Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Лактозы оперон (лаковый оперон) представляет собой оперон , необходимый для транспортировки и обмена веществ из лактозы в E.coli и многих других кишечных бактерий . Хотя глюкоза является предпочтительным источником углерода для большинства бактерий, lac- оперон обеспечивает эффективное переваривание лактозы, когда глюкоза недоступна из-за активности бета-галактозидазы . [1] Генная регуляция из лакового оперона была первым генетическим механизмом регулирования следует четко понимать, поэтому она стала главным примером прокариотического генная регуляция . По этой причине его часто обсуждают на вводных курсах молекулярной и клеточной биологии . Эта система метаболизма лактозы была использована Франсуа Жакобом и Жаком Моно, чтобы определить, как биологическая клетка знает, какой фермент синтезировать. Их работа над lac-опероном принесла им Нобелевскую премию по физиологии в 1965 г. [1]

Бактериальные опероны - это полицистронные транскрипты , которые способны продуцировать несколько белков из одного транскрипта мРНК . В этом случае, когда лактоза требуется в качестве источника сахара для бактерии, могут экспрессироваться три гена lac-оперона и транслироваться их последующие белки: lacZ , lacY и lacA . Продуктом гена lacZ является β-галактозидаза, которая расщепляет лактозу, дисахарид , на глюкозу и галактозу . lacY кодирует бета-галактозид пермеазу , мембранный белоккоторый внедряется в цитоплазматическую мембрану, обеспечивая клеточный транспорт лактозы в клетку. Наконец, lacA кодирует галактозидацетилтрансферазу .

Схема лака оперона.

Лаковый оперон. Вверху: репрессированные, внизу: активные.
1 : РНК-полимераза, 2 : Репрессор, 3 : Промотор, 4 : Оператор, 5 : Лактоза, 6 : lacZ , 7 : lacY , 8 : lacA .

Было бы расточительно производить ферменты при отсутствии лактозы или при наличии предпочтительного источника энергии, такого как глюкоза. Лаковый оперон использует механизм управления с двумя частей , чтобы гарантировать , что энергия клетки затрачивают производить ферменты , кодируемые лаковый оперон только тогда , когда это необходимо. [2] В отсутствие лактозы lac- репрессор , lacI, останавливает производство ферментов, кодируемых lac- опероном. [3] lac-репрессор экспрессируется всегда, если с ним не связывается ко-индуктор. Другими словами, он транскрибируется только в присутствии низкомолекулярного соиндуктора. В присутствии глюкозы белок-активатор катаболита(CAP), необходимый для производства ферментов, остается неактивным, а EIIA Glc отключает пермеазу лактозы, чтобы предотвратить транспортировку лактозы в клетку. Этот механизм двойного контроля вызывает последовательное использование глюкозы и лактозы в двух различных фазах роста, известных как диаукси .

Структура [ править ]

Состав лактозы и продуктов ее расщепления.
  • Лаковые оперон состоит из 3 структурных генов , и промотор , в терминатора , регулятора , а также оператора . Три структурных гена: lacZ , lacY и lacA .
    • lacZ кодирует β-галактозидазу (LacZ), внутриклеточный фермент, который расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу .
    • lacY кодирует бета-галактозидпермеазу (LacY), трансмембранный симпортер, который перекачивает β-галактозиды, включая лактозу, в клетку, используя протонный градиент в том же направлении. Пермеаза увеличивает проницаемость клетки для β-галактозидов .
    • lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу (LacA), фермент, который передает ацетильную группу от ацетил-КоА к β-галактозидам.

Только lacZ и lacY необходимы для катаболизма лактозы .

Генетическая номенклатура [ править ]

Трехбуквенные сокращения используются для описания фенотипов бактерий, включая E. coli .

