Эпигеномика - это исследование полного набора эпигенетических модификаций генетического материала клетки, известного как эпигеном . Эта область аналогична геномике и протеомике , которые представляют собой изучение генома и протеома клетки. [1] [2] Эпигенетические модификации - это обратимые модификации клеточной ДНК или гистонов, которые влияют на экспрессию генов без изменения последовательности ДНК. [3] Эпигеномная поддержка - это непрерывный процесс, который играет важную роль в стабильности эукариотических геномов, принимая участие в важнейших биологических механизмах, таких как репарация ДНК. [4] [5]Считается, что флавоны растений подавляют эпигеномные метки, вызывающие рак. [6] Двумя наиболее характерными эпигенетическими модификациями являются метилирование ДНК и модификация гистонов . Эпигенетические модификации играют важную роль в экспрессии и регуляции генов и участвуют во многих клеточных процессах, таких как дифференцировка / развитие [7] и туморогенез . [8] Изучение эпигенетики на глобальном уровне стало возможным только недавно благодаря адаптации геномных высокопроизводительных анализов. [9] [7]
Введение в эпигенетику
Механизмы, управляющие фенотипической пластичностью или способностью клетки изменять свое состояние в ответ на стимулы, давно стали предметом исследований (Фенотипическая пластичность 1). Традиционная центральная догма биологии гласит, что ДНК клетки транскрибируется в РНК , которая транслируется в белки , которые выполняют клеточные процессы и функции. [10] Парадокс, однако, заключается в том, что клетки демонстрируют различные ответы на различные стимулы и что клетки, имеющие одинаковые наборы ДНК, такие как в многоклеточных организмах, могут иметь множество различных функций и фенотипов. [11] Согласно классическим представлениям, фенотипические вариации объясняются различиями в первичной структуре ДНК, будь то аберрантная мутация или унаследованный аллель последовательности . [12] Однако, хотя это и объясняет некоторые аспекты вариабельности, это не объясняет, насколько четко координируются и регулируются клеточные ответы, такие как дифференцировка.
Более вероятным источником клеточной пластичности является регуляция экспрессии генов , так что, хотя две клетки могут иметь почти идентичную ДНК, дифференциальная экспрессия определенных генов приводит к вариациям. Исследования показали, что клетки способны регулировать экспрессию генов на нескольких этапах : транскрипция, процессинг и транспортировка мРНК, а также трансляция белков, посттрансляционный процессинг и деградация. Регуляторные белки, которые связываются с ДНК, РНК и / или белками, являются ключевыми эффекторами в этих процессах и функционируют, положительно или отрицательно регулируя уровень определенного белка и функцию в клетке. [13] И хотя ДНК-связывающие факторы транскрипции обеспечивают механизм специфического контроля клеточных ответов, модель, в которой ДНК-связывающие факторы транскрипции являются единственными регуляторами активности генов, также маловероятна. Например, в исследовании переноса ядра соматической клетки было продемонстрировано, что стабильные особенности дифференцировки сохраняются после того, как ядро переносится в новую клеточную среду, предполагая, что стабильный и наследственный механизм генной регуляции был вовлечен в поддержание дифференцированное состояние в отсутствие ДНК-связывающих факторов транскрипции. [11]
Обнаружив, что метилирование ДНК и модификации гистонов являются стабильными, наследуемыми, а также обратимыми процессами, которые влияют на экспрессию генов без изменения первичной структуры ДНК, был предоставлен механизм наблюдаемой вариабельности экспрессии клеточных генов. [12] Эти модификации были названы эпигенетическими, от эпигенетики «поверх» генетического материала «ДНК» (Эпигенетика 1). Механизмы, управляющие эпигенетическими модификациями, сложны, но с появлением технологии высокопроизводительного секвенирования теперь они становятся более понятными. [12]
Эпигенетика
Геномные модификации, которые изменяют экспрессию генов, которые нельзя отнести к модификации первичной последовательности ДНК и которые наследуются митотически и мейотически , классифицируются как эпигенетические модификации. Метилирование ДНК и модификация гистонов являются одними из наиболее охарактеризованных эпигенетических процессов. [3]
Метилирование ДНК
Первой эпигенетической модификацией, которую следует подробно охарактеризовать, было метилирование ДНК. Как следует из названия, метилирование ДНК - это процесс добавления метильной группы к ДНК. Ферменты, катализирующие эту реакцию, - это ДНК-метилтрансферазы (DNMT) . Хотя метилирование ДНК является стабильным и наследуемым, оно может быть обращено антагонистической группой ферментов, известных как ДНК-деметилазы. У эукариот метилирование чаще всего обнаруживается в положении углерода 5 остатков цитозина (5mC) рядом с гуанином , называемых динуклеотидами CpG . [9] [14]
Паттерны метилирования ДНК сильно различаются между видами и даже в пределах одного организма. Использование метилирования у животных совершенно иное; у позвоночных животных наблюдается самый высокий уровень 5 мкС, а у беспозвоночных - более умеренный уровень 5 мкС. У некоторых организмов, таких как Caenorhabditis elegans , не было продемонстрировано наличие 5mC или обычной ДНК-метилтрансферазы; это может указывать на участие и других механизмов помимо метилирования ДНК. [11]
