Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Рабочий процесс ChIP-секвенирования

Иммунопреципитация хроматина ( ChIP ) - это тип экспериментального метода иммунопреципитации , используемый для исследования взаимодействия между белками и ДНК в клетке. Он направлен на определение того, связаны ли определенные белки с конкретными областями генома, такими как факторы транскрипции на промоторах или других участках связывания ДНК , и, возможно, с определением цистромов . ChIP также направлен на определение конкретного места в геноме, с которым связаны различные модификации гистонов , что указывает на цель модификаторов гистонов. [1]

Вкратце, традиционный метод выглядит следующим образом:

  1. ДНК и ассоциированные белки хроматина в живых клетках или тканях сшиваются (этот шаг опущен в Native ChIP).
  2. Комплексы ДНК-белок (хроматин-белок) затем разрезают на фрагменты ДНК размером ~ 500 п.н. обработкой ультразвуком или расщеплением нуклеазами.
  3. Сшитые фрагменты ДНК, связанные с представляющим интерес белком (белками), избирательно иммунопреципитируют из клеточного дебриса с использованием подходящего белок-специфичного антитела.
  4. Связанные фрагменты ДНК очищаются и определяется их последовательность. Обогащение специфическими последовательностями ДНК представляет области в геноме, с которыми интересующий белок ассоциирован in vivo .

Типичный чип [ править ]

В основном существует два типа ChIP, различающиеся в первую очередь исходным препаратом хроматина. В первом используется обратимо сшитый хроматин, разрезанный ультразвуком, называемый сшитым ChIP (XChIP). Native ChIP (NChIP) использует нативный хроматин, разрезанный путем расщепления микрококковой нуклеазой . [ необходима цитата ]

Сшитый чип (XChIP) [ править ]

Сшитый ChIP в основном подходит для картирования ДНК-мишени факторов транскрипции или других связанных с хроматином белков и использует обратимо сшитый хроматин в качестве исходного материала. Агент для обратимого сшивания может быть формальдегидом [2] или УФ-светом . [3] Затем сшитый хроматин обычно разрезают ультразвуком, получая фрагменты длиной 300–1000 пар оснований (п.н.). Мягкое поперечное сшивание формальдегидом с последующим расщеплением нуклеазами было использовано для сдвига хроматина. [4] Фрагменты хроматина размером 400-500 п.н. оказались подходящими для анализов ChIP, поскольку они покрывают от двух до трех нуклеосом .

Клеточный дебрис в разрезанном лизате затем очищается путем седиментации, и комплексы белок-ДНК избирательно иммунопреципитируются с использованием специфических антител к интересующему белку (белкам). Антитела обычно связаны с агарозой , сефарозой или магнитными шариками. Альтернативно, комплексы хроматин-антитело могут избирательно удерживаться и элюироваться дисками из инертного полимера. [5] [6] Иммунопреципитированные комплексы (т. Е. Комплекс бусина-антитело-белок-последовательность ДНК-мишени) затем собираются и промываются для удаления неспецифически связанного хроматина, перекрестная связь белок-ДНК меняется, и белки удаляются. путем гидролиза с помощью протеиназы К . эпитопвместо антител к интересующему природному белку можно использовать версию с меткой интересующего белка или биотинилирование in vivo [7] .

Затем ДНК, связанная с комплексом, очищается и идентифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), микрочипов ( ChIP-on-chip ), молекулярного клонирования и секвенирования или прямого высокопроизводительного секвенирования ( ChIP-Seq ). [ необходима цитата ]

Родной ЧИП (НЧИП) [ править ]

Нативный ChIP в основном подходит для картирования ДНК-мишени модификаторов гистонов . Обычно в качестве исходного хроматина используют нативный хроматин. Поскольку гистоны обвивают ДНК с образованием нуклеосом, они естественным образом связаны. Затем хроматин расщепляется микрококковой нуклеазой, которая разрезает ДНК по длине линкера, оставляя нуклеосомы нетронутыми и обеспечивая фрагменты ДНК длиной от одной нуклеосомы (200 пар оснований) до пяти нуклеосом (1000 пар оснований). После этого используются методы, аналогичные XChIP. для очистки клеточного дебриса, иммунопреципитации интересующего белка, удаления белка из иммунопреципитированного комплекса, а также очистки и анализа ДНК, связанной с комплексом. [ необходима цитата ]

Сравнение ХЧИП и НЧИП [ править ]

Основным преимуществом NChIP является специфичность антител . Важно отметить, что большинство антител к модифицированным гистонам вырабатываются против нефиксированных синтетических пептидных антигенов, и что эпитопы, которые им необходимо распознавать в XChIP, могут быть нарушены или разрушены сшивкой формальдегидом , в частности, поскольку сшивки , вероятно, будут вовлекают е-аминогруппы лизина в N-концы, разрушая эпитопы. Это, вероятно, объясняет неизменно низкую эффективность протоколов XChIP по сравнению с NChIP.

