Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Белые полосы ДНК на темно-сером фоне, напоминающие ступеньки лестницы
Апоптотическая фрагментация ДНК, визуализированная с помощью лестничного анализа ДНК (слева). Для сравнения включены маркер размером 1 т.п.н. (посередине) и контрольная ДНК (справа).

Апоптотическая фрагментация ДНК - ключевая особенность апоптоза , типа запрограммированной гибели клеток . Апоптоз характеризуется активацией эндогенных эндонуклеаз , в частности, ДНКазы, активируемой каспазой-3 (CAD) [1], с последующим расщеплением ядерной ДНК на межнуклеосомные фрагменты примерно из 180 пар оснований  (п.н.) и их кратные (360, 540 и т. Д.) ). Фрагментации ДНК апоптические используются в качестве маркеров апоптоза и для идентификации апоптотических клеток либо с помощью ДНК Лэддеринга анализа, [2] TUNEL анализ , [3] [4]или обнаружением клеток с фракционным содержанием ДНК (« клетки sub G 1 ») на гистограммах частоты содержания ДНК, например, как в анализе Николетти . [5] [6]

Механизм [ править ]

Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ДНК, - это C- аспаза- А- активированная D- наза (CAD) . САПР , как правило , подавляется другим белком, то я nhibitor из C aspase A ctivated D Nase (ИАП) . Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза, каспаза-3 , расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD. [7]

Двойная цепь ДНК, обернутая вокруг ядра гистоновых белков.
Нуклеосом , состоящий из ДНК (серый) обернута вокруг гистона тетрамера (цветной). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в межнуклеосомной линкерной области, которая является частью ДНК, не намотанной вокруг гистонов.

CAD расщепляет ДНК в межнуклеосомных линкерных сайтах между нуклеосомами , белковыми структурами, которые встречаются в хроматине с интервалами ~ 180 п.н. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов , основных белков нуклеосом. Сайты линкера - единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны CAD.

Распад ядерной ДНК на нуклеосомные единицы - один из признаков апоптотической гибели клетки. Это происходит в ответ на различные стимулы апоптоза в самых разных типах клеток. Молекулярная характеристика этого процесса позволила идентифицировать специфическую ДНКазу (CAD, активируемую каспазой ДНКазу), которая расщепляет хромосомную ДНК каспазозависимым образом. CAD синтезируется с помощью ICAD (ингибитор CAD), который работает как специфический шаперон.для CAD и обнаруживается в комплексе с ICAD в пролиферирующих клетках. Когда клетки подвергаются апоптозу, каспаза 3 расщепляет ICAD для диссоциации комплекса CAD: ICAD, позволяя CAD расщеплять хромосомную ДНК. Таким образом, клетки, у которых отсутствует ICAD или которые экспрессируют устойчивый к каспазам мутантный ICAD, не обнаруживают фрагментацию ДНК во время апоптоза, хотя они действительно проявляют некоторые другие признаки апоптоза и погибают.

Несмотря на то, что большая работа была проделана по анализу апоптотических событий, мало информации доступно для связи времени морфологических особенностей на поверхности клетки и в ядре с биохимической деградацией ДНК в одних и тех же клетках. Апоптоз может быть инициирован множеством различных механизмов в разных типах клеток, и кинетика этих событий широко варьируется, от нескольких минут до нескольких дней в зависимости от клеточной системы. Наличие или отсутствие конкретного апоптотического события, включая фрагментацию ДНК, зависит от «временного окна», в котором исследуется кинетический процесс апоптоза. Часто это может затруднить идентификацию апоптозных клеток, если клеточные популяции анализируются только в один момент времени, например, после индукции апоптоза.

Историческая справка [ править ]

Открытие межнуклеосомной фрагментации геномной ДНК на регулярные повторяющиеся олигонуклеосомные фрагменты, генерируемые Ca / Mg-зависимой эндонуклеазой, принято как один из наиболее хорошо охарактеризованных биохимических маркеров апоптоза (запрограммированной гибели клеток).