Внутри организма уровни метилирования ДНК также могут варьироваться в зависимости от развития и региона. Например, в первичных зародышевых клетках мыши даже происходит деметилирование всего генома; к стадии имплантации уровни метилирования возвращаются к своим прежним соматическим значениям. [11] Когда метилирование ДНК происходит в промоторных областях , сайтах инициации транскрипции, это оказывает эффект подавления экспрессии генов. Это контрастирует с неметилированными промоторными областями, которые связаны с активно экспрессируемыми генами. [9]
Механизм, с помощью которого метилирование ДНК подавляет экспрессию генов, представляет собой многоступенчатый процесс. Различие между метилированными и неметилированными остатками цитозина осуществляется специфическими ДНК-связывающими белками. Связывание этих белков привлекает фермент гистондеацетилазы (HDAC), который инициирует ремоделирование хроматина , так что ДНК становится менее доступной для транскрипционного аппарата, такого как РНК-полимераза , эффективно подавляя экспрессию генов. [15]
Модификация гистона
У эукариот геномная ДНК свернута в комплексы белок-ДНК, называемые хроматином . Гистоны , которые являются наиболее распространенным типом белка, обнаруженного в хроматине, выполняют функцию конденсации ДНК; чистый положительный заряд на гистонах облегчает их связывание с ДНК, которая заряжена отрицательно. Основные и повторяющиеся единицы хроматина, нуклеосомы , состоят из октамера гистоновых белков (H2A, H2B, H3 и H4) и ДНК длиной 146 п.н., обернутой вокруг него. Нуклеосомы и ДНК-соединение образуют хроматиновое волокно диаметром 10 нм, которое может быть дополнительно конденсировано. [16] [17]
Упаковка ДНК в хроматин варьируется в зависимости от стадии клеточного цикла и локального участка ДНК. [18] Степень конденсации хроматина связана с определенным состоянием транскрипции. Неупакованный или рыхлый хроматин более транскрипционно активен, чем плотно упакованный хроматин, потому что он более доступен для транскрипционного аппарата. Таким образом, за счет ремоделирования структуры хроматина и изменения плотности упаковки ДНК можно модулировать экспрессию генов. [17]
Хроматина происходит через пост-трансляционной модификации этих N-терминальных хвостов основных белков гистонов . [19] Коллективный набор модификаций гистонов в данной клетке известен как гистоновый код . Известно много различных типов модификации гистонов, включая: ацетилирование , метилирование , фосфорилирование , убиквитинирование , SUMOylation , ADP-рибозилирование , дезаминирование и изомеризацию пролина ; ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинирование участвуют в активации генов, тогда как метилирование, убиквитинирование, SUMOylation, дезаминирование и изомеризация пролина участвуют в репрессии генов. Обратите внимание, что несколько типов модификаций, включая метилирование, фосфорилирование и убиквитинирование, могут быть связаны с различными состояниями транскрипции в зависимости от конкретной аминокислоты на модифицируемом гистоне. Более того, область ДНК, в которой происходит модификация гистонов, также может вызывать различные эффекты; примером является метилирование 3-го корового гистона по остатку лизина 36 (H3K36). Когда H3K36 встречается в кодирующих участках гена, он связан с активацией гена, но противоположное обнаруживается, когда он находится в промоторной области. [17]
Модификации гистонов регулируют экспрессию генов двумя механизмами: нарушением контакта между нуклеосомами и привлечением ремоделирующих хроматин АТФаз . Пример первого механизма происходит во время ацетилирования аминокислот на концах лизина , которое катализируется гистонацетилтрансферазами (HAT) . HAT являются частью мультибелкового комплекса, который рекрутируется на хроматин, когда активаторы связываются с участками связывания ДНК. Ацетилирование эффективно нейтрализует основной заряд лизина, который участвует в стабилизации хроматина за счет его сродства к отрицательно заряженной ДНК. Следовательно, ацетилированные гистоны способствуют диссоциации нуклеосом и, таким образом, может происходить раскручивание хроматина. В состоянии рыхлого хроматина ДНК более доступна для транскрипционного аппарата и, таким образом, экспрессия активируется. Этот процесс можно обратить вспять, удалив гистоновые ацетильные группы деацетилазами. [17] [19]
Второй процесс включает рекрутирование комплексов ремоделирования хроматина путем связывания молекул активатора с соответствующими участками энхансера. Комплексы ремоделирования нуклеосом репозиционируют нуклеосомы с помощью нескольких механизмов, позволяя или блокируя доступность транскрипционного аппарата для ДНК. Белок SWI / SNF комплекса у дрожжей является одним из примеров хроматина комплекса , который регулирует экспрессию многих генов через хроматин. [17] [20]
Связь с другими геномными полями
Эпигеномика имеет много общего с другими областями геномики как в методологии, так и в ее абстрактной цели. Эпигеномика стремится идентифицировать и охарактеризовать эпигенетические модификации на глобальном уровне, подобно изучению полного набора ДНК в геномике или полного набора белков в клетке в протеомике. [1] [2] Логика проведения эпигенетического анализа на глобальном уровне заключается в том, что можно делать выводы об эпигенетических модификациях, которые в противном случае были бы невозможны при анализе конкретных локусов. [16] [1] Как и в других областях геномики, эпигеномика в значительной степени опирается на биоинформатику , которая объединяет дисциплины биологии, математики и информатики. [21] Однако, хотя эпигенетические модификации были известны и изучались в течение десятилетий, именно благодаря этим достижениям в технологии биоинформатики, которые позволили проводить анализ в глобальном масштабе. Многие современные методы все еще основаны на старых методах, часто адаптируя их к геномным анализам, как описано в следующем разделе.
