| Протеиназа К | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Структура протеиназы К. [1] | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Номер ЕС | 3.4.21.64 | ||||||||
| Базы данных | |||||||||
| IntEnz | Просмотр IntEnz | ||||||||
| БРЕНДА | BRENDA запись | ||||||||
| ExPASy | Просмотр NiceZyme | ||||||||
| КЕГГ | Запись в KEGG | ||||||||
| MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
| ПРИАМ | профиль | ||||||||
| Структуры PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| |||||||||
| Протеиназа К | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||
| Организм | |||||||
| Символ | ПРОК | ||||||
| UniProt | P06873 | ||||||
| |||||||
В молекулярной биологии протеиназы К ( EC 3.4.21.64 , протеазы К , эндопептидазы К , Tritirachium щелочной протеиназы , Tritirachium альбом серин протеиназ , Tritirachium альбом протеиназы К ) представляет собой широкий спектр серин - протеазы . [2] [3] [4] фермент был обнаружен в 1974 г. в экстрактах гриба Engyodontium альбома (ранее Tritirachium альбома ). [5] Протеиназа К способна переваривать волосы (кератин ), отсюда и название «Протеиназа К». Преобладающим сайтом расщепления является пептидная связь, прилегающая к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот с заблокированными альфа- аминогруппами . Он обычно используется из-за его широкой специфичности. Этот фермент принадлежит к семейству пептидаз S8 ( субтилизин ). Молекулярная масса протеиназы К составляет 28 900 дальтон (28,9 кДа).
Ферментная активность [ править ]
Активированный кальцием, фермент переваривает белки преимущественно после гидрофобных аминокислот (алифатических, ароматических и других гидрофобных аминокислот). Хотя ионы кальция не влияют на активность фермента, они вносят вклад в его стабильность. Белки будут полностью переварены, если время инкубации будет продолжительным и концентрация протеазы достаточно высока. После удаления ионов кальция стабильность фермента снижается, но протеолитическая активность сохраняется. [6] Протеиназа К имеет два сайта связывания для Ca 2+., которые расположены близко к активному центру, но не принимают непосредственного участия в каталитическом механизме. Остаточной активности достаточно для переваривания белков, которые обычно загрязняют препараты нуклеиновых кислот. Поэтому расщепление протеиназой К для очистки нуклеиновых кислот обычно проводят в присутствии ЭДТА (ингибирование ферментов, зависимых от ионов металлов, таких как нуклеазы).
Протеиназа К также стабильна в широком диапазоне pH (4–12) с оптимумом pH 8,0. [5] Повышение температуры реакции с 37 ° C до 50–60 ° C может увеличить активность в несколько раз, например добавление 0,5–1% додецилсульфата натрия (SDS) или хлорида гуанидиния (3 M), тиоцианата гуанидиния. (1 M) и мочевина (4 M) [ оспаривается (для: источник температуры не указан) ] . Вышеупомянутые условия усиливают активность протеиназы К, делая сайты расщепления ее субстратом более доступными. Температура выше 65 ° C, трихлоруксусная кислота(TCA) или ингибиторы сериновой протеазы AEBSF , PMSF или DFP подавляют активность. Протеиназа K не ингибируется гуанидиния хлоридом , гуанидиния тиоцианатом , мочевиной , саркозилом , тритоном X-100 , твином 20 , SDS , цитратом , йодуксусной кислотой , ЭДТА или другими ингибиторами сериновой протеазы, такими как Nα-тозил-Lys хлорметилкетон (TLCK). и Nα-тозил-Phe хлорметилкетон (TPCK) [ цитата необходима ] .