В 1970 году Уильямсон описал, что цитоплазматическая ДНК, выделенная из клеток печени мыши после культивирования, характеризуется фрагментами ДНК с молекулярной массой, кратной 135 кДа . Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК были специфическим продуктом деградации ядерной ДНК. [8] В 1972 году Керр , Уилли и Карри ввели термин « апоптоз» и на основании морфологических особенностей отличили этот тип гибели клеток от некроза. [9] В 1973 году Хьюиш и Бургойнво время изучения структуры субхроматина обнаружил, что хроматин доступен для эндонуклеазы Ca ++ / Mg ++ , в результате чего образуется продукт переваривания с регулярным рядом молекулярных масс, подобным тому, который ранее был описан Williamson (1970). . [10] В 1974 году Уильямс , Литтл и Шиплис использованием клеток, подвергшихся различным типам травм, обнаружил, что во время гибели клетки деградированная ДНК «в каждом случае имела модальное значение от 10 (x6) до 10 (x7) дальтон, и клеточный метаболизм необходим для разрушения ДНК» . Однако это наблюдение не указывало на то, «была ли атака с разрезом на молекулу ДНК случайной или, скорее, на конкретном участке, имеющем структурное или функциональное значение». [11] В 1976 году , Scalka , Matyasova и Cejkova описано межнуклеосомной фрагментацию облученного лимфоидной хроматина ДНК в естественных условиях . [12]

Прошло шесть лет с 1972 по 1978/1980 годы до открытия и оценки межнуклеосомной фрагментации ДНК во время апоптотической гибели клеток как признака апоптоза. С 1972 г. ( Kerr , Wyllie , and Currie [9] ) принято считать, что гибель лимфоцитов, вызванная глюкокортикоидами, является формой апоптоза. В 1978 году Захарян и Погосянпредставили документ, показывающий, что индуцированная глюкокортикоидами деградация ДНК в лимфоидной ткани, тимусе и селезенке крыс происходила по определенному паттерну с образованием фрагментов ДНК, которые были электрофоретически подобны тем, которые наблюдались после обработки хроматина микрококковой нуклеазой, что указывало на межнуклеосомный паттерн расщепления ДНК. деградация произошла во время апоптоза. [13] [14] Таким образом, была обнаружена первая связь между запрограммированной гибелью клеток / апоптозом и межнуклеосомной фрагментацией ДНК хроматина, которая вскоре стала характерной особенностью апоптоза.

В 1980 году Уилли сообщил о дополнительных доказательствах паттерна межнуклеосомного расщепления ДНК как специфической особенности обработанных глюкокортикоидами тимоцитов, подвергающихся апоптозу. [2] Модель межнуклеосомного расщепления ДНК наблюдалась как специфический признак апоптоза в 1978/1980 годах и с тех пор стала признанным признаком запрограммированной гибели клеток. В 1992 году Gorczyca et al. [3] и Гавриэли и др. [4] независимо описали анализ фрагментации ДНК, основанный на использовании терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы ( TUNEL ), который стал одним из стандартных методов обнаружения и идентификации апоптотических клеток.

Анализы обнаружения [ править ]

Проточная цитометрия наиболее часто используется для обнаружения апоптотической фрагментации ДНК. Анализ содержания ДНК с помощью проточной цитометрии может идентифицировать апоптотические клетки с фрагментированной ДНК как клетки с фракционным содержанием ДНК, часто называемые клетками sub-G 1 . Проточно-цитометрический анализ с использованием флуорохромакридинового оранжевого показывает, что фрагментация ДНК внутри отдельных клеток является прерывистой, вероятно, отражая различные уровни ограничения доступа ДНК к ДНКазе наднуклеосомным и нуклеосомным уровнями структуры хроматина. [15] Присутствие апоптозных « клеток sub-G 1 » также может быть обнаружено в клетках, предварительно фиксированных в этаноле, но не после фиксации сшивающими фиксаторами, такими какформальдегид . Поздние апоптотические клетки S и G 2 не могут быть обнаружены с помощью этого подхода, поскольку их фракционное содержание ДНК может перекрываться с содержанием неапоптотических клеток G 1 . [16] Обработка клеток детергентом, предшествующим или одновременно с ДНК-флуорохромом, также выявляет фрагментацию ДНК в силу присутствия клеток или фрагментов суб-G 1 , как определено Nicoletti et al. [5]

Апоптотическая фрагментация ДНК также может быть обнаружена с помощью анализа TUNEL . Анализ TUNEL на основе флуорохромов, применимый для проточной цитометрии , коррелирует обнаружение разрывов цепи ДНК с содержанием клеточной ДНК и, таким образом, с положением фазы клеточного цикла . Тест TUNEL для мечения авидин-пероксидазой применим для светопоглощающей микроскопии. Многие комплекты, относящиеся к TUNEL, коммерчески доступны. Фрагментации ДНК Апоптотическая также анализировали с помощью агарозного гель - электрофореза , чтобы продемонстрировать «лестницы» образец с интервалом ~ 180-BP . [1] Некроз, с другой стороны, обычно характеризуется случайной фрагментацией ДНК, которая образует «мазок» на агарозных гелях.