Методы
Анализы модификации гистонов
Клеточные процессы транскрипции , репликации ДНК и репарации ДНК включают взаимодействие между геномной ДНК и ядерными белками. Было известно, что определенные области внутри хроматина чрезвычайно восприимчивы к расщеплению ДНКазой I , которая расщепляет ДНК с низкой специфичностью последовательности. Считалось, что такие гиперчувствительные сайты являются транскрипционно активными областями, о чем свидетельствует их ассоциация с РНК-полимеразой и топоизомеразами I и II . [22]
В настоящее время известно, что чувствительность к участкам ДНКазы I соответствует участкам хроматина с рыхлой связью ДНК-гистон. Гиперчувствительные сайты чаще всего представляют собой промоторные области, которые требуют, чтобы ДНК была доступна для функционирования транскрипционного аппарата, связывающего ДНК. [23]
ChIP-Chip и ChIP-Seq
Модификация гистона была впервые обнаружена на уровне всего генома посредством связывания технологии иммунопреципитации хроматина (ChIP) с ДНК-микрочипами , названной ChIP-Chip . [16] Однако вместо выделения ДНК-связывающего фактора транскрипции или белка-энхансера посредством иммунопреципитации хроматина интересующие нас белки представляют собой сами модифицированные гистоны. Во-первых, гистоны сшиваются с ДНК in vivo с помощью легкой химической обработки (например, формальдегидом ). Затем клетки лизируют, что позволяет экстрагировать и фрагментировать хроматин либо обработкой ультразвуком, либо обработкой неспецифическим рестрикционным ферментом (например, микрококковой нуклеазой ). Специфические для модификации антитела, в свою очередь, используются для иммунопреципитации комплексов ДНК-гистон. [17] После иммунопреципитации ДНК очищают от гистонов, амплифицируют с помощью ПЦР и метят флуоресцентной меткой (например, Cy5, Cy3 ). Заключительный этап включает гибридизацию меченой ДНК, как иммунопреципитированной, так и неиммунопреципитированной ДНК, на микрочипе, содержащем иммобилизованную гДНК. Анализ относительной интенсивности сигнала позволяет определить сайты модификации гистонов. [24] [25]
ChIP-chip широко использовался для характеристики глобальных паттернов модификации гистонов дрожжей . На основании этих исследований были сделаны выводы о функции модификаций гистонов; что активация или репрессия транскрипции была связана с определенными модификациями гистонов и по регионам. Хотя этот метод оказался эффективным, обеспечивая почти полное покрытие эпигенома дрожжей, его использование в более крупных геномах, таких как человеческие, ограничено. [16] [17]
Для изучения модификаций гистонов на истинно геномном уровне другие высокопроизводительные методы были объединены с иммунопреципитацией хроматина, а именно: SAGE: серийный анализ экспрессии генов (ChIP-SAGE), ПЭТ: парное секвенирование конечных меток ( ChIP-PET ). и совсем недавно секвенирование следующего поколения (ChIP-Seq) . ChIP-seq следует тому же протоколу для иммунопреципитации хроматина, но вместо амплификации очищенной ДНК и гибридизации с микрочипом фрагменты ДНК непосредственно секвенируются с использованием параллельного повторного секвенирования следующего поколения. Доказано, что это эффективный метод анализа глобальных паттернов модификации гистонов и сайтов-мишеней белка, обеспечивающий более высокое разрешение, чем предыдущие методы. [16] [24]
Анализы метилирования ДНК
Методы характеристики первичных последовательностей ДНК нельзя было напрямую применять в анализах метилирования. Например, когда ДНК амплифицировалась с помощью ПЦР или методов бактериального клонирования, образец метилирования не копировался, и, таким образом, информация терялась. Метод гибридизации ДНК, используемый в анализах ДНК, в которых радиоактивные зонды использовались для картирования и идентификации последовательностей ДНК, не мог использоваться для различения метилированной и неметилированной ДНК. [26] [9]
Методы, основанные на рестрикционных эндонуклеазах
Негеномные подходы
В самых ранних анализах обнаружения метилирования использовались эндонуклеазы рестрикции, чувствительные к модификации метилирования . Геномную ДНК расщепляли как чувствительными к метилированию, так и нечувствительными рестрикционными ферментами, распознающими один и тот же сайт рестрикции. Идея состоит в том, что всякий раз, когда сайт метилирован, только нечувствительный к метилированию фермент может расщепляться в этом положении. Путем сравнения размеров рестрикционных фрагментов, генерируемых чувствительным к метилированию ферментом, с размерами нечувствительного к метилированию фермента, можно было определить паттерн метилирования области. Этот этап анализа был выполнен путем амплификации рестрикционных фрагментов с помощью ПЦР, разделения их с помощью гель-электрофореза и их анализа с помощью саузерн-блоттинга с зондами для интересующей области. [26] [9]
Этот метод был использован для сравнения паттернов модификации метилирования ДНК в локусах гена взрослого человека и гена гемоглобина . Известно, что разные участки гена (гамма-дельта-бета-глобин) экспрессируются на разных стадиях развития. [27] В соответствии с ролью метилирования ДНК в репрессии генов, области, которые были связаны с высокими уровнями метилирования ДНК, активно не экспрессировались. [28]
Этот метод был ограничен и не подходил для исследований глобального паттерна метилирования или «метилома». Даже внутри определенных локусов он не был полностью репрезентативен для истинного паттерна метилирования, поскольку только те сайты рестрикции с соответствующими анализами чувствительности к метилированию и нечувствительности рестрикции могли предоставить полезную информацию. Дальнейшие осложнения могут возникнуть, когда неполное расщепление ДНК рестрикционными ферментами дает ложноотрицательные результаты. [9]
