454 Life Sciences была биотехнологической компанией из Бранфорда, штат Коннектикут, которая специализировалась на высокопроизводительном секвенировании ДНК . Он был приобретен Roche в 2007 году и закрыт в 2013 году, когда его технология стала неконкурентоспособной, хотя производство продолжалось до середины 2016 года. [1]
Промышленность | Биотехнологии |
---|---|
Основан | 2000 г. |
Судьба | Приобретена компанией Roche в 2007 году и остановлена компанией Roche в 2013 году (производство прекращено в середине 2016 года) |
Штаб-квартира | , США |
Продукты | Секвенаторы генома , реагенты |
Услуги | Секвенирование генетических образцов |
История
454 Life Sciences была основана Джонатаном Ротбергом и первоначально была известна как 454 Corporation, дочерняя компания CuraGen. За свой метод недорогого секвенирования генов компания 454 Life Sciences была награждена Золотой медалью Wall Street Journal за инновации в категории биотехнологий и медицины в 2005 году. [2] Название 454 было кодовым названием, под которым назывался проект в CuraGen, а числа не имеют особого значения. [3]
В ноябре 2006 года Ротберг, Майкл Эгхольм и его коллеги из 454 опубликовали статью на обложке со Сванте Пяабо в журнале Nature, описывающую первый миллион пар оснований генома неандертальца, и инициировали Проект генома неандертальца, чтобы завершить последовательность генома неандертальца к 2009 году. [4]
В конце марта 2007 года Roche Diagnostics приобрела 454 Life Sciences за 154,9 миллиона долларов США. [5] Это оставалось отдельным бизнес-подразделением. [6] В октябре 2013 года Roche объявила, что закрывает 454 и прекращает поддержку платформы к середине 2016 года. [7]
В мае 2007 года 454 опубликовали результаты проекта «Джим»: секвенирование генома Джеймса Уотсона , соавтора структуры ДНК. [8] [9]
Технология
При секвенировании 454 использовалась крупномасштабная система параллельного пиросеквенирования , способная секвенировать примерно 400-600 мегабаз ДНК за 10-часовой цикл на Genome Sequencer FLX с реагентами серии GS FLX Titanium. [10]
Система основывалась на фиксации распыленных и связанных адаптером фрагментов ДНК с небольшими гранулами для захвата ДНК в эмульсии вода-в-масле . ДНК, закрепленную на этих шариках, затем амплифицировали с помощью ПЦР . Каждую гранулу , связанную с ДНК, помещали в лунку размером ~ 29 мкм на PicoTiterPlate , волоконно-оптическом чипе. Смесь ферментов, таких как ДНК-полимераза , АТФ-сульфурилаза и люцифераза, также была заполнена в лунку. Затем PicoTiterPlate помещали в систему GS FLX для секвенирования.
454 выпустила GS20 секвенирования машину в 2005 году, первый ДНК секвенсор нового поколения на рынке. В 2008 году компания 454 Sequencing выпустила реагенты серии GS FLX Titanium для использования в приборе Genome Sequencer FLX с возможностью секвенирования 400-600 миллионов пар оснований за цикл с длиной считывания 400-500 пар оснований. В конце 2009 года компания 454 Life Sciences представила GS Junior System, настольную версию системы Genome Sequencer FLX. [11]
Подготовка библиотеки ДНК и emPCR
Геномная ДНК была фракционирована на более мелкие фрагменты (300-800 пар оснований) и отполирована (сделана тупой на каждом конце). Затем к концам фрагментов лигировали короткие адаптеры. Эти адаптеры обеспечивали прайминговые последовательности как для амплификации, так и для секвенирования фрагментов библиотеки образцов. Один адаптер (адаптер B) содержал 5'- биотиновую метку для иммобилизации библиотеки ДНК на гранулах, покрытых стрептавидином . После репарации разрывов небиотинилированная цепь высвобождалась и использовалась в качестве библиотеки одноцепочечной матричной ДНК (sstDNA). Библиотеку sstDNA оценивали на предмет ее качества, и оптимальное количество (копий ДНК на бусину), необходимое для emPCR, определяли титрованием. [12]
Библиотеку sstDNA иммобилизовали на шариках. Гранулы, содержащие фрагмент библиотеки, несли одну молекулу sstDNA. Связанную с гранулами библиотеку эмульгировали с реагентами для амплификации в смеси вода-в-масле. Каждая гранула была захвачена в своем собственном микрореакторе, где происходит ПЦР-амплификация. Это привело к получению клонально амплифицированных фрагментов ДНК, иммобилизованных на гранулах.
Последовательность действий
Гранулы библиотеки одноцепочечной ДНК-матрицы добавляли к смеси для инкубации гранул ДНК (содержащей ДНК-полимеразу) и наносили слоями ферментные гранулы (содержащие сульфурилазу и люциферазу) на устройство PicoTiterPlate. Устройство центрифугировали для внесения шариков в лунки. Слой ферментных гранул гарантировал, что гранулы ДНК оставались в лунках во время реакции секвенирования. Процесс осаждения гранул был разработан таким образом, чтобы максимально увеличить количество лунок, содержащих одну гранулу амплифицированной библиотеки.