См. Также [ править ]

  • ДНКаза, активируемая каспазой
  • Лестница ДНК

Ссылки [ править ]

  1. ^ Сакахира, H; Энари, М; Нагата, С. (январь 1998 г.). «Расщепление ингибитора CAD при активации CAD и деградации ДНК во время апоптоза». Природа . 391 : 96–9. DOI : 10.1038 / 34214 . PMID  9422513 .
  2. ^ а б Уилли А.Х. (1980-04-10). «Индуцированный глюкокортикоидами апоптоз тимоцитов связан с активацией эндогенной эндонуклеазы». Природа . 284 (5756): 555–556. DOI : 10.1038 / 284555a0 . ISSN 0028-0836 . PMID 6245367 .  
  3. ^ Gorczyca, Вт; Бруно, S; Darzynkiewicz, R; Гонг, Дж; Darzynkiewicz, Z (ноябрь 1992 г.). «Разрывы цепи ДНК, происходящие во время апоптоза - их раннее обнаружение in situ с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и ник-трансляции и предотвращение с помощью ингибиторов сериновой протеазы». Int J Oncol . 1 (6): 639–48. PMID 21584593 . 
  4. ^ Gavrieli, Y .; Sherman, Y .; Бен-Сассон, С.А. (1992). «Идентификация запрограммированной гибели клеток in situ с помощью специфической маркировки фрагментации ядерной ДНК» . Журнал клеточной биологии . 119 (3): 493–501. DOI : 10,1083 / jcb.119.3.493 . PMC 2289665 . PMID 1400587 .  
  5. ^ Николетти I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C (3 июня 1991 г.). «Быстрый и простой метод измерения апоптоза тимоцитов с помощью окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии». Журнал иммунологических методов . 139 (2): 271–279. DOI : 10.1016 / 0022-1759 (91) 90198-O . PMID 1710634 . 
  6. ^ Риккарди C, Николетти I (9 ноября 2006 г.). «Анализ апоптоза окрашиванием пропидиум йодидом и проточной цитометрией». Протоколы природы . 1 (3): 1458–1461. DOI : 10.1038 / nprot.2006.238 . PMID 17406435 . 
  7. ^ Nagata, S .; Enari, M .; Sakahira, H .; Yokoyama, H .; Okawa, K .; Ивамацу, А. (1998). «Активированная каспазой ДНКаза, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD». Природа . 391 (6662): 43–50. DOI : 10.1038 / 34112 . PMID 9422506 . 
  8. ^ Уильямсон, Роберт (1970-07-14). «Свойства быстро меченных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур клеток печени эмбриональных мышей». Журнал молекулярной биологии . 51 (1): 157–168. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (70) 90277-9 . ISSN 0022-2836 . PMID 5481278 .  
  9. ^ а б Керр, Джон FR; Вилли, Эндрю ; Карри, Аластер (август 1972 г.). «Апоптоз: основной биологический феномен с широким спектром влияния на кинетику тканей» . Британский журнал рака . 26 (4): 239–257. DOI : 10.1038 / bjc.1972.33 . ISSN 0007-0920 . PMC 2008650 . PMID 4561027 .   
  10. ^ Burgoyne, Leigh A .; Бургойн, Ли А. (1973-05-15). «Субструктура хроматина. Переваривание ДНК хроматина в регулярно расположенных сайтах ядерной дезоксирибонуклеазой». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях . 52 (2): 504–510. DOI : 10.1016 / 0006-291X (73) 90740-7 . ISSN 0006-291X . PMID 4711166 .  
  11. ^ Уильямс, Джерри Р .; Литтл, Джон Б.; Шипли, Уильям У. (1974-12-20). «Ассоциация гибели клеток млекопитающих со специфической эндонуклеолитической деградацией ДНК». Природа . 252 (5485): 754–755. DOI : 10.1038 / 252754a0 . ISSN 0028-0836 . PMID 4474604 .  
  12. ^ Ческова, М .; Matyásová, J; Цейкова, М. (1976-12-31). «ДНК в хроматине облученных лимфоидных тканей распадается in vivo на регулярные фрагменты». Письма FEBS . 72 (2): 271–274. DOI : 10.1016 / 0014-5793 (76) 80984-2 . ISSN 0014-5793 . PMID 16386038 .  
  13. ↑ Захарян, РА; Погосян Р.Г. (1978). «Глюкокортикоидная индукция деградации ДНК хроматина лимфоцитов на регулярно повторяющиеся фрагменты in vivo ». Доклады Академии Наук Армянской ССР . 67 (2): 110–114. ISSN 0366-8606 .  КОДЕКС: DANAAW, CAN 90: 115643 AN 1979: 115643 CAPLUS (Copyright 2003 ACS)
  14. ^ Chemical Abstracts v.90,1979; 90: 115643n с.112.
  15. ^ Кайстура, М; Галика, HD; Прижма, Дж; Darzynkiewicz, Z (2007). «Прерывистая фрагментация ядерной ДНК во время апоптоза, обнаруживаемая отдельными пиками« суб-G1 »на гистограммах содержания ДНК» . Цитометрии . 71 : 125–31. DOI : 10.1002 / cyto.a.20357 . PMID 17252584 . 
  16. ^ Влодкович, D; Телфорд, Вт; Скоммер, Дж; Darzynkiewicz, Z (2011). «Апоптоз и за его пределами: цитометрия в исследованиях запрограммированной гибели клеток» . Методы Cell Biol . 103 : 55–98. DOI : 10.1016 / B978-0-12-385493-3.00004-8 . PMC 3263828 . PMID 21722800 .  
  • Gold R, Schmied M, Rothe G, Zischler H, Breitschopf H, Wekerle H, Lassmann H (июль 1993 г.). «Обнаружение фрагментации ДНК при апоптозе: применение ник-трансляции in situ в системах культур клеток и срезах тканей» . Журнал гистохимии и цитохимии . 41 (7): 1023–1030. DOI : 10.1177 / 41.7.8515045 . ISSN  0022-1554 . PMID  8515045 . Архивировано из оригинала на 2009-01-08 . Проверено 12 марта 2008 .
  • Коллинз Дж. А., Шанди, Калифорния, Янг К. К., Веселы Дж., Уиллингем М.С. (июль 1997 г.). «Основная фрагментация ДНК - это поздний этап апоптоза» . Журнал гистохимии и цитохимии . 45 (7): 923–934. DOI : 10.1177 / 002215549704500702 . ISSN  0022-1554 . PMID  9212818 . Архивировано из оригинала на 2009-06-08 . Проверено 13 марта 2008 .
  • Нагата, Сигекадзу (2000-04-10). «Апоптотическая фрагментация ДНК». Экспериментальные исследования клеток . 256 (1): 12–18. DOI : 10.1006 / excr.2000.4834 . ISSN  0014-4827 . PMID  10739646 .