Общегеномные подходы
Профилирование метилирования ДНК в крупном масштабе впервые стало возможным благодаря методике сканирования генома ограничительного ориентира (RLGS) . Подобно локус-специфическому метилированию ДНК, метод идентифицировал метилированную ДНК через ее ферменты, чувствительные к метилированию при переваривании. Однако именно использование двумерного гель-электрофореза позволило охарактеризовать в более широком масштабе. [9]
Однако только с появлением микрочипов и технологии секвенирования нового поколения стало возможным по-настоящему высокое разрешение и метилирование ДНК в масштабе всего генома. [12] Как и в случае с RLGS, эндонуклеазный компонент сохраняется в методе, но используется в новых технологиях. Одним из таких подходов является гибридизация с дифференциальным метилированием (DMH), при которой один набор геномной ДНК переваривается чувствительными к метилированию рестрикционными ферментами, а параллельный набор ДНК не переваривается. Оба набора ДНК впоследствии амплифицируются, каждый помечается флуоресцентными красителями и используется в гибридизации двухцветного массива. Уровень метилирования ДНК в данном локусе определяется соотношением относительной интенсивности двух красителей. Адаптация секвенирования следующего поколения к анализу метилирования ДНК дает несколько преимуществ по сравнению с гибридизацией массива. Технология на основе последовательностей обеспечивает более высокое разрешение аллель-специфичного метилирования ДНК, может выполняться на больших геномах и не требует создания микрочипов ДНК, требующих корректировки на основе плотности CpG для правильного функционирования. [9]
Бисульфитное секвенирование
Бисульфитное секвенирование основано исключительно на химическом превращении неметилированных цитозинов, так что их можно идентифицировать с помощью стандартных методов секвенирования ДНК. Бисульфат натрия и щелочная обработка делают это путем преобразования неметилированных остатков цитозина в урацил , оставляя метилированный цитозин неизменным. Последующая амплификация и секвенирование необработанной ДНК и ДНК, обработанной бисульфитом натрия, позволяет идентифицировать метилированные сайты. Бисульфитное секвенирование, как и традиционные методы, основанные на ограничении, исторически ограничивалось паттернами метилирования определенных локусов генов, пока не стали доступны технологии полногеномного секвенирования. Однако, в отличие от традиционных методов, основанных на ограничении, бисульфитное секвенирование обеспечивает разрешение на уровне нуклеотидов. [26] [9]
Ограничения бисульфитной техники включают неполное превращение цитозина в урацил, что является источником ложных срабатываний. Кроме того, обработка бисульфитом также вызывает деградацию ДНК и требует дополнительной стадии очистки для удаления бисульфита натрия. [9]
Секвенирование следующего поколения хорошо подходит в качестве дополнения к бисульфитному секвенированию при анализе метилирования всего генома . Хотя теперь это позволяет определять паттерн метилирования с максимально возможным разрешением, на уровне единичного нуклеотида проблемы все еще остаются на стадии сборки из-за уменьшения сложности последовательности в обработанной бисульфитом ДНК. Увеличение длины чтения направлено на решение этой проблемы, позволяя выполнять полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS). Подход WGBS с использованием платформы анализатора генома Illumina уже реализован в Arabidopsis thaliana . [9] Также существуют геномные методы с уменьшенной репрезентативностью, основанные на бисульфитном секвенировании, [29] [30], и они особенно подходят для видов с большими размерами генома. [31]
Анализ доступности хроматина
Доступность хроматина - это мера того, насколько «доступна» или «открыта» область генома для транскрипции или связывания факторов транскрипции. Области, которые недоступны (то есть потому, что они связаны нуклеосомами ), активно не транскрибируются клеткой, в то время как открытые и доступные области активно транскрибируются. [32] Изменения в доступности хроматина являются важными эпигенетическими регуляторными процессами, которые управляют клеточной или контекстно-специфической экспрессией генов. [33] Такие анализы, как MNase-seq, DNase-seq, ATAC-seq или FAIRE-seq, обычно используются для понимания доступного ландшафта хроматина клеток. Главная особенность всех этих методов заключается в том, что они могут выборочно выделять либо последовательности ДНК, которые связаны с гистонами , либо те, которые не связаны. Затем эти последовательности сравнивают с эталонным геномом, что позволяет определить их относительное положение. [34]
MNase-seq и DNase-seq следуют одним и тем же принципам, поскольку они используют литические ферменты, нацеленные на нуклеиновые кислоты, чтобы разрезать нити ДНК, не связанные нуклеосомами или другими белковыми факторами, в то время как связанные части защищены, их можно извлекать и анализировать. Поскольку активные, несвязанные области уничтожаются, их обнаружение может быть только косвенным, путем секвенирования с помощью техники секвенирования следующего поколения и сравнения с эталоном. MNase-seq использует микрококковую нуклеазу, которая производит одноцепочечное расщепление на противоположной цепи целевой последовательности. [35] DNase-seq использует ДНКазу I , неспецифическую эндонуклеазу, расщепляющую двойные цепи. Этот метод был использован до такой степени, что области, свободные от нуклеосом, были помечены как DHS, сайты гиперчувствительности к ДНКазе I [36], и был выбранным методом консорциума ENCODE для анализа доступности хроматина для всего генома. [37] Основная проблема этого метода заключается в том, что распределение расщепления может быть искажено, [38] снижая качество результатов.
