Бактериальный один гибрид система (B1H) представляет собой способ для идентификации последовательности-конкретный целевого участка в ДНК-связывающий домен . В этой системе данный фактор транскрипции (TF) выражается как слияние с субъединицей РНК-полимеразы . Параллельно, библиотека рандомизированных олигонуклеотидов, представляющих потенциальные целевые последовательности TF, клонируется в отдельный вектор, содержащий выбираемые гены HIS3 и URA3 . Если ДНК-связывающий домен (приманка) связывает потенциальную целевую ДНК - сайт (добычу) в естественных условиях , он будет рекрутировать РНК - полимеразы с промотором и активировать транскрипцию из репортерных геновв этом клоне. Два репортерных гена, HIS3 и URA3, позволяют проводить положительный и отрицательный отбор соответственно. В конце процесса положительные клоны секвенируют и исследуют с помощью инструментов поиска мотивов для определения предпочтительной целевой последовательности ДНК. [1]
Вступление
Во всех живых организмах регуляция экспрессии генов контролируется взаимодействиями между ДНК-связывающими регуляторными белками (факторами транскрипции) и цис-регуляторными элементами , последовательностями ДНК в генах или вокруг них, которые действуют как сайты-мишени для ДНК-связывающих белков. Связываясь с цис-регуляторными последовательностями и друг с другом, факторы транскрипции точно настраивают уровни транскрипции путем стабилизации / дестабилизации связывания РНК-полимеразы с промотором гена. Но, несмотря на их важность и повсеместное распространение, мало что известно о том, где именно связывается каждый из этих регуляторных белков. Литература предполагает, что почти 8% генов человека кодируют факторы транскрипции, а функции и особенности их взаимодействия остаются в значительной степени неизученными. [2] Мы находимся на пороге конвергенции высокопроизводительных технологий и теории генома, что позволяет исследователям начать картирование этих взаимодействий в масштабе всего генома. Только недавно было предпринято полное исследование специфичности связывания ДНК для большого семейства ДНК-связывающих доменов. B1H - лишь один из многих новых методов, полезных для изучения взаимодействий белок-ДНК. [3]
Обзор метода
Требуется трансформация бактериального хозяина двумя разными плазмидами . Один предназначен для экспрессии интересующего ДНК-связывающего белка в виде конструкции слияния с субъединицей РНК-полимеразы (приманка). Другая плазмида содержит область рандомизированной последовательности, представляющую потенциальные сайты связывания (жертвы), которые, если они связаны химерным продуктом слияния, стимулируют экспрессию нижележащих репортерных генов. Эта репортерная область способствует как положительному, так и отрицательному отбору с помощью HIS3 и URA3, соответственно, что вместе позволяет изолировать жертву, содержащую истинную последовательность-мишень ДНК. HIS3 и URA3 кодируют белки, необходимые для биосинтеза гистидина и урацила.
Использование отрицательного селектируемого маркера имеет решающее значение для значительного снижения числа ложноположительных результатов. Самоактивирующаяся жертва, где рандомизированная область способствует экспрессии репортера в отсутствие связывания ТФ, удаляется путем трансформации библиотеки репортерного вектора в бактерии в отсутствие приманки и анализа роста на чашках, содержащих 5-фтороротовую кислоту (5- FOA). Белковый продукт URA3 превращает 5-FOA в токсичное соединение, тем самым обеспечивая выживание только тех колоний, которые содержат репортерные векторы, которые не самоактивируются. Отрицательный отбор обычно предшествует положительному отбору, так что меньшая очищенная библиотека жертв может быть подвергнута более строгому процессу положительного отбора. После трансформации очищенной библиотеки жертвы плазмидой-приманкой положительный отбор достигается путем выращивания E. coli- хозяина на минимальной среде без гистидина (селективная среда NM), которая обычно дополняется различными концентрациями 3-аминотриазола (3-AT ), конкурентный ингибитор HIS3. HIS3 кодирует белок, необходимый для биосинтеза гистидина, и, таким образом, только те клетки, которые содержат комбинации приманка-жертва, которые активируют репортерные гены, смогут расти. Манипулирование концентрациями 3-АТ позволяет охарактеризовать строгость связывания. Таким образом, исследователи могут оценить, насколько сильно приманка связывает свою жертву (коррелирует с уровнем экспрессии HIS3), и, таким образом, определить, какие сайты связывания нуклеотидов имеют сильные или слабые предпочтения для данного основания. Другими словами, если клетки могут расти, несмотря на высокую концентрацию 3-AT, связывание наживки с жертвой должно быть достаточно строгим, чтобы управлять экспрессией репортерного гена (HIS3) на достаточном уровне, чтобы преодолеть возникающее в результате конкурентное ингибирование. Наконец, положительные клоны секвенируют и исследуют с помощью существующих инструментов поиска мотивов (например, MEME, BioProspector). [3]