Примеры включают:

  • Lac (способность использовать лактозу),
  • His (способность синтезировать аминокислоту гистидин)
  • Мот (плавательная моторика)
  • Sm R (устойчивость к антибиотику стрептомицину )

В случае Lac клетки дикого типа представляют собой Lac + и могут использовать лактозу в качестве источника углерода и энергии, в то время как производные мутанта Lac - не могут использовать лактозу. Те же три буквы обычно используются (строчные, курсив) для обозначения генов, участвующих в конкретном фенотипе, где каждый другой ген дополнительно выделяется дополнительной буквой. Эти лаковые гены , кодирующие ферменты являются LacZ , Лейси и Laca . Четвертый ген lac - lacI , кодирующий репрессор лактозы - «I» означает индуцируемость .

Можно различать структурные гены, кодирующие ферменты, и регуляторные гены, кодирующие белки, которые влияют на экспрессию генов. Текущее использование расширяет фенотипическую номенклатуру для применения к белкам: таким образом, LacZ является белковым продуктом гена lacZ , β-галактозидазы. Различные короткие последовательности, которые не являются генами также влияют на экспрессию генов, в том числе лакового промотора, лаковые р , и лаковый оператора, лаковые ö . Хотя это не является строго стандартным применением, мутация , влияющей на LAC O называется лаковыми о с , по историческим причинам.

Регламент [ править ]

Конкретный контроль генов lac зависит от доступности для бактерии лактозы- субстрата . Белки не производятся бактериями, когда лактоза недоступна в качестве источника углерода. Эти лаковые гены организованы в оперон ; то есть они ориентированы в одном и том же направлении, непосредственно примыкающем к хромосоме, и транскрибируются в единую полицистронную молекулу мРНК. Транскрипция всех генов начинается со связывания фермента РНК-полимеразы (RNAP), ДНК-связывающего белка , который связывается со специфическим участком связывания ДНК, промотором , непосредственно перед ним.генов. Связывание РНК - полимеразы с промотором облегчается с помощью цАМФ -связанного катаболитной белок - активатор (CAP, также известный как белок рецептора цАМФ). [4] Однако ген lacI (регуляторный ген для lac оперона) продуцирует белок, который блокирует связывание РНКП с оператором оперона. Этот белок может быть удален только тогда, когда аллолактоза связывается с ним и инактивирует его. Белок, который образуется геном lacI , известен как lac-репрессор. Тип регуляции, которому подвергается lac- оперон, называется отрицательно индуцибельным, что означает, что ген выключается регуляторным фактором ( lacрепрессор), если не добавлена ​​какая-либо молекула (лактоза). Из-за наличия белка-репрессора lac генные инженеры, заменяющие ген lacZ другим геном, должны будут выращивать экспериментальные бактерии на агаре с доступной на нем лактозой. В противном случае ген, который они пытаются экспрессировать, не будет экспрессироваться, поскольку белок-репрессор все еще блокирует связывание RNAP с промотором и транскрибирование гена. После удаления репрессора РНКП затем переходит к транскрипции всех трех генов ( lacZYA ) в мРНК. Каждый из трех генов в цепи мРНК имеет свою собственную последовательность Шайна-Далгарно , поэтому гены транслируются независимо. [5] Последовательность ДНК E. coli lacоперон , мРНК lacZYA и гены lacI доступны в GenBank (см.) .

Первый механизм контроля - это регуляторный ответ на лактозу, который использует внутриклеточный регуляторный белок, называемый репрессором лактозы, чтобы препятствовать выработке β-галактозидазы в отсутствие лактозы. Ген lacI , кодирующий репрессор, расположен рядом с lac- опероном и всегда экспрессируется ( конститутивно ). Если лактоза отсутствует в среде для выращивания, репрессор очень плотно связывается с короткой последовательностью ДНК сразу после промотора в начале lacZ, называемой оператором lac.. Связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНКП с промотором, и поэтому мРНК, кодирующая LacZ и LacY, создается только на очень низких уровнях. Однако, когда клетки растут в присутствии лактозы, метаболит лактозы, называемый аллолактозой, производимый из лактозы продуктом гена lacZ , связывается с репрессором, вызывая аллостерический сдвиг. Измененный таким образом репрессор не может связываться с оператором, позволяя RNAP транскрибировать гены lac и тем самым приводя к более высоким уровням кодируемых белков.

