май 2009 г.). «Анализ целого транскриптома мРНК-Seq отдельной клетки». Методы природы . 6 (5): 377–82. DOI : 10.1038 / nmeth.1315 . PMID 19349980 . S2CID 16570747 .  
  4. ^ МакКернан К.Дж., Пекхэм Х.Э., Коста Г.Л. и др. (Сентябрь 2009 г.). «Последовательность и структурные вариации в геноме человека, выявленные путем короткого чтения, массивно параллельного секвенирования лигирования с использованием двухосновного кодирования» . Геномные исследования . 19 (9): 1527–41. DOI : 10.1101 / gr.091868.109 . PMC 2752135 . PMID 19546169 .  
  5. ^ Ю-Фэн ​​Хуан ; Шенг-Чунг Чен ; И-Шиен Чан и Цзы-Хан Чен (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования» . BMC Systems Biology . 6 Приложение 2: S10. DOI : 10.1186 / 1752-0509-6-S2-S10 . PMC 3521181 . PMID 23281822 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Мардис ER (2008). «Методы секвенирования ДНК нового поколения». Ежегодный обзор геномики и генетики человека . 9 : 387–402. DOI : 10.1146 / annurev.genom.9.081307.164359 . PMID  18576944 .
  • Мардис ER (2009). «Новые стратегии и появляющиеся технологии для массового параллельного секвенирования: приложения в медицинских исследованиях» . Геномная медицина . 1 (4): 40. DOI : 10,1186 / gm40 . PMC  2684661 . PMID  19435481 .