Но у ХЧИП и НЧИП разные цели и преимущества по отношению друг к другу. XChIP предназначен для картирования сайтов-мишеней факторов транскрипции и других белков, связанных с хроматином; NChIP предназначен для картирования целевых сайтов модификаторов гистонов (см. Таблицу 1).

Таблица 1 Преимущества и недостатки НЧИП и ХЧИП

XChIPНЧИП
ПреимуществаПодходит для факторов транскрипции или любых других слабо связывающихся белков, связанных с хроматином.
Применимо к любым организмам, у которых сложно приготовить нативный белок		Тестируемая специфичность антител
Лучшая специфичность антител в качестве целевого белка в естественных условиях

Лучшая эффективность восстановления хроматина и белка за счет лучшей специфичности антител

НедостаткиНеэффективное восстановление хроматина из-за разрушения эпитопа белка-мишени антитела.
Может привести к ложноположительному результату из-за фиксации временных белков на хроматине.
Широкий диапазон размеров хроматина при срезании из-за случайного разрезания с помощью обработки ультразвуком.		Обычно не подходит для негистоновых белков.
Нуклеосомы могут перестраиваться во время пищеварения.

История и новые методы чипа [ править ]

В 1984 году Джон Т. Лис и Дэвид Гилмор, в то время аспирант в лаборатории Lis, б УФ - облучение, нулевой длины белок-нуклеиновая кислота , сшивающий агент а, ковалентно сшивают белки связаны с ДНК в живых бактериальных клеток. После лизиса поперечно-сшитых клеток и иммунопреципитации бактериальной РНК-полимеразы ДНК, связанная с обогащенной РНК-полимеразой, была гибридизована с зондами, соответствующими различным областям известных генов, для определения распределения in vivo и плотности РНК-полимеразы в этих генах. Год спустя они использовали ту же методологию для изучения распределения эукариотической РНК-полимеразы II на генах теплового шока плодовых мух. Эти отчеты считаются пионерскими исследованиями в области иммунопреципитации хроматина.[8] [9] XChIP был дополнительно модифицирован и разработан Александром Варшавским и его сотрудниками, которые исследовали распределение гистона H4 по генам теплового шока с использованием формальдегидного поперечного связывания. [10] [11] В дальнейшем этот метод был широко развит и усовершенствован. [12] Подход NChIP был впервые описан Hebbes et al ., 1988, [13], а также быстро разработан и уточнен. [14] Типичный анализ ChIP обычно занимает 4–5 дней и требует 10 6 ~ 10 7клетки по крайней мере. Теперь новые методы на ChIP могут быть реализованы всего в 100 ~ 1000 ячеек и завершены в течение одного дня.