Второй механизм контроля - это ответ на глюкозу, который использует гомодимер белка-активатора катаболита (CAP) для значительного увеличения продукции β-галактозидазы в отсутствие глюкозы. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) представляет собой сигнальную молекулу, распространенность которой обратно пропорциональна уровню глюкозы. Он связывается с CAP, что, в свою очередь, позволяет CAP связываться с сайтом связывания CAP (последовательность ДНК длиной 16 п.н. перед промотором слева на диаграмме ниже, примерно на 60 п.н. выше сайта начала транскрипции) [6 ], который помогает RNAP связываться с ДНК. В отсутствие глюкозы концентрация цАМФ высока, и связывание ЦАП-цАМФ с ДНК значительно увеличивает производство β-галактозидазы, позволяя клеткегидролизуют лактозу и высвобождают галактозу и глюкозу.

Совсем недавно было показано, что исключение индукторов блокирует экспрессию lac- оперона при наличии глюкозы. Глюкоза транспортируется в клетку с помощью PEP-зависимой фосфотрансферазной системы . Фосфатная группа фосфоенолпирувата передается через каскад фосфорилирования, состоящий из общих белков PTS (фосфотрансферазной системы) HPr и EIA и глюкозоспецифических белков PTS EIIA Glc и EIIB Glc , цитоплазматического домена переносчика глюкозы EII. Транспорт глюкозы сопровождается ее фосфорилированием с помощью EIIB Glc , отводя фосфатную группу от других белков PTS, включая EIIA Glc . Нефосфорилированная форма EIIAGlc связывается с lac- пермеазой и предотвращает попадание лактозы в клетку. Следовательно, если присутствуют и глюкоза, и лактоза, транспорт глюкозы блокирует транспорт индуктора lac- оперона. [7]

Структура репрессора [ править ]

Тетрамерный LacI связывает две операторные последовательности и индуцирует образование петель ДНК. Каждая из двух димерных функциональных субъединиц LacI (красный + синий и зеленый + оранжевый) связывает последовательность оператора ДНК (помечена). Эти две функциональные субъединицы связаны в области тетрамеризации (помечены); таким образом, тетрамерный LacI связывает две операторные последовательности. Это позволяет тетрамерному LacI вызывать образование петель ДНК.

Лаковый репрессор это четыре части белок а, а тетрамеры с идентичными субъединица. Каждая субъединица содержит мотив спираль-поворот-спираль (HTH), способный связываться с ДНК. Сайт оператора, где связывается репрессор, представляет собой последовательность ДНК с инвертированной симметрией повтора. Два полусайта ДНК оператора вместе связываются с двумя субъединицами репрессора. Хотя две другие субъединицы репрессора ничего не делают в этой модели, это свойство не понималось в течение многих лет.

В конце концов было обнаружено, что еще два оператора участвуют в регуляции lac . [8] Один (O 3 ) расположен примерно на -90 п.н. выше O 1 в конце гена lacI , а другой (O 2 ) примерно на +410 п.н. ниже O 1 в ранней части lacZ . Эти два сайта не были обнаружены в ранних работах, потому что они имеют повторяющиеся функции, а отдельные мутации не сильно влияют на репрессию. Единичные мутации O 2 или O 3 имеют только 2-3-кратный эффект. Однако их важность демонстрируется тем фактом, что двойной мутант, дефектный как по O 2и O 3 резко подавлен (примерно в 70 раз).

В текущей модели lac- репрессор одновременно связан как с основным оператором O 1, так и с O 2 или O 3 . Промежуточная ДНК выходит из комплекса. Избыточный характер двух второстепенных операторов предполагает, что важен не конкретный зацикленный комплекс. Одна идея состоит в том, что система работает через модем; если связанный репрессор на мгновение высвобождается из O 1 , привязка к второстепенному оператору удерживает его поблизости, так что он может быстро восстановить связь. Это увеличило бы сродство репрессора к O 1 .