Активность протеазы К в обычно используемых буферах [7]
| Буфер (pH = 8,0, 50 ° C, 1,25 мкг / мл протеазы K, инкубация 15 мин) | Активность протеиназы К (%) |
|---|---|
| 30 мМ Трис · Cl | 100 |
| 30 мМ трис · Cl; 30 мМ ЭДТА; 5% Твин 20 ; 0,5% Тритон Х-100 ; 800 мМ GuHCl | 313 |
| 36 мМ Трис · Cl; 36 мМ ЭДТА; 5% Твин 20 ; 0,36% Тритон Х-100 ; 735 мМ GuHCl | 301 |
| 10 мМ трис · Cl; 25 мМ ЭДТА; 100 мМ NaCl; 0,5% SDS | 128 |
| 10 мМ трис · Cl; 100 мМ ЭДТА; 20 мМ NaCl; 1% Саркосил | 74 |
| 10 мМ трис · Cl; 50 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl 2 ; 0,45% Твин 20 ; 0,5% Тритон Х-100 | 106 |
| 10 мМ трис · Cl; 100 мМ ЭДТА; 0,5% SDS | 120 |
| 30 мМ трис · Cl; 10 мМ ЭДТА; 1% SDS | 203 |
Приложения [ править ]
Протеиназа К обычно используется в молекулярной биологии для переваривания белка и удаления загрязнений из препаратов нуклеиновой кислоты . Добавление протеиназы К к препаратам нуклеиновых кислот быстро инактивирует нуклеазы, которые в противном случае могли бы разрушить ДНК или РНК во время очистки. Он очень подходит для этого применения, поскольку фермент активен в присутствии химических веществ, денатурирующих белки, таких как SDS и мочевина , хелатирующие агенты, такие как EDTA , сульфгидрильные реагенты, а также трипсин или химотрипсин.ингибиторы. Протеиназа К используется для разрушения белков в лизатах клеток (ткани, клетки культур клеток) и для высвобождения нуклеиновых кислот, так как она очень эффективно инактивирует ДНКазы и РНКазы. Некоторые примеры применения: Протеиназа К очень полезна для выделения высоконативных, неповрежденных ДНК или РНК, поскольку большинство ДНКаз и РНКаз микробов или млекопитающих быстро инактивируются ферментом, особенно в присутствии 0,5–1% SDS. Очистка геномной ДНК от бактерий (минипреп): бактерии из насыщенной жидкой культуры лизируются и белки удаляются путем гидролиза 100 мкг / мл протеиназы К в течение 1 ч при 37 ° C;
Активность фермента в отношении нативных белков стимулируется денатурантами, такими как SDS. Напротив, при измерении с использованием пептидных субстратов денатуранты ингибируют фермент. Причина этого результата в том, что денатурирующие агенты разворачивают белковые субстраты и делают их более доступными для протеазы. [8]
Ингибиторы [ править ]
Протеиназа К имеет две дисульфидные связи [9], но проявляет более высокую протеолитическую активность в присутствии восстанавливающих агентов (например, 5 мМ DTT ) [10], предполагая, что предполагаемое восстановление ее собственных дисульфидных связей не приводит к ее необратимой инактивации. Протеиназа K ингибируется ингибиторами сериновой протеазы, такими как фенилметилсульфонилфторид ( PMSF ), диизопропилфторфосфат ( DFP ) или 4- (2-аминоэтил) бензолсульфонилфторид ( AEBSF ). На активность протеиназы K не влияют реагенты, модифицирующие сульфгидрил: пара-хлормеркурибензойная кислота ( PCMB ), N-альфа-тозил-L-лизил-хлорметилкетон ( TLCK), или N-альфа-тозил-1-фенилаланин- хлорметилкетон ( TPCK ) [10], хотя предположительно, если бы эти реагенты были включены вместе с реагентами, восстанавливающими дисульфид, которые обнажили обычно недоступные тиолы протеиназы K, тогда это могло бы быть ингибировано.
Ссылки [ править ]
- ^ Betzel С, Синг Т.П., Visanji М, Петерс К, Fittkau S, Saenger Вт, Уилсон К. (июль 1993). «Структура комплекса протеиназы К с ингибитором субстратного аналога гексапептида с разрешением 2,2-А» . J. Biol. Chem . 268 (21): 15854–8. DOI : 10.1016 / S0021-9258 (18) 82332-8 . PMID 8340410 .
- ^ Morihara К, Тсузуки Н (1975). «Специфика протеиназы К из Tritirachium album Limber для синтетических пептидов» . Agric. Биол. Chem . 39 (7): 1489–1492. DOI : 10.1271 / bbb1961.39.1489 .
- ^ Kraus E, Kiltz HH, Femfert UF (февраль 1976 г.). «Специфичность протеиназы К против окисленной В-цепи инсулина». Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem . 357 (2): 233–7. PMID 943367 .
- ^ Жаны KD, Ледерер G, B Mayer (1986). «Аминокислотная последовательность протеиназы К плесени Tritirachium album Limber». FEBS Lett . 199 (2): 139–144. DOI : 10.1016 / 0014-5793 (86) 80467-7 . S2CID 85577597 .
- ^ a b Ebeling W, Hennrich N, Klockow M, Metz H, Orth HD, Lang H (август 1974 г.). «Протеиназа К из Tritirachium album Limber» . Евро. J. Biochem . 47 (1): 91–7. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1974.tb03671.x . PMID 4373242 .
- ↑ Müller A, Hinrichs W, Wolf WM, Saenger W (сентябрь 1994 г.). «Кристаллическая структура бескальциевой протеиназы К при разрешении 1,5-А». J. Biol. Chem . 269 (37): 23108–11. DOI : 10.2210 / pdb2pkc / PDB . PMID 8083213 .
- ^ Ag-Scientific. «Часто задаваемые вопросы о протеиназе К» .
- ^ Хилз Н, Wiegers U, Adamietz Р (1975). «Стимуляция действия протеиназы К денатурирующими агентами: применение для выделения нуклеиновых кислот и деградации« замаскированных »белков» . Европейский журнал биохимии . 56 (1): 103–108. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1975.tb02211.x . PMID 1236799 .
- ^ "ПРОК - предшественник протеиназы К - альбом Parengyodontium" . Uniprot . 2019-12-11 . Проверено 7 февраля 2020 .
- ^ a b «Протокол Novagen Proteinase K» (PDF) . Сигма Олдрич . 2019-12-11 . Проверено 7 февраля 2020 .
Внешние ссылки [ править ]
- Руководство по ферменту Уортингтона протеиназа К