  • ЧИП без шариков : в этом новом методе ЧИП используются диски из инертного пористого полимера, функционализированного протеином A или G, в спин-колонках или микропланшетах. Комплекс хроматин-антитело селективно удерживается диском и элюируется для получения обогащенной ДНК для последующих применений, таких как количественная ПЦР и секвенирование. Пористая среда специально разработана для максимального увеличения эффективности захвата и уменьшения неспецифического связывания. Благодаря меньшему количеству ручного управления и оптимизированным протоколам ChIP может быть выполнен за 5 часов. [6]
  • Carrier ChIP (CChIP): этот подход может использовать всего 100 клеток путем добавления клеток Drosophila в качестве хроматина-носителя для уменьшения потерь и облегчения осаждения целевого хроматина. Однако для этого требуются высокоспецифичные праймеры для обнаружения хроматина клетки-мишени на фоне хроматина чужеродного носителя, и это занимает два-три дня. [15]
  • Быстрый ChIP (qChIP): Быстрый анализ ChIP сократил время за счет сокращения двух этапов в типичном анализе ChIP: (i) ультразвуковая ванна ускоряет скорость связывания антител с белками-мишенями - и, таким образом, сокращает время иммунопреципитации (ii) смола- процедура выделения ДНК на основе (Chelex-100) сокращает время обращения перекрестных связей и выделения ДНК. Однако быстрый протокол подходит только для больших образцов клеток (в диапазоне 10 6 ~ 10 7 ). [16] [17] До 24 образцов хроматина могут быть обработаны для получения ДНК, готовой к ПЦР, за 5 часов, что позволяет одновременно исследовать несколько факторов хроматина и / или изучать геномные события в нескольких временных точках.[18]
  • Быстрый и количественный ChIP (Q 2 ChIP): в анализе используется 100 000 клеток в качестве исходного материала и он подходит для до 1000 ChIP гистонов или 100 ChIP факторов транскрипции. Таким образом, многие образцы хроматина могут быть приготовлены и сохранены параллельно, а Q 2 ChIP может быть проведен за день. [19]
  • MicroChIP (µChIP): хроматин обычно получают из 1000 клеток, и до 8 ChIP можно делать параллельно без носителей. Анализ также может начинаться со 100 клеток, но подходит только для одного чипа. Также можно использовать небольшие биопсии ткани (1 мм 3 ), а microChIP можно сделать в течение одного дня. [20] [21]
  • Matrix ChIP : это анализ ChIP на микропланшете с увеличенной пропускной способностью и упрощенной процедурой. Все этапы выполняются в лунках микропланшета без переноса образцов, что дает возможность автоматизации. Он позволяет проводить 96 анализов ChIP на гистоны и различные ДНК-связанные белки за один день. [22]
  • Патология-ЧИП (PAT-ЧИП): этот метод позволяет ЧИП от патологически фиксированных формалином и залитых парафином тканей и, таким образом, использовать архивы патологии (даже те, которым несколько лет) для эпигенетического анализа и идентификации кандидатов эпигенетических биомаркеров или цели. [23]

ChIP также применялся для анализа всего генома в сочетании с технологией микрочипов ( ChIP-on-chip ) или технологией секвенирования ДНК второго поколения ( Chip-Sequencing ). ChIP также может сочетаться с секвенированием парных концевых меток в анализе взаимодействия хроматина с использованием секвенирования парных концевых меток (ChIA-PET), методики, разработанной для крупномасштабного анализа de novo структур хроматина более высокого порядка. [24] [25] [26]

Ограничения [ править ]

  • Крупномасштабные анализы с использованием ChIP затруднительны с использованием интактных модельных организмов. Это связано с тем, что для каждого ТФ необходимо генерировать антитела или, альтернативно, необходимо получать трансгенные модельные организмы, экспрессирующие ТФ, меченные эпитопом.
  • Исследователи, изучающие различные паттерны экспрессии генов у мелких организмов, также сталкиваются с проблемами, поскольку гены экспрессируются на низком уровне, в небольшом количестве клеток, в узком временном окне.
  • В экспериментах с ChIP невозможно различить разные изоформы TF (изоформы белка ).

См. Также [ править ]

  • ChIP-exo , метод, который добавляет обработку экзонуклеазой к процессу ChIP для получения разрешения сайтов связывания до одной пары оснований
  • ChIP-on-chip , сочетает в себе ChIP с технологией микрочипов
  • DamID , альтернативный метод картирования местоположения, не требующий специфических антител
  • RIP-Chip , аналогичный метод анализа взаимодействий РНК-белок

Ссылки [ править ]