FAIRE-seq (Изоляция регулирующих элементов с помощью формальдегида) требует в качестве первого шага перекрестного связывания ДНК с нуклеосомами, а затем срезания ДНК обработкой ультразвуком . Свободные и связанные фрагменты разделяют с помощью традиционной экстракции фенол-хлороформ, поскольку белковая фракция застревает в межфазной фазе, в то время как несвязанная ДНК переходит в водную фазу и может быть проанализирована различными методами. [39] Обработка ультразвуком производит случайные разрывы и, следовательно, не подвержена каким-либо искажениям, а также большая длина фрагментов (200-700 нт) делает этот метод подходящим для более широких областей, в то время как он не может разрешить одиночную нуклеосому. . [34] В отличие от методов, основанных на нуклеазах, FAIRE-seq позволяет прямую идентификацию транскрипционно активных сайтов и менее трудоемкую подготовку образцов. [40]
ATAC-seq основан на активности транспозазы Tn5. Транспозаза используется для вставки меток в геном с более высокой частотой в областях, не покрытых белковыми факторами. Затем теги используются в качестве адаптеров для PRC или других аналитических инструментов. [41]
Прямое обнаружение
Чувствительность к полимеразе при секвенировании одной молекулы в реальном времени позволила ученым напрямую обнаруживать эпигенетические метки, такие как метилирование, когда полимераза движется вдоль секвенируемой молекулы ДНК. [42] Несколько проектов продемонстрировали возможность сбора эпигенетических данных по всему геному бактерий. [43] [44] [45] [46]
Секвенирование нанопор основано на изменении сигналов электролитического тока в соответствии с базовыми модификациями (например, метилированием). Полимеразный опосредует вход оцДНКа в порах: ион-изменение тока модулируют с помощью секции поры и , следовательно , сгенерированная разность записывается раскрывая положение CpG . Различие между гидроксиметилированием и метилированием возможно благодаря твердотельным нанопорам, даже если ток при прохождении через высокополевую область поры может быть немного подвержен влиянию в них. [47] В качестве эталона используется амплифицированная ДНК, которая не представляет скопированных сайтов метилирования после процесса ПЦР . [48] Секвенсор MinION от Oxford Nanopore Technologies - это технология, в которой, согласно скрытой марковской модели, можно отличить неметилированный цитозин от метилированного даже без химической обработки, которая усиливает сигнал этой модификации. Данные обычно регистрируются в пикоамперах в течение установленного времени. Другими устройствами являются Nanopolish и SignaAlign: первое выражает частоту метилирования при чтении, а второе дает вероятность этого, полученную из суммы всех чтений. [49]
Секвенирование одной молекулы в реальном времени (SMRT) - это метод секвенирования одной молекулы ДНК. Секвенирование одной молекулы в реальном времени использует волновод с нулевой модой (ZMW). Единственный фермент ДНК-полимераза связан со дном ZMW с единственной молекулой ДНК в качестве матрицы. Каждое из четырех оснований ДНК присоединено к одному из четырех различных флуоресцентных красителей . Когда нуклеотид включается ДНК-полимеразой, флуоресцентная метка отщепляется, и детектор обнаруживает флуоресцентный сигнал включения нуклеотида. По мере того, как происходит секвенирование, кинетика фермента полимеразы сдвигается, когда он сталкивается с областью метилирования или любой другой модификации основания. Когда фермент встречает химически модифицированные основания, он замедляется или ускоряется однозначно идентифицируемым образом. Импульсы флуоресценции при секвенировании SMRT характеризуются не только своими спектрами излучения, но также их длительностью и интервалом между последовательными импульсами. Эти показатели, определяемые как ширина импульса и длительность между импульсами (IPD), добавляют ценную информацию о кинетике ДНК-полимеразы. Ширина импульса является функцией всех кинетических стадий после связывания нуклеотидов и вплоть до высвобождения флуорофора, а IPD определяется кинетикой связывания нуклеотидов и транслокации полимеразы.
В 2010 году группа ученых продемонстрировала использование секвенирования одной молекулы в реальном времени для прямого обнаружения модифицированного нуклеотида в матрице ДНК, включая N6-метиладенозин , 5-метилцитозин и 5-гидроксилцитозин . Эти различные модификации по-разному влияют на кинетику полимеразы, что позволяет различать их. [50]
В 2017 году другая команда предложила комбинированное преобразование бисульфита с секвенированием одиночных молекул в реальном времени третьего поколения, это называется бисульфитным секвенированием одиночных молекул в реальном времени (SMRT-BS), который представляет собой точный метод целевого анализа метилирования CpG, способный выполнять высокая степень умножения и большая длина считывания (1,5 т.п.н.) без необходимости субклонирования ампликона ПЦР. [51]
Теоретические подходы к моделированию
Первые математические модели для различных состояний нуклеосом, влияющих на экспрессию генов, были введены в 1980-х годах [ref]. Позже об этой идее почти забыли, пока экспериментальные данные не указали на возможную роль ковалентных модификаций гистонов как эпигенетического кода . [52] В следующие несколько лет данные с высокой пропускной способностью действительно раскрыли обилие эпигенетических модификаций и их связь с функционированием хроматина, что послужило стимулом для новых теоретических моделей для появления, поддержания и изменения этих паттернов. [53] [54] Эти модели обычно формулируются в рамках одномерных решеточных подходов. [55]
Смотрите также
- Эпигенетика
- Эпигенетические часы
- Геномика
- Проект человеческого эпигенома
- Epigenomics AG
- Эпигеномика одиночных клеток
Заметки
- ^ a b c Рассел 2010 , стр. 217.
- ^ a b Рассел 2010 , стр. 230.
- ^ a b Рассел 2010 , стр. 475.
- ^ Alabert C, Грот A (февраль 2012). «Репликация хроматина и поддержание эпигенома» (PDF) . Обзоры природы. Молекулярная клеточная биология . 13 (3): 153–67. DOI : 10.1038 / nrm3288 . PMID 22358331 . S2CID 10911203 .
