Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема, показывающая, как репортерный ген используется для изучения регуляторной последовательности.

В молекулярной биологии , ген - репортер (часто просто репортер ) является ген , который исследователи прикрепиться к регуляторной последовательности другого интересующего гена в бактерии , культуры клеток , животных или растений. Такие гены называются репортерами, потому что характеристики, которые они придают экспрессирующим их организмам, легко идентифицируются и измеряются, или потому что они являются селектируемыми маркерами . Репортерные гены часто используются в качестве индикатора того, был ли определенный ген поглощен или экспрессирован в популяции клеток или организма.

Общие репортерные гены [ править ]

Чтобы ввести репортерный ген в организм, ученые помещают репортерный ген и интересующий ген в одну и ту же конструкцию ДНК, которую нужно вставить в клетку или организм. Для бактерий или прокариотических клеток в культуре это обычно в форме кольцевой молекулы ДНК, называемой плазмидой . Важно использовать репортерный ген, который изначально не экспрессируется в исследуемой клетке или организме, поскольку экспрессия репортера используется как маркер для успешного поглощения интересующего гена. [1]

Обычно используемые репортерные гены, которые вызывают визуально идентифицируемые характеристики, обычно включают флуоресцентные и люминесцентные белки. Примеры включают ген, который кодирует зеленый флуоресцентный белок медузы (GFP), который заставляет клетки, которые его экспрессируют, светиться зеленым в синем свете, фермент люцифераза , который катализирует реакцию с люциферином для получения света, и красный флуоресцентный белок из гена dsRed.  [ фр ] . [2] [3] [4] [5] [6] Ген GUS обычно используется в растениях, но люцифераза и GFPстановятся все более распространенными. [7] [8]

Распространенным репортером у бактерий является ген lacZ E. coli , который кодирует белок бета-галактозидазу . [9] Этот фермент заставляет бактерии, экспрессирующие ген, казаться синими при выращивании на среде, содержащей аналог субстрата X-gal . Примером селектируемого маркера, который также является репортером у бактерий, является ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), который придает устойчивость к антибиотику хлорамфениколу . [10]

Имя генаГенный продуктАнализRef.
lacZβ-галактозидазаФерментный анализ, гистохимический[9]
КотХлорамфениколацетилтрансферазаАцетилирование хлорамфеникола[10]
gfpЗеленый флуоресцентный белокФлуоресцентный[2]
rfpКрасный флуоресцентный белокМикроскопия , спектрофотометрия [11]
люкФермент люциферазаБиолюминесценция[3]

Анализы трансформации и трансфекции [ править ]

Многие методы трансфекции и трансформации - два способа экспрессии чужеродного или модифицированного гена в организме - эффективны только для небольшого процента населения, подвергающегося этим методам. [12] [13] Таким образом, необходим метод для идентификации тех немногих успешных событий поглощения гена. Репортерные гены, используемые таким образом, обычно экспрессируются под своим собственным промотором (участками ДНК, которые инициируют транскрипцию гена), независимо от промотора введенного интересующего гена; репортерный ген может быть экспрессирован конститутивно (то есть он «всегда включен») или индуцибельно с внешним вмешательством, таким как введение изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида.(IPTG) в системе β-галактозидазы. [9] В результате экспрессия репортерного гена не зависит от экспрессии интересующего гена, что является преимуществом, когда интересующий ген экспрессируется только при определенных условиях или в тканях, к которым трудно получить доступ. [1]

В случае репортеров селектируемых маркеров, таких как CAT, трансфицированная популяция бактерий может быть выращена на субстрате, содержащем хлорамфеникол . Только те клетки, которые успешно восприняли конструкцию, содержащую ген CAT, выживут и будут размножаться в этих условиях. [10]

Анализы экспрессии генов [ править ]