Загруженное устройство PicoTiterPlate помещали в инструмент Genome Sequencer FLX. Подсистема флюидики доставляла реагенты для секвенирования (содержащие буферы и нуклеотиды) через лунки планшета. Четыре нуклеотида ДНК добавляли последовательно в фиксированном порядке через устройство PicoTiterPlate во время цикла секвенирования. Во время потока нуклеотидов параллельно секвенировали миллионы копий ДНК, связанных с каждой из гранул. Когда в лунку добавляли нуклеотид, комплементарный цепи матрицы, полимераза удлиняла существующую цепь ДНК, добавляя нуклеотид (ы). Добавление одного (или нескольких) нуклеотидов генерировало световой сигнал, который регистрировался камерой CCD в приборе. Этот метод основан на секвенировании путем синтеза и называется пиросеквенированием . [13] Сила сигнала была пропорциональна количеству нуклеотидов; например, участки гомополимера, включенные в единичный нуклеотидный поток, генерируют больший сигнал, чем одиночные нуклеотиды. Однако сила сигнала для гомополимерных участков была линейной только до восьми последовательных нуклеотидов, после чего сигнал быстро падал. [14] Данные хранились в файлах стандартного формата блок-схемы (SFF) для последующего анализа.
Смотрите также
Заметки
- ^ Hollmer, Марк (17 октября 2013). «Рош закроет 454 Life Sciences, поскольку это снижает фокус секвенирования генов» . Жестокая биотехнология .
- ^ Тотти, Майкл (24 октября 2005 г.). «Лучшая идея» . The Wall Street Journal .
- ^ Поллак, Эндрю (22 августа 2003 г.). «Компания утверждает, что за один день нанесла на карту гены вируса» . Нью-Йорк Таймс .
- ^ Грин, Ричард Э .; Краузе, Йоханнес; Ptak, Susan E .; Бриггс, Адриан В .; Ронан, Майкл Т .; Саймонс, Ян Ф .; Ду, Лей; Эгхольм, Майкл; Ротберг, Джонатан М .; Паунович, Майя; Паабо, Сванте (ноябрь 2006 г.). «Анализ одного миллиона пар оснований ДНК неандертальца» . Природа . 444 (7117): 330–336. DOI : 10,1038 / природа05336 .
- ^ «Архивная копия» . Архивировано из оригинального 29 августа 2012 года . Проверено 14 ноября 2012 года .CS1 maint: заархивированная копия как заголовок ( ссылка )
- ^ «Рош выкупает технологию секвенирования 454» . FierceBiotech . 28 марта 2007 г.
- ^ «После решения Рош о закрытии 454 клиенты планируют перейти на другие платформы» .
- ^ Уиллер, Д.А.; Srinivasan, M .; Egholm, M .; Shen, Y .; Chen, L .; McGuire, A .; Он, W .; Чен, YJ; Махиджани, В .; Рот, GT; Gomes, X .; Тартаро, К .; Niazi, F .; Turcotte, CL; Ирзык, ГП; Лупски-младший; Chinault, C .; Песня, X.-Z .; Liu, Y .; Yuan, Y .; Назарет, Л .; Цинь, X .; Музны, ДМ; Маргулис, М .; Weinstock, GM; Гиббс, РА; Ротберг, JM (2008). «Полный геном человека путем массового параллельного секвенирования ДНК» . Природа . 452 (7189): 872–876. Bibcode : 2008Natur.452..872W . DOI : 10,1038 / природа06884 . PMID 18421352 .
- ^ «Проект Джима: личный геном Ватсона становится достоянием общественности» . Архивировано из оригинального 21 ноября 2008 года . Проверено 16 июня 2007 года .
- ^ Карл, V; и другие. (2009). «Секвенирование следующего поколения: от фундаментальных исследований к диагностике» . Клиническая химия . 55 (4): 41–47. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112789 . PMID 19246620 .
- ^ «454 Life Sciences представляет новый настольный секвенсор, значительные улучшения в системе FLX секвенсора генома, включая чтение 1000 пар оснований за 2010 г.» (пресс-релиз). 454 Науки о жизни. 19 ноября 2009 года Архивировано из оригинального 15 ноября 2011 года . Проверено 19 ноября 2009 года .
- ^ Чжэн, З; и другие. (2010). «Массивно-параллельное пиросеквенирование без титрования с использованием следовых количеств исходного материала» . Nucleic Acids Res . 38 (13): e137. DOI : 10.1093 / NAR / gkq332 . PMC 2910068 . PMID 20435675 .
- ^ Король, C; Скотт-Хортон, Т. (2008). «Пиросеквенирование: простой метод точного генотипирования» . J Vis Exp (11). DOI : 10.3791 / 630 . PMC 2582836 . PMID 19066560 .
- ^ Маргулис, Марсель; Майкл Эгхольм; 54 дополнительных соавтора (15 сентября 2005 г.). «Секвенирование генома в открытых микропроцессорных пиколитерных реакторах высокой плотности» . Природа . Издательская группа "Природа". 437 (7057): 376–380. Bibcode : 2005Natur.437..376M . DOI : 10,1038 / природа03959 . PMC 1464427 . PMID 16056220 .