- ^ Гош С., Синха Дж. К., Рагхунатх М. (сентябрь 2016 г.). «Эпигеномное поддержание через диетическое вмешательство может облегчить процесс восстановления ДНК, чтобы замедлить прогрессирование преждевременного старения» . IUBMB Life . 68 (9): 717–21. DOI : 10.1002 / iub.1532 . PMID 27364681 .
- ^ «Потенциальная эпигенетическая и противораковая сила пищевых флавонов» . 2016-10-11.
- ^ а б Zhu J, Adli M, Zou JY, Verstappen G, Coyne M, Zhang X и др. (Январь 2013). «Полногеномные переходы состояний хроматина, связанные с онтогенетическими и средовыми сигналами» . Cell . 152 (3): 642–54. DOI : 10.1016 / j.cell.2012.12.033 . PMC 3563935 . PMID 23333102 .
- ^ Рассел 2010 , стр. 597.
- ^ Б с д е е г ч я J K Laird PW (март 2010 г.). «Принципы и проблемы анализа метилирования ДНК в геноме». Обзоры природы. Генетика . 11 (3): 191–203. DOI : 10.1038 / nrg2732 . PMID 20125086 . S2CID 6780101 .
- ^ Крик Ф (август 1970 г.). «Центральная догма молекулярной биологии». Природа . 227 (5258): 561–3. Bibcode : 1970Natur.227..561C . DOI : 10.1038 / 227561a0 . PMID 4913914 . S2CID 4164029 .
- ^ а б в г Птица А (январь 2002 г.). «Паттерны метилирования ДНК и эпигенетическая память» . Гены и развитие . 16 (1): 6–21. DOI : 10,1101 / gad.947102 . PMID 11782440 .
- ^ а б в г Йоханнес Ф., Колот В., Янсен Р. К. (ноябрь 2008 г.). «Динамика эпигенома: количественная перспектива генетики» (PDF) . Обзоры природы. Генетика . 9 (11): 883–90. DOI : 10.1038 / nrg2467 . PMID 18927581 . S2CID 7641577 .
- ^ Russell 2010 , стр. 518-9.
- ^ Рассел 2010 , стр. 531–2.
- ^ Russell 2010 , стр. 532-3.
- ^ а б в г д Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh T.Y, Schones DE, Wang Z и др. (Май 2007 г.). «Профилирование с высоким разрешением метилирования гистонов в геноме человека». Cell . 129 (4): 823–37. DOI : 10.1016 / j.cell.2007.05.009 . PMID 17512414 . S2CID 6326093 .
- ^ Б с д е е г Кузаридес Т. (февраль 2007 г.). «Модификации хроматина и их функции». Cell . 128 (4): 693–705. DOI : 10.1016 / j.cell.2007.02.005 . PMID 17320507 . S2CID 11691263 .
- Перейти ↑ Russell 2010 , pp. 24–7.
- ^ a b Рассел 2010 , стр. 529–30.
- ^ Рассел 2010 , стр. 530.
- ^ Рассел 2010 , стр. 218.
- ^ Гросс Д.С., Гаррард В.Т. (1988). «Сайты гиперчувствительности к нуклеазам в хроматине». Ежегодный обзор биохимии . 57 : 159–97. DOI : 10.1146 / annurev.bi.57.070188.001111 . PMID 3052270 .
- ^ Рассел 2010 , стр. 529.
- ^ a b Gibson & Muse 2009 , стр. 229–32.
- ^ Рассел 2010 , стр. 532.
- ^ а б в Идс СА, Даненберг К.Д., Каваками К., Сальц Л. Б., Блейк С., Шибата Д., Даненберг П. В., Лэрд П. В. (апрель 2000 г.). «MethyLight: высокопроизводительный тест для измерения метилирования ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (8): 32e – 0. DOI : 10.1093 / NAR / 28.8.e32 . PMC 102836 . PMID 10734209 .
- ^ Russell 2010 , стр. 552-3.
- ^ van der Ploeg LH, Flavell RA (апрель 1980 г.). «Метилирование ДНК в локусе гамма-дельта-бета-глобин человека в эритроидных и неэритроидных тканях». Cell . 19 (4): 947–58. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (80) 90086-0 . PMID 6247075 . S2CID 54324289 .
- ^ Трукки, Эмилиано; Маццарелла, Анна Б.; Gilfillan, Gregor D .; Лоренцо, Мария Т .; Шенсветтер, Питер; Паун, Овидиу (апрель 2016 г.). «BsRADseq: скрининг метилирования ДНК в естественных популяциях немодельных видов» . Молекулярная экология . 25 (8): 1697–1713. DOI : 10.1111 / mec.13550 . PMC 4949719 . PMID 26818626 .
- ^ ван Гурп, Томас П .; Wagemaker, Niels CAM; Воутерс, Бьёрн; Верджер, Филиппины; Уборг, Йооп, штат Нью-Джерси; Верховен, Коэн Дж. Ф. (апрель 2016 г.). «epiGBS: безреференсное бисульфитное секвенирование с пониженным представлением». Методы природы . 13 (4): 322–324. DOI : 10.1038 / nmeth.3763 . ISSN 1548-7105 . PMID 26855363 . S2CID 10457615 .
- ^ Паун, Овидиу; Верховен, Коэн Дж. Ф.; Ричардс, Кристина Л. (январь 2019 г.). «Возможности и ограничения секвенирования бисульфита пониженного представительства в экологической эпигеномике растений» . Новый фитолог . 221 (2): 738–742. DOI : 10.1111 / nph.15388 . ISSN 0028-646X . PMC 6504643 . PMID 30121954 .