Репортерные гены можно использовать для анализа экспрессии интересующего гена, который обычно трудно оценить количественно. [1] Репортерные гены могут продуцировать белок, который не оказывает очевидного или немедленного воздействия на культуру клеток или организм. В идеале они не присутствуют в природном геноме, чтобы можно было выделить экспрессию репортерного гена в результате экспрессии интересующего гена. [1] [14]

Чтобы активировать репортерные гены, они могут быть экспрессированы конститутивно , где они непосредственно прикреплены к интересующему гену для создания слияния генов . [15] Этот метод является примером использования цис- действующих элементов, где два гена находятся под одними и теми же промоторными элементами и транскрибируются в единую молекулу матричной РНК . МРНК затем переводится в белок. Важно, чтобы оба белка могли правильно складываться.в их активные конформации и взаимодействуют со своими субстратами, несмотря на слияние. При создании конструкции ДНК обычно включается сегмент ДНК, кодирующий гибкую полипептидную линкерную область, так что репортер и генный продукт будут лишь минимально мешать друг другу. [16] [17] Репортерные гены также могут экспрессироваться индукцией во время роста. В этих случаях, транс -Актерские элементы, такие как факторы транскрипции используют для экспрессии гена - репортера. [18] [19]

Анализ репортерных генов все чаще используется в высокопроизводительном скрининге (HTS) для выявления низкомолекулярных ингибиторов и активаторов белковых мишеней и путей для открытия лекарств и химической биологии . Поскольку сами репортерные ферменты (например, люцифераза светлячков ) могут быть прямыми мишенями для малых молекул и затруднять интерпретацию данных HTS, были разработаны новые конструкции репортеров совпадений, включающие подавление артефактов. [20] [21]

Тесты промотора [ править ]

Репортерные гены можно использовать для анализа активности конкретного промотора в клетке или организме. [22] В этом случае нет отдельного «интересующего гена»; репортерный ген просто помещается под контроль целевого промотора, и активность продукта репортерного гена измеряется количественно. Результаты обычно сообщаются относительно активности под «консенсусным» промотором, который, как известно, индуцирует сильную экспрессию гена. [23]

Дальнейшее использование [ править ]

Более сложное использование репортерных генов в больших масштабах - это двухгибридный скрининг , целью которого является идентификация белков, которые естественным образом взаимодействуют друг с другом in vivo . [24]

См. Также [ править ]