История метода
Одногибридная система бактерий претерпела многочисленные модификации с момента ее создания в 2005 году. [3] В конечном итоге она возникла как разновидность двугибридной системы бактерий, задуманной в 2000 году, которая сама была вдохновлена дрожжевой одно- и двугибридной системой. системы. [4] В то время как двухгибридные версии могут оценивать как взаимодействие белок-белок, так и взаимодействия белок-ДНК, одногибридная система специализируется на последнем. Система B1H Менга и др. Отличается от двухгибридной версии по двум ключевым аспектам. Он использует рандомизированную библиотеку жертв, состоящую из множества (<2x10 8 ) уникальных потенциальных последовательностей-мишеней, а также добавляет этап отрицательного отбора, чтобы очистить эту библиотеку от самоактивирующихся клонов. [1] [3] Хотя эти идеи были заимствованы из исходной одногибридной системы дрожжей, [5] они еще не применялись к бактериальному хозяину до 2005 года. По мере роста популярности метода исследователи внесли поправки в свои протоколы, чтобы улучшить Система B1H. Конструирование конструкции слияния (приманки) для омега-субъединицы, а не альфа-субъединицы РНК-полимеразы недавно стало предпочтительным для улучшения стереохимии и динамического диапазона химеры. [6] цинк-палец область на слитой конструкции и соответствующая целевой участок ДНК, прилегающий к рандомизированном последовательности добычи, также были добавлены к аффинности и специфичности взаимодействий белок-ДНК увеличивается. Эта повышенная общая аффинность связывания позволяет охарактеризовать даже те белки ДНК-связывающих доменов, которые слабо взаимодействуют с последовательностью-мишенью. [7]
.
Преимущества
Система B1H имеет значительные преимущества перед другими методами исследования взаимодействий белок-ДНК. Считывание результатов иммунопреципитации хроматина на основе микрочипов ( ChIP-chip ) для высокопроизводительного определения сайта связывания основано на специфических антителах, которые не всегда могут быть доступны. Методы, основанные на белков-связывающих микрочипах, также требуют дополнительных этапов очистки белка, которые не требуются в системе B1H. Кроме того, эти методы на основе микрочипов часто являются недопустимыми с точки зрения необходимости специальных средств и опыта для анализа полученных данных. SELEX , другая система, обычно используемая для идентификации нуклеиновых кислот-мишеней для ДНК-связывающих белков, требует нескольких раундов отбора. Напротив, бактериальная одногибридная система требует всего одного раунда отбора in vitro и также предлагает низкотехнологичную альтернативу технологиям на основе микрочипов. Антитела не требуются для изучения взаимодействий ДНК-связывающих белков в системе B1H. Еще одно преимущество состоит в том, что система B1H работает не только с мономерными белками, но и с белками, которые связывают ДНК в виде комплексов. Систему B1H следует рассматривать как специализированный метод изучения взаимодействий ДНК-белок, тогда как двухгибридные варианты ( B2H и Y2H ) могут оценивать взаимодействия как белок-белок, так и белок-ДНК. Эти двухгибридные системы являются многоцелевыми, но ограничены с точки зрения анализа только одной библиотеки «жертвы». Преимущество бактериальной одногибридной системы по сравнению с дрожжевой одногибридной системой (Y1H) заключается в более высокой эффективности трансформации плазмид в бактерии, что позволяет исследовать более сложные «жертвенные» библиотеки. [1] [3]
Ограничения
Несмотря на вышеупомянутые преимущества как специализированного инструмента, система B1H имеет некоторые недостатки. Во-первых, система отбора B1H ограничена в своей способности определять специфичность связывания факторов транскрипции с длинными сайтами связывания. Это происходит из-за того, что количество рандомизированных клонов «жертвы», необходимых для представления всех возможных последовательностей-мишеней, увеличивается экспоненциально с количеством нуклеотидов в этой последовательности-мишени. Во-вторых, некоторые эукариотические факторы могут не экспрессироваться или эффективно сворачиваться в бактериальной системе, что связано с различными регуляторными сетями и транскрипционным механизмом. Следовательно, при работе с ДНК-связывающими белками эукариотического происхождения может оказаться полезной гибридная система на основе дрожжей. В-третьих, система B1H может не идеально подходить для факторов транскрипции, которые распознают сайты связывания с низким сродством. Логика здесь в том, что конкуренция, создаваемая сайтами связывания в другом месте бактериального генома, может ограничивать сигнал, который может быть реализован от одного сайта связывания, который присутствует перед репортером. [1] [3]