- ^ Кундаже А., Меулеман В., Эрнст Дж., Биленки М., Йен А., Херави-Муссави А. и др. (Февраль 2015 г.). «Интегративный анализ 111 эталонных эпигеномов человека» . Природа . 518 (7539): 317–30. Bibcode : 2015Natur.518..317. . DOI : 10,1038 / природа14248 . PMC 4530010 . PMID 25693563 .
- ^ Pennacchio LA, Bickmore W, Dean A, Nobrega MA, Bejerano G (апрель 2013 г.). «Энхансеры: пять основных вопросов» . Обзоры природы. Генетика . 14 (4): 288–95. DOI : 10.1038 / nrg3458 . PMC 4445073 . PMID 23503198 .
- ^ а б Чжан З., Пью Б.Ф. (январь 2011 г.). «Полногеномное картирование первичной структуры хроматина с высоким разрешением» . Cell . 144 (2): 175–86. DOI : 10.1016 / j.cell.2011.01.003 . PMC 3061432 . PMID 21241889 .
- ^ Аксель Р. (июль 1975 г.). «Расщепление ДНК в ядрах и хроматине стафилококковой нуклеазой». Биохимия . 14 (13): 2921–5. DOI : 10.1021 / bi00684a020 . PMID 1148185 .
- ^ Чжоу В., Шервуд Б., Цзи З, Сюэ И, Ду Ф, Бай Дж, Инь М, Джи Х (октябрь 2017 г.). «Общегеномное предсказание гиперчувствительности к ДНКазе I с использованием экспрессии генов» . Nature Communications . 8 (1): 1038. Bibcode : 2017NatCo ... 8.1038Z . DOI : 10.1038 / s41467-017-01188-х . PMC 5715040 . PMID 29051481 .
- ^ Консорциум проектов ENCODE; Олдред, Шелли Ф .; Коллинз, Патрик Дж .; Дэвис, Кэрри А .; Дойл, Фрэнсис; Эпштейн, Чарльз Б.; Фритце, Сет; Харроу, Дженнифер; Каул, Раджиндер; Хатун, Джайнаб; Lajoie, Bryan R .; Ландт, Стивен Дж .; Ли, Бум-Кю; Паули, Флоренсия; Розенблум, Кейт Р .; Сабо, Питер; Сафи, Алексиас; Саньял, Амартья; Шореш, Ноам; Саймон, Джереми М .; Песня, Линьюнь; Альтшулер, Роберт С .; Бирни, Юэн; Браун, Джеймс Б .; Ченг, Чао; Джебали, Сара; Дун, Сяньцзюнь; Данэм, Ян; Эрнст, Джейсон; и другие. (Сентябрь 2012 г.). «Интегрированная энциклопедия элементов ДНК в геноме человека» . Природа . 489 (7414): 57–74. Bibcode : 2012Natur.489 ... 57T . DOI : 10.1038 / nature11247 . PMC 3439153 . PMID 22955616 .
- ^ Хэ ХХ, Мейер К.А., Ху С.С., Чен М.В., Цзанг С., Лю Й., Рао П.К., Фей Т., Сю Х., Лонг Х., Лю XS, Браун М. (январь 2014 г.). «Уточненный протокол DNase-seq и анализ данных выявляют внутреннюю предвзятость в идентификации следа фактора транскрипции» . Методы природы . 11 (1): 73–78. DOI : 10.1038 / nmeth.2762 . PMC 18771 . PMID 24317252 .
- ^ Цомпана М, Бак MJ (20 ноября 2014 г.). «Доступность хроматина: окно в геном» . Эпигенетика и хроматин . 7 (1): 33. DOI : 10,1186 / 1756-8935-7-33 . PMC 4253006 . PMID 25473421 .
- ^ Гиреси П.Г., Ким Дж., Макдэниелл Р.М., Айер В.Р., Либ Дж. Д. (июнь 2007 г.). «FAIRE (Изоляция регуляторных элементов с помощью формальдегида) изолирует активные регуляторные элементы из хроматина человека» . Геномные исследования . 17 (6): 877–85. DOI : 10.1101 / gr.5533506 . PMC 1891346 . PMID 17179217 .
- ^ Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ (декабрь 2013 г.). «Транспозиция нативного хроматина для быстрого и чувствительного эпигеномного профилирования открытого хроматина, ДНК-связывающих белков и положения нуклеосом» . Методы природы . 10 (12): 1213–8. DOI : 10.1038 / nmeth.2688 . PMC 3959825 . PMID 24097267 .
- ^ Schadt EE, Banerjee O, Fang G, Feng Z, Wong WH, Zhang X, Kislyuk A, Clark TA, Luong K, Keren-Paz A, Chess A, Kumar V, Chen-Plotkin A, Sondheimer N, Korlach J, Kasarskis А (январь 2013 г.). «Моделирование изменения кинетической скорости в данных секвенирования ДНК третьего поколения для обнаружения предполагаемых модификаций оснований ДНК» . Геномные исследования . 23 (1): 129–41. DOI : 10.1101 / gr.136739.111 . PMC 3530673 . PMID 23093720 .
- ^ Дэвис Б.М., Чао М.К., Уолдор М.К. (апрель 2013 г.). «Вступление в эру бактериальной эпигеномики с секвенированием одной молекулы ДНК в реальном времени» . Текущее мнение в микробиологии . 16 (2): 192–8. DOI : 10.1016 / j.mib.2013.01.011 . PMC 3646917 . PMID 23434113 .
- ^ Lluch-Senar M, Luong K, Lloréns-Rico V, Delgado J, Fang G, Spittle K и др. (2013). «Комплексная метиломная характеристика Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumoniae при разрешении одной базы» . PLOS Genetics . 9 (1): e1003191. DOI : 10.1371 / journal.pgen.1003191 . PMC 3536716 . PMID 23300489 .