Механизм индукции [ править ]

1 : РНК-полимераза, 2 : репрессор, 3 : промотор, 4 : оператор, 5 : лактоза, 6 : lacZ, 7 : lacY, 8 : lacA. Вверху : Ген практически выключен. Аллолактозы, ингибирующей lac- репрессор, не существует, поэтому репрессор плотно связывается с оператором, что препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором, что приводит к отсутствиютранскриптов мРНК laczya . Нижний: Ген включен. Аллолактоза ингибирует репрессор, позволяя РНК-полимеразе связываться с промотором и экспрессировать гены, что приводит к продукции LacZYA. В конце концов, ферменты переваривают всю лактозу до тех пор, пока не останется аллолактоза, способная связываться с репрессором. Затем репрессор свяжется с оператором, останавливая транскрипцию генов LacZYA.

Репрессор - это аллостерический белок, т.е. он может принимать одну из двух слегка различных форм, находящихся в равновесии друг с другом. В одной форме репрессор будет связываться с ДНК оператора с высокой специфичностью, а в другой форме он потерял свою специфичность. Согласно классической модели индукции, связывание индуктора, аллолактозы или IPTG, с репрессором влияет на распределение репрессора между двумя формами. Таким образом, репрессор со связанным индуктором стабилизируется в конформации, не связывающейся с ДНК. Однако эта простая модель не может быть исчерпывающей, потому что репрессор довольно стабильно связан с ДНК, но он быстро высвобождается при добавлении индуктора. Следовательно, кажется очевидным, что индуктор также может связываться с репрессором, когда репрессор уже связан с ДНК. До сих пор не совсем известно, каков точный механизм связывания.[9]

Роль неспецифического связывания [ править ]

Неспецифическое связывание репрессора с ДНК играет решающую роль в репрессии и индукции Lac-оперона. Сайт специфического связывания белка-репрессора Lac является оператором. Неспецифическое взаимодействие опосредуется в основном зарядно-зарядовыми взаимодействиями, в то время как связывание с оператором усиливается гидрофобными взаимодействиями. Кроме того, существует множество неспецифических последовательностей ДНК, с которыми репрессор может связываться. По сути, любая последовательность, не являющаяся оператором, считается неспецифической. Исследования показали, что без наличия неспецифического связывания индукция (или нерепрессия) Lac-оперона не может происходить даже при насыщенных уровнях индуктора. Было продемонстрировано, что без неспецифического связывания базальный уровень индукции в десять тысяч раз меньше, чем обычно.Это связано с тем, что неспецифическая ДНК действует как своего рода «сток» для белков-репрессоров, отвлекая их от оператора. Неспецифические последовательности уменьшают количество доступного репрессора в клетке. Это, в свою очередь, уменьшает количество индуктора, необходимого для разжима системы.[10]

Аналоги лактозы [ править ]

IPTG
ONPG
X-gal
аллолактоза

Описан ряд производных или аналогов лактозы, которые полезны для работы с lac-опероном. Эти соединения в основном представляют собой замещенные галактозиды, в которых глюкозный фрагмент лактозы заменен другой химической группой.

  • Изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) часто используется в качестве индуктора lac- оперона при физиологической работе. [1] IPTG связывается с репрессором и инактивирует его, но не является субстратом для β-галактозидазы. Одним из преимуществ IPTG для исследований in vivo является то, что, поскольку он не может метаболизироваться E. coli, его концентрация остается постоянной, а скорость экспрессии генов, контролируемых lac p / o , не является переменной в эксперименте. Потребление IPTG зависит от действия лактозопермеазы у P. fluorescens , но не у E. coli . [11]
  • Фенил-β-D-галактоза (фенил-Гал) является субстратом для β-галактозидазы, но не инактивирует репрессор и, следовательно, не является индуктором. Поскольку клетки дикого типа продуцируют очень мало β-галактозидазы, они не могут расти на фенил-галле в качестве источника углерода и энергии. Мутанты, лишенные репрессора, способны расти на фенил-гале. Таким образом, минимальная среда, содержащая только фенил-Gal в качестве источника углерода и энергии, является селективной для мутантов-репрессоров и мутантов-операторов. Если 10 8 клеток штамма дикого типа высевают на чашки с агаром, содержащим фенил-Gal, редкие растущие колонии в основном являются спонтанными мутантами, влияющими на репрессор. Относительное распределение мутантов-репрессоров и операторов зависит от размера мишени. Поскольку ген lacI кодирующий репрессор примерно в 50 раз больше, чем оператор, мутанты репрессора преобладают в отборе.
  • Тиометилгалактозидаза [TMG] - еще один аналог лактозы. Они подавляют репрессор lacI. При низких концентрациях индуктора и TMG, и IPTG могут проникать в клетку через пермеазу лактозы. Однако при высоких концентрациях индуктора оба аналога могут проникать в клетку независимо. TMG может снижать скорость роста при высоких внеклеточных концентрациях. [12]
  • Другие соединения служат яркими индикаторами активности β-галактозидазы.
    • ONPG расщепляется с образованием ярко- желтого соединения, ортонитрофенола и галактозы, и обычно используется в качестве субстрата для анализа β-галактозидазы in vitro . [13]
    • Колонии, которые продуцируют β-галактозидазу, окрашиваются в синий цвет под действием X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид), который является искусственным субстратом для B-галактозидазы, расщепление которой приводит к образованию галактозы и 4-Cl , 3-Br индиго дает темно-синий цвет. [14]
  • Аллолактоза является изомером лактозы и индуктором лактозного оперона. Лактоза - это галактоза- (β1-> 4) -глюкоза, тогда как аллолактоза - это галактоза- (β1-> 6) -глюкоза. Лактоза превращается в аллолактозу β-галактозидазой в реакции, альтернативной гидролитической. Физиологический эксперимент, демонстрирующий роль LacZ в продукции «истинного» индуктора в клетках E. coli, представляет собой наблюдение, что нуль-мутант lacZ все еще может продуцировать пермеазу LacY при выращивании с IPTG, негидролизуемым аналогом аллолактозы, но не при выращивании с лактозой. Объяснение заключается в том, что преобразование лактозы в аллолактозу (катализируемое β-галактозидазой) необходимо для производства индуктора внутри клетки.

Разработка классической модели [ править ]

Экспериментальным микроорганизмом, использованным Франсуа Жакобом и Жаком Моно, была обычная лабораторная бактерия, E. coli , но многие из основных регуляторных концепций, которые были открыты Якобом и Моно, являются фундаментальными для клеточной регуляции во всех организмах. [15] Ключевая идея состоит в том, что белки не синтезируются, когда они не нужны - E. coli сохраняет клеточные ресурсы и энергию, не производя три белка Lac, когда нет необходимости метаболизировать лактозу, например, когда другие сахара, такие как глюкоза , имеется в наличии. В следующем разделе обсуждается, как кишечная палочкаконтролирует определенные гены в ответ на метаболические потребности.

Во время Второй мировой войны компания Monod тестировала эффекты комбинаций сахаров в качестве источников питательных веществ для E. coli и B. subtilis . Моно продолжил аналогичные исследования, которые были проведены другими учеными с бактериями и дрожжами. Он обнаружил, что бактерии, выращенные с двумя разными сахарами, часто демонстрируют две фазы роста. Например, если были предоставлены и глюкоза, и лактоза, сначала метаболизировалась глюкоза (фаза роста I, см. Рис. 2), а затем лактоза (фаза роста II). Лактоза не метаболизируется в течение первой части диауксической кривой роста, поскольку β-галактозидаза не образуется, когда в среде присутствуют как глюкоза, так и лактоза. Моно назвал это явление диаукси . [16]

Рисунок 2: «Двухфазная» кривая роста Моно

Затем Моно сосредоточил свое внимание на индукции образования β-галактозидазы, которая происходила, когда лактоза была единственным сахаром в культуральной среде. [17]