  1. ^ Коллас, Филипп. (Январь 2010 г.). «Современное состояние иммунопреципитации хроматина». Молекулярная биотехнология . 45 (1): 87–100. DOI : 10.1007 / s12033-009-9239-8 . PMID  20077036 . S2CID  24225210 .
  2. ↑ Джексон, Вон (ноябрь 1978 г.). «Исследования по организации гистонов в нуклеосомах с использованием формальдегида в качестве обратимого сшивающего агента». Cell . 15 (3): 945–54. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (78) 90278-7 . PMID 569554 . S2CID 25169609 .  
  3. Перейти ↑ Gilmour DS, Lis JT (август 1985). «Взаимодействие in vivo РНК-полимеразы II с генами Drosophila melanogaster » . Молекулярная и клеточная биология . 5 (8): 2009–18. DOI : 10.1128 / mcb.5.8.2009 . PMC 366919 . PMID 3018544 .  
  4. ^ Bauer UM, Daujat S, Nielsen SJ, соловей K, Kouzarides T (январь 2002). «Метилирование аргинина 17 гистона H3 связано с активацией гена» . EMBO Reports . 3 (1): 39–44. DOI : 10.1093 / embo-reports / kvf013 . PMC 1083932 . PMID 11751582 .  
  5. ^ Бейнон, Эми L .; Паркс, Линдси Дж .; Тернер, Мэтью Л .; Рыцарь, Стив; Конлан, Стив; Фрэнсис, Льюис; Акции, Бен (сентябрь 2014 г.). «Chromatrap® 96: новая твердотельная платформа для высокопроизводительных чипов» . Природные методы . 11 (9): i – ii. DOI : 10.1038 / nmeth.f.372 . ISSN 1548-7091 . 
  6. ^ а б «Хроматрап» .Революционная твердотельная платформа для иммунопреципитации хроматина.
  7. ^ Виенс А; и другие. (2004). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия . 325 (1): 68–76. DOI : 10.1016 / j.ab.2003.10.015 . PMID 14715286 . 
  8. Перейти ↑ Gilmour DS, Lis JT (1984). «Обнаружение взаимодействий белок-ДНК in vivo: распределение РНК-полимеразы на конкретных бактериальных генах» . Proc Natl Acad Sci USA . 81 (14): 4275–9. Bibcode : 1984PNAS ... 81.4275G . DOI : 10.1073 / pnas.81.14.4275 . PMC 345570 . PMID 6379641 .  
  9. Перейти ↑ Gilmour DS, Lis JT (август 1985). «Взаимодействие in vivo РНК-полимеразы II с генами Drosophila melanogaster» . Мол. Клетка. Биол . 5 (8): 2009–18. DOI : 10.1128 / mcb.5.8.2009 . PMC 366919 . PMID 3018544 .  
  10. ↑ Варшавский А (декабрь 2008 г.). «Открытие клеточной регуляции деградацией белков» . Журнал биологической химии . 283 (50): 34469–89. DOI : 10.1074 / jbc.X800009200 . PMC 3259866 . PMID 18708349 .  
  11. ^ Соломон, Марк J; Ларсен Памела Л; Варшавский, Александр. (Июнь 1988 г.). «Картирование взаимодействий белок-ДНК in vivo с формальдегидом: доказательство того, что гистон H4 сохраняется на высокотранскрибируемом гене». Cell . 53 (6): 937–47. DOI : 10.1016 / S0092-8674 (88) 90469-2 . PMID 2454748 . S2CID 11169130 .  
  12. ↑ Орландо V (март 2000 г.). «Картирование хромосомных белков in vivo с помощью иммунопреципитации сшитого формальдегидом хроматина». Направления биохимических наук . 25 (3): 99–104. DOI : 10.1016 / S0968-0004 (99) 01535-2 . PMID 10694875 . 
  13. ^ Hebbes, Тим R; Торн, Алан В.; Крэйн-Робинсон С (май 1988 г.). «Прямая связь между ацетилированием ядра гистона и транскрипционно активным хроматином» . Журнал EMBO . 7 (5): 1395–402. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1988.tb02956.x . PMC 458389 . PMID 3409869 .  
  14. ^ О'Нил, Лаура П.; Тернер, Брайан М (сентябрь 2003 г.). «Иммунопреципитация нативного хроматина: НЧИП». Методы . 31 (1): 76–82. DOI : 10.1016 / S1046-2023 (03) 00090-2 . PMID 12893176 . 
  15. ^ О'Нил, Лаура П.; VerMilyea, Matthew D; Тернер, Брайан М (июль 2006 г.). «Эпигенетическая характеристика ранних эмбрионов с протоколом иммунопреципитации хроматина, применимым к небольшим популяциям клеток». Генетика природы . 38 (7): 835–41. DOI : 10.1038 / ng1820 . PMID 16767102 . S2CID 28311996 .  