  • Репортерская система GUS

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d Дебнат, Мусуми; Прасад, Годаварти БКС; Бисен, Пракаш С. (2010), Дебнат, Моусуми; Прасад, Годаварти БКС; Bisen, Пракаш С. (ред.), "Репортер Gene", Молекулярная диагностика: Обещания и возможности , Springer Нидерланды, С. 71-84,. Дои : 10.1007 / 978-90-481-3261-4_5 , ISBN 978-90-481-3261-4
  2. ^ a b Соболески, Марк Р .; Оукс, Джейсон; Хэлфорд, Уильям П. (март 2005 г.). «Зеленый флуоресцентный белок является количественным репортером экспрессии генов в отдельных эукариотических клетках» . Журнал FASEB . 19 (3): 440–442. DOI : 10,1096 / fj.04-3180fje . ISSN 0892-6638 . PMC 1242169 . PMID 15640280 .   
  3. ^ a b Смейл, ST (01.05.2010). «Люциферазный анализ». Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2010 (5): pdb.prot5421. DOI : 10,1101 / pdb.prot5421 . ISSN 1559-6095 . PMID 20439408 .  
  4. ^ Jach, Guido; Бино, Эльке; Фрингс, Сабина; Люкса, Керстин; Шелл, Джефф (2001). «Использование красного флуоресцентного белка из Discosoma sp. (DsRED) в качестве репортера для экспрессии генов растений» . Заводской журнал . 28 (4): 483–491. DOI : 10.1046 / j.1365-313X.2001.01153.x . ISSN 1365-313X . PMID 11737785 .  
  5. ^ Чжан, Цисян; Walawage, Sriema L .; Триколи, Дэвид М .; Dandekar, Abhaya M .; Лесли, Чарльз А. (май 2015 г.). «Красный флуоресцентный белок (DsRED) от Discosoma sp. В качестве репортера экспрессии генов в соматических эмбрионах грецкого ореха». Отчеты о растительных клетках . 34 (5): 861–869. DOI : 10.1007 / s00299-015-1749-1 . ISSN 1432-203X . PMID 25627255 . S2CID 9184712 .   
  6. ^ Миккельсен, Лизбет; Саррокко, Сабрина; Любек, Метте; Дженсен, Дэн Функ (01.06.2003). «Экспрессия красного флуоресцентного белка DsRed-Express в мицелиальных грибах аскомицетов» . Письма о микробиологии FEMS . 223 (1): 135–139. DOI : 10.1016 / S0378-1097 (03) 00355-0 . ISSN 0378-1097 . PMID 12799012 .  
  7. ^ Халл, Джиллиан А .; Девич, Мартин (1995), Джонс, Хеддвин (редактор), «Система репортерных генов β-глюкуронидазы (gus)», Протоколы переноса и экспрессии генов растений , Методы в молекулярной биологии ™, Springer New York, 49 , стр. 125 -141, DOI : 10,1385 / 0-89603-321-х: 125 , ISBN 978-1-59259-536-5, PMID  8563799
  8. ^ Ку, Дж .; Kim, Y .; Kim, J .; Yeom, M .; Ли, IC; Нам, HG (2007). "Репортер слияния GUS / люциферазы для улавливания генов растений и для анализа активности промотора с люциферин-зависимым контролем стабильности репортерного белка" . Физиология растений и клеток . 48 (8): 1121–1131. DOI : 10.1093 / PCP / pcm081 . PMID 17597079 . 
  9. ^ a b c Смейл, ST (01.05.2010). «-Галактозидазный анализ». Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2010 (5): pdb.prot5423. DOI : 10,1101 / pdb.prot5423 . ISSN 1559-6095 . PMID 20439410 .  
  10. ^ a b c Смейл, ST (01.05.2010). «Анализ ацетилтрансферазы хлорамфеникола». Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2010 (5): pdb.prot5422. DOI : 10,1101 / pdb.prot5422 . ISSN 1559-6095 . PMID 20439409 .  
  11. ^ Нордгрен, ИК; Тавассоли, А (2014). «Двунаправленная флуоресцентная двухгибридная система для мониторинга белок-белковых взаимодействий» . Молекулярные биосистемы . 10 (3): 485–90. DOI : 10.1039 / c3mb70438f . PMID 24382456 . 
  12. ^ Hanahan, Дуглас; Джесси, Джоэл; Блум, Фредрик Р. (1991-01-01), "[4] Плазмида превращение кишечной палочки и других бактерий", Методы в энзимологии , генетические бактериальных системах, Academic Press, 204 : 63-113, DOI : 10.1016 / 0076- 6879 (91) 04006-а , ISBN 9780121821050, PMID  1943786