Классификация регуляторных мутантов [ править ]

Концептуальный прорыв Jacob и Monod [18] заключался в признании различия между регуляторными веществами и сайтами, в которых они действуют, изменяя экспрессию генов. Бывший солдат, Джейкоб использовал аналогию с бомбардировщиком, который выпускал смертоносный груз после получения специальной радиопередачи или сигнала. Для работы системы требуются как наземный передатчик, так и приемник в самолете. Теперь предположим, что обычный передатчик сломан. Эту систему можно заставить работать, введя второй работающий передатчик. Для сравнения, по его словам, рассмотрим бомбардировщик с неисправной ствольной коробкой. Поведение этого бомбардировщика не может быть изменено введением второго исправного самолета.

Чтобы проанализировать регуляторные мутанты оперона lac , Джейкоб разработал систему, с помощью которой вторая копия генов lac ( lacI с его промотором и lacZYA с промотором и оператором) могла быть введена в одну клетку. Культуру таких бактерий, которые являются диплоидными по генам lac, но в остальном нормальными, затем тестируют на предмет регуляторного фенотипа. В частности, определяется, образуются ли LacZ и LacY даже в отсутствие IPTG (из-за того, что репрессор лактозы, продуцируемый мутантным геном, нефункционален). Этот эксперимент, в котором гены или кластеры генов тестируются попарно, называется тестом комплементации .

Этот тест проиллюстрирован на рисунке ( lacA для простоты опущен). Во-первых, показаны определенные гаплоидные состояния (т. Е. Клетка несет только одну копию генов lac ). Панель (а) показывает репрессию, (b) показывает индукцию IPTG, и (c) и (d) показывают влияние мутации на ген lacI или на оператора, соответственно. На панели (е) показан тест комплементации для репрессора. Если одна копия генов lac несет мутацию в lacI , а вторая копия является диким типом для lacI , результирующий фенотип является нормальным, но lacZ экспрессируется при воздействии индуктора IPTG. Мутации, влияющие на репрессор, называются рецессивными.к дикому типу (и этот дикий тип является доминирующим ), и это объясняется тем фактом, что репрессор - это небольшой белок, который может диффундировать в клетке. Копия оперона lac, соседняя с дефектным геном lacI , эффективно блокируется белком, продуцируемым из второй копии lacI .

Если тот же эксперимент проводится с использованием мутации оператора, получается другой результат (панель (f)). Фенотип клетки, несущей один мутантный и один операторный сайт дикого типа, заключается в том, что LacZ и LacY продуцируются даже в отсутствие индуктора IPTG; поскольку поврежденный сайт оператора не позволяет связывать репрессор, чтобы ингибировать транскрипцию структурных генов. Операторная мутация является доминирующей. Когда сайт оператора, с которым должен связываться репрессор, поврежден мутацией, присутствие второго функционального сайта в той же клетке не влияет на экспрессию генов, контролируемых мутантным сайтом.

Более сложная версия этого эксперимента использует помеченные опероны, чтобы различать две копии генов lac и показать, что нерегулируемый структурный ген (ы) является (являются) одним (ами) рядом с мутантным оператором (панель (g). Например, предположим, что одна копия помечена мутацией, инактивирующей lacZ, так что она может продуцировать только белок LacY, в то время как вторая копия несет мутацию, влияющую на lacY, и может продуцировать только LacZ. В этой версии только копия оперона lac который находится рядом с мутантным оператором, выражается без IPTG. Мы говорим, что мутация оператора цис-доминантная, он является доминантным по отношению к дикому типу, но влияет только на копию оперона, непосредственно прилегающую к нему.

Это объяснение вводит в заблуждение в важном смысле, потому что оно исходит из описания эксперимента, а затем объясняет результаты в терминах модели. Но на самом деле часто бывает так, что модель на первом месте, и эксперимент проводится специально для проверки модели. Джейкоб и Моно сначала предположили, что в ДНК должен быть участок со свойствами оператора, а затем разработали свои тесты дополнения, чтобы показать это.