  16. ^ Нельсон, Джоэл Д; Денисенко, Олег; Сова, Павел; Бомштык, Кароль (2006). «Быстрый анализ иммунопреципитации хроматина» . Исследования нуклеиновых кислот . 34 (1): e2. DOI : 10.1093 / NAR / gnj004 . PMC 1325209 . PMID 16397291 .  
  17. ^ Нельсон, Джоэл Д; Денисенко, Олег; Бомштык, Кароль (2006). «Протокол метода быстрой иммунопреципитации хроматина (ChIP)». Протоколы природы . 1 (1): 179–85. DOI : 10.1038 / nprot.2006.27 . PMID 17406230 . S2CID 20577722 .  
  18. ^ Нельсон Дж, Денисенко О, Bomsztyk К (2009). Метод быстрой иммунопреципитации хроматина . Методы молекулярной биологии . 567 . С. 45–57. DOI : 10.1007 / 978-1-60327-414-2_3 . ISBN 978-1-60327-413-5. PMID  19588084 .
  19. ^ Даль, Джон Арн; Коллас, Филипп (апрель 2007 г.). «Q 2 ChIP, быстрый и количественный анализ иммунопреципитации хроматина, раскрывает эпигенетическую динамику генов, регулируемых развитием, в клетках карциномы человека» . Стволовые клетки . 25 (4): 1037–46. DOI : 10.1634 / стволовые клетки.2006-0430 . PMID 17272500 . 
  20. ^ Даль, Джон Арн; Коллас, Филипп (2008). «Быстрый анализ иммунопреципитации микрохроматина (microChIP)». Протоколы природы . 3 (6): 1032–45. DOI : 10.1038 / nprot.2008.68 . PMID 18536650 . S2CID 29529307 .  
  21. ^ Даль, Джон Арн; Коллас, Филипп (2009). MicroChIP: иммунопреципитация хроматина на малое количество клеток . Методы молекулярной биологии . 567 . С. 59–74. DOI : 10.1007 / 978-1-60327-414-2_4 . ISBN 978-1-60327-413-5. PMID  19588085 .
  22. ^ Фланагин, Стив; Нельсон, Джоэл Д.; Кастнер, Дэвид Дж; Денисенко, Олег; Бомштык, Кароль (февраль 2008 г.). «Метод иммунопреципитации хроматина на основе микропланшетов, Matrix ChIP: платформа для изучения передачи сигналов сложных геномных событий» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (3): e17. DOI : 10.1093 / NAR / gkn001 . PMC 2241906 . PMID 18203739 .  
  23. ^ Фанелли, Мирко; Аматори, Стефано; Бароцци, Ирос; Сончини, Матиас; Зуффо, Роберто Даль; Буччи, Габриэле; Капра, Мария; Куарто, Микаэла; Деллино, Гаэтано Иван (14 декабря 2010 г.). «Патология ткань-иммунопреципитация хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием позволяет составить эпигенетический профиль образцов пациентов» . Труды Национальной академии наук . 107 (50): 21535–21540. Bibcode : 2010PNAS..10721535F . DOI : 10.1073 / pnas.1007647107 . ISSN 0027-8424 . PMC 3003125 . PMID 21106756 .   
  24. ^ Фулвуд, Мелисса J; Хан, Юйюань; Вэй, Чиа-Линь; Жуань, Сяоань; Жуань, Ицзюнь (январь 2010 г.). Анализ взаимодействия хроматина с использованием секвенирования парных концевых меток . Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 21. С. Раздел 21.15.1–25. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb2115s89 . ISBN 978-0471142720. PMC  6924956 . PMID  20069536 .
  25. ^ Ли, Гуолян; Фуллвуд, Мелисса Дж; Сюй, Хань; Мулавади, Фабиан Хендриян; Велков, Стоян; Вега, Винсенсиус; Арияратне, Прамила Нуванта; Мохамед, Юсофф Бин; Оои, Хонг-Сайн; Теннакун, Чандана; Вэй, Чиа-Линь; Жуань, Ицзюнь; Сун, Вин-Кин (февраль 2010 г.). «Инструмент ChIA-PET для всестороннего анализа взаимодействия хроматина с секвенированием парных концевых меток» . Геномная биология . 11 (2): R22. DOI : 10.1186 / ГБ-2010-11-2-r22 . PMC 2872882 . PMID 20181287 .  
  26. ^ "ChIA-PET: Новый метод исследования трехмерного картирования всего генома" . ScienceDaily . Агентство науки, технологий и исследований (A * STAR), Сингапур. 2009-11-08 . Проверено 14 марта 2010 года .

Внешние ссылки [ править ]

  • Хроматин + иммунопреципитация по медицинским предметным рубрикам Национальной медицинской библиотеки США (MeSH)
  • EpigenomeNOE.com
  • Иммунопреципитация хроматина (ChIP) на нефиксированном хроматине из клеток и тканей для анализа модификаций гистонов
  • Иммунопреципитация хроматина (ChIP) белковых комплексов: картирование геномных мишеней ядерных белков в культивируемых клетках