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Corcoran, G .; Fix, L .; Джонс, Д.П .; Мослен, МП; Nicotera, P .; Оберхаммер, ФА; Буттян Р. (1994). «Апоптоз: молекулярная контрольная точка токсичности». Токсикология и прикладная фармакология . 128 (2): 169–181. DOI : 10,1006 / taap.1994.1195 . PMID  7940532 .
  • Уокер, PR; Pandey, S .; Сикорска, М. (1995). «Деградация хроматина в апоптотических клетках». Гибель клеток и дифференциация . 2 (2): 97–104. PMID  17180071 .
  • Уокер, PR; Сикорска, М. (1994). «Эндонуклеазная активность, структура хроматина и деградация ДНК при апоптозе». Биохимия и клеточная биология . 72 (11–12): 615–623. DOI : 10.1139 / o94-081 . PMID  7654335 .
  • Pandey, S .; Уокер, PR; Сикорска, М. (1994). «Отдельные пулы эндонуклеазной активности ответственны за межнуклеосомную и высокомолекулярную фрагментацию ДНК во время апоптоза». Биохимия и клеточная биология . 72 (11–12): 625–629. DOI : 10.1139 / o94-082 . PMID  7654336 .
  • Muñoz, E .; Marcos, A .; Унзага, MT (1981). «Влияние дефицита белка на активность лизосомальных ферментов селезенки и тимуса крыс-отъемышей». Журнал питания . 111 (12): 2133–2141. DOI : 10.1093 / JN / 111.12.2133 . PMID  7310538 .
  • Варела П., Маркос А., Рей де Виньяс Дж. Л. (1985). «Эффект лечения кортизолом у беременных крыс на рост клеток потомства». IRCS Medical Science . 13 : 412–413.