  13. ^ Ханахан, Дуглас (1983-06-05). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 557–580. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (83) 80284-8 . ISSN 0022-2836 . PMID 6345791 .  
  14. ^ Promega Corporation, Promega Corporation (22 октября 2014). «Введение в анализы репортерных генов» . YouTube . Проверено 21 марта 2020 года .
  15. ^ де Йонг, Хидде; Гейзельманн, Йоханнес (2015). Малер, Одед; Халас, Адам; Данг, Тао; Пьяцца, Карла (ред.). «Флуоресцентные репортерные гены и анализ бактериальных регуляторных сетей». Гибридная системная биология . Конспект лекций по информатике. Издательство Springer International. 7699 : 27–50. DOI : 10.1007 / 978-3-319-27656-4_2 . ISBN 978-3-319-27656-4.
  16. ^ Спектор, Дэвид Л .; Голдман, Роберт Д. (01.12.2006). «Создание и экспрессия слитых белков GFP». Протоколы CSH . 2006 (7): pdb.prot4649. DOI : 10,1101 / pdb.prot4649 . PMID 22484672 . 
  17. ^ Чен, Сяоин; Заро, Дженника; Шен, Вэй-Чан (2013-10-15). «Линкеры слитого белка: свойства, дизайн и функциональность» . Расширенные обзоры доставки лекарств . 65 (10): 1357–1369. DOI : 10.1016 / j.addr.2012.09.039 . ISSN 0169-409X . PMC 3726540 . PMID 23026637 .   
  18. ^ Ханко, Эрик KR; Минтон, Найджел П .; Малис, Наглис (2019-01-01), Шукла, Арун К. (редактор), «Глава девятая - Дизайн, клонирование и характеристика систем экспрессии индуцируемых генов на основе факторов транскрипции» , Методы в энзимологии , подходы к химической и синтетической биологии Чтобы понять функции сотовой связи - часть A, Academic Press, 621 : 153–169, doi : 10.1016 / bs.mie.2019.02.018 , PMID 31128776 , получено 16 декабря 2019 г. 
  19. ^ Каллунки, Туула; Баришич, Марин; Яаттеля, Марья; Лю, Бинь (30.07.2019). "Как выбрать правильную систему экспрессии индуцибельных генов для исследований на млекопитающих?" . Ячейки . 8 (8): 796. DOI : 10,3390 / cells8080796 . ISSN 2073-4409 . PMC 6721553 . PMID 31366153 .   
  20. ^ Cheng, KC; Инглезе, Дж. (2012). «Система совпадений репортер-ген для высокопроизводительного скрининга» . Природные методы . 9 (10): 937. DOI : 10.1038 / nmeth.2170 . PMC 4970863 . PMID 23018994 .  
  21. ^ Hasson, SA; Фогель, AI; Wang, C .; MacArthur, R .; Guha, R .; Heman-Ackahc, S .; Martin, S .; Youle, RJ; Инглезе, Дж. (2015). «Хемогеномное профилирование эндогенной экспрессии PARK2 с использованием редактируемого геномом репортера совпадений». ACS Chem. Биол . 10 (5): 1188–1197. DOI : 10.1021 / cb5010417 . PMID 25689131 . 
  22. ^ Jugder, Бат-Эрдэнэ; Уэлч, Джеффри; Брейди, Нади; Маркиз, Кристофер П. (26.07.2016). «Создание и использование растворимого промотора гидрогеназы (PSH) aCupriavidus necatorH16 слияния togfp (зеленый флуоресцентный белок)» . PeerJ . 4 : e2269. DOI : 10,7717 / peerj.2269 . ISSN 2167-8359 . PMC 4974937 . PMID 27547572 .   
  23. ^ Сольберг, Нина; Краусс, Стефан (2013). «Люциферазный анализ для изучения активности клонированного фрагмента промоторной ДНК». Генная регуляция . Методы молекулярной биологии (Клифтон, Нью-Джерси). 977 . С. 65–78. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-284-1_6 . ISBN 978-1-62703-283-4. ISSN  1940-6029 . PMID  23436354 .
  24. ^ Брюкнер, Анна; Польж, Сесиль; Ленце, Николас; Ауэрбах, Даниэль; Шлаттнер, Уве (18.06.2009). «Двугибридные дрожжи, мощный инструмент для системной биологии» . Международный журнал молекулярных наук . 10 (6): 2763–2788. DOI : 10.3390 / ijms10062763 . ISSN 1422-0067 . PMC 2705515 . PMID 19582228 .   

Внешние ссылки [ править ]

  • Основные исследования и обновленная информация о репортерных генах.
  • Окрашивание целых эмбрионов мыши на активность β-галактозидазы (lacZ)