Заявление
Система B1H предоставляет инструмент в нашем арсенале для определения специфичности связывания ДНК факторов транскрипции и, таким образом, прогнозирования их генов-мишеней и регуляторных элементов геномной ДНК. Это также позволяет исследовать эффекты белок-белковых взаимодействий на связывание ДНК, что может в дальнейшем направлять предсказание цис-регуляторных модулей на основе кластеризации сайтов связывания. Более того, система отбора B1H имеет значение для предсказания регуляторных ролей ранее не охарактеризованных факторов транскрипции. [1]
Конкретные примеры
Используя бактериальную одногибридную систему, одно исследование охарактеризовало 35 членов сети сегментации Drosophilia melanogaster, которая включает репрезентативных членов всех основных классов белков ДНК-связывающих доменов. [8] Значение для медицинских исследований очевидно из другого исследования, в котором система B1H использовалась для определения специфичности связывания ДНК регулятора транскрипции для гена Mycobacterium tuberculosis . [9] Система B1H также использовалась для идентификации важного элемента обмена у Escherichia coli. [10]
Внешние ссылки
- https://web.archive.org/web/20090320023431/http://lawsonlab.umassmed.edu/PDFs/B1HStart.pdf
- http://www.umassmed.edu/pgfe/faculty/wolfe.cfm?start=0&
Рекомендации
- ^ Б с д й Булык М (2005). «Открытие регуляторных элементов ДНК с помощью бактерий» . Природа Биотехнологии . 23 (8): 942–944. DOI : 10.1038 / nbt0805-942 . PMC 2720157 . PMID 16082362 .
- ^ Мессина Д. Н., Гласскок Дж., Гиш В., Ловетт М. (2004). «Анализ генов факторов транскрипции человека на основе ORFeome и создание микроматрицы для исследования их экспрессии» . Геномные исследования . 14 (2004): 2041–2047. DOI : 10.1101 / gr.2584104 . ISSN 1088-9051 . PMC 528918 . PMID 15489324 .
- ^ а б в г д е Менг X, Вулф С.А. (2006). «Идентификация последовательностей ДНК, распознаваемых фактором транскрипции, с использованием бактериальной одногибридной системы». Протоколы природы . 1 (1): 30–45. DOI : 10.1038 / nprot.2006.6 . PMID 17406209 .
- ^ Джунг Дж. К., Рамм Э. Л., Пабо КО (2000). «Бактериальная двухгибридная селекционная система для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий» . PNAS . 97 (13): 7382–7387. DOI : 10.1073 / pnas.110149297 . PMC 16554 . PMID 10852947 .
- ^ Уилсон Т.Е., Фарнер Т.Дж., Джонстон М., Милбрант Дж. (1991). «Идентификация сайта связывания ДНК для NGFI-B путем генетической селекции у дрожжей». Наука . 252 (5010): 1296–1300. DOI : 10.1126 / science.1925541 . PMID 1925541 .
- ^ Нойес МБ, Кристенсен Р.Г., Вакабаяши А., Стормо Г.Д., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2006). «Анализ особенностей гомеодомена позволяет предсказывать предпочтительные места узнавания в масштабах всей семьи» . Cell . 133 (2008): 1277–1289. DOI : 10.1016 / j.cell.2008.05.023 . PMC 2478728 . PMID 18585360 .
- ^ Дурай С., Босли А., Абуленсия А.Б., Чандрасегаран С., Остермайер М. (2006). «Бактериальная система селекции One-Hybrid для исследования взаимодействий цинка Fingure_DNA». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 9 (2006): 301–311. DOI : 10.2174 / 138620706776843147 .
- ^ Нойес МБ, Мэн Х, Вакабаяши А., Синха С., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2008). «Систематическая характеристика факторов, которые регулируют сегментацию дрозофилы с помощью бактериальной одногибридной системы» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (8): 2547–2560. DOI : 10.1093 / NAR / gkn048 . PMC 2377422 . PMID 18332042 .
- ^ Го М., Фэн Х, Чжан Дж, Ван В., Ван Дж, Ли И, Гао С, Чен Х, Фэн Й, Хе З. Г. (2009). «Рассечение регуляторных путей транскрипции с помощью новой бактериальной системы с одним гибридом-репортером» . Геномные исследования . 19 (7): 1301–8. DOI : 10.1101 / gr.086595.108 . PMC 2704442 . PMID 19228590 .
- ^ Обрист М, Нарберхаус Ф (2005). «Идентификация элемента оборота в области 2.1 Escherichia coli 32 с помощью бактериального одногибридного подхода» . Журнал бактериологии . 187 (11): 3807–3813. DOI : 10.1128 / JB.187.11.3807-3813.2005 . PMC 1112070 . PMID 15901705 .