- ^ Мюррей И.А., Кларк Т.А., Морган Р.Д., Бойтано М., Антон Б.П., Луонг К. и др. (Декабрь 2012 г.). «Метиломы шести бактерий» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (22): 11450–62. DOI : 10.1093 / NAR / gks891 . PMC 3526280 . PMID 23034806 .
- ^ Фанг Г., Мунера Д., Фридман Д. И., Мандлик А., Чао М. С., Банерджи О. и др. (Декабрь 2012 г.). «Полногеномное картирование остатков метилированного аденина в патогенной Escherichia coli с использованием одномолекулярного секвенирования в реальном времени» . Природа Биотехнологии . 30 (12): 1232–9. DOI : 10.1038 / nbt.2432 . PMC 3879109 . PMID 23138224 .
- ^ Simpson JT, Workman RE, Zuzarte PC, David M, Dursi LJ, Timp W (апрель 2017 г.). «Обнаружение метилирования цитозина ДНК с помощью секвенирования нанопор» (PDF) . Методы природы . 14 (4): 407–410. DOI : 10.1038 / nmeth.4184 . PMID 28218898 . S2CID 16152628 .
- ^ Ласло А.Х., Деррингтон И.М., Бринкерхофф Х., Лэнгфорд К.В., Нова И.К., Самсон Дж. М., Бартлетт Дж. Дж., Павленок М., Гундлах Дж. Х. (ноябрь 2013 г.). «Обнаружение и картирование 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с нанопорами MspA» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (47): 18904–9. Bibcode : 2013PNAS..11018904L . DOI : 10.1073 / pnas.1310240110 . PMC 3839702 . PMID 24167255 .
- ^ Джайн М., Корен С., Мига К.Х., Квик Дж., Рэнд А.С., Сасани Т.А. и др. (Апрель 2018 г.). «Секвенирование нанопор и сборка генома человека со сверхдлинными считываниями» . Природа Биотехнологии . 36 (4): 338–345. DOI : 10.1038 / nbt.4060 . PMC 5889714 . PMID 29431738 .
- ^ Флусберг Б.А., Вебстер Д.Р., Ли Дж.Х., Трэверс К.Дж., Оливарес Э.К., Кларк Т.А., Корлах Дж., Тернер С.В. (июнь 2010 г.). «Прямое обнаружение метилирования ДНК во время секвенирования одной молекулы в реальном времени» . Методы природы . 7 (6): 461–5. DOI : 10.1038 / nmeth.1459 . PMC 2879396 . PMID 20453866 .
- ^ Ян И, Скотт С.А. (2017). «Профилирование метилирования ДНК с использованием длинночитаемого одиночного бисульфитного секвенирования в режиме реального времени (SMRT-BS)». Функциональная геномика . Методы молекулярной биологии. 1654 . С. 125–134. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-7231-9_8 . ISBN 978-1-4939-7230-2. PMID 28986786 .
- ^ Strahl BD, Allis CD (январь 2000 г.). «Язык ковалентных модификаций гистонов». Природа . 403 (6765): 41–5. Bibcode : 2000Natur.403 ... 41S . DOI : 10.1038 / 47412 . PMID 10638745 . S2CID 4418993 .
- ^ Седиги М., Сенгупта А.М. (ноябрь 2007 г.). «Эпигенетическое молчание хроматина: бистабильность и переднее распространение» . Физическая биология . 4 (4): 246–55. arXiv : 0710.3889 . Bibcode : 2007PhBio ... 4..246S . DOI : 10.1088 / 1478-3975 / 4/4/002 . PMC 2267688 . PMID 17991991 .
- ^ Додд И.Б., Мичельсен М.А., Снеппен К., Тон Г. (май 2007 г.). «Теоретический анализ эпигенетической памяти клетки путем модификации нуклеосом». Cell . 129 (4): 813–22. DOI : 10.1016 / j.cell.2007.02.053 . PMID 17512413 . S2CID 16091877 .
- ^ Тейф В.Б., Риппе К. (октябрь 2010 г.). «Статистико-механические решетчатые модели связывания белок-ДНК в хроматине». Журнал физики: конденсированное вещество . 22 (41): 414105. arXiv : 1004.5514 . Bibcode : 2010JPCM ... 22O4105T . DOI : 10.1088 / 0953-8984 / 22/41/414105 . PMID 21386588 . S2CID 103345 .
Рекомендации
- Гибсон Дж., Муза С.В. (2009). Учебник по геномной науке (3-е изд.). Сандерленд: Sinaeur Associates. ISBN 978-0-87893-236-8.
- Рассел П.Дж. (2010). iGenetics: молекулярный подход (3-е изд.). Сан-Франциско: Пирсон Бенджамин Каммингс. ISBN 978-0-321-56976-9.
дальнейшее чтение
- Боднар Дж. У., Брэдли М.К. (ноябрь 1996 г.). «Переключатель хроматина» . Журнал теоретической биологии . 183 (1): 1–7. DOI : 10,1006 / jtbi.1996.0195 . PMID 8959107 .
- Картрайт, Иллинойс (октябрь 1987 г.). «Переключение развития в структуре хроматина, связанное с использованием альтернативного промотора в гене алкогольдегидрогеназы Drosophila melanogaster» . Журнал EMBO . 6 (10): 3097–101. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1987.tb02618.x . PMC 553749 . PMID 3121305 .
- «2 образца хроматина в сайтах связывания факторов транскрипции» . Природа : 1. 2019. doi : 10.1038 / nature28171 .