Доминирование мутантов-операторов также предполагает процедуру их особого отбора. Если регуляторные мутанты отбираются из культуры дикого типа с использованием фенил-Gal, как описано выше, операторные мутации редки по сравнению с мутантами-репрессорами, поскольку размер мишени настолько мал. Но если вместо этого мы начнем со штамма, который несет две копии всей области lac (то есть диплоид для lac ), репрессорные мутации (которые все еще происходят) не восстанавливаются, потому что комплементация вторым геном lacI дикого типа дает фенотип. Напротив, мутация одной копии оператора дает мутантный фенотип, потому что он доминирует над второй копией дикого типа.

Регулировка циклическим AMP [19] [ править ]

Объяснение diauxie зависело от характеристики дополнительных мутаций, затрагивающих lac- гены, помимо тех, которые объясняются классической моделью. Впоследствии были идентифицированы два других гена, cya и crp , которые картированы далеко от lac и которые при мутации приводят к снижению уровня экспрессии в присутствии IPTG и даже в штаммах бактерий, лишенных репрессора или оператора. Открытие цАМФ в E. coli привело к демонстрации того, что мутанты, дефектные по гену cya , но не по гену crp , могут быть восстановлены до полной активности путем добавления цАМФ в среду.

Ген cya кодирует аденилатциклазу, которая продуцирует цАМФ. У мутанта cya отсутствие цАМФ делает экспрессию генов lacZYA более чем в десять раз ниже, чем обычно. Добавление цАМФ корректирует низкую экспрессию Lac, характерную для мутантов cya . Второй ген, crp , кодирует белок, называемый белком- активатором катаболита (CAP) или белком рецептора цАМФ (CRP). [20]

Однако ферменты метаболизма лактозы производятся в небольших количествах в присутствии как глюкозы, так и лактозы (иногда называемой протекающей экспрессией) из-за того, что репрессор LacI быстро связывается / диссоциирует с ДНК, а не прочно связывается с ней, что может дать время для RNAP для связывания и транскрипции мРНК lacZYA . Утечка экспрессии необходима для того, чтобы обеспечить метаболизм некоторого количества лактозы после того, как источник глюкозы израсходован, но до того, как экспрессия lac полностью активируется.

В итоге:

  • Когда лактоза отсутствует, фермент Lac продуцируется очень мало (оператор связывает с ним репрессор Lac).
  • Когда присутствует лактоза, но также присутствует предпочтительный источник углерода (например, глюкоза), вырабатывается небольшое количество фермента (репрессор Lac не связан с оператором).
  • Когда глюкоза отсутствует, CAP-cAMP связывается со специфическим участком ДНК перед промотором и осуществляет прямое межбелковое взаимодействие с RNAP, что облегчает связывание RNAP с промотором.

Задержка между фазами роста отражает время, необходимое для выработки достаточного количества ферментов, метаболизирующих лактозу. Во-первых, регуляторный белок CAP должен собираться на промоторе lac , что приводит к увеличению продукции lac мРНК . Более доступные копии lac мРНК приводят к продукции (см. Перевод ) значительно большего количества копий LacZ (β-галактозидаза, для метаболизма лактозы) и LacY (пермеаза лактозы для транспортировки лактозы в клетку). После задержки, необходимой для повышения уровня ферментов, метаболизирующих лактозу, бактерии вступают в новую фазу быстрого роста клеток .

lac operon подробно

Две загадки катаболитной репрессии связаны с тем, как уровни цАМФ связаны с присутствием глюкозы, и, во-вторых, почему клетки должны вообще беспокоиться. После расщепления лактозы фактически образуется глюкоза и галактоза (легко превращаются в глюкозу). С точки зрения метаболизма, лактоза является таким же хорошим источником углерода и энергии, как и глюкоза. Уровень цАМФ связан не с внутриклеточной концентрацией глюкозы, а со скоростью транспорта глюкозы, которая влияет на активность аденилатциклазы. (Кроме того, транспорт глюкозы также ведет к прямому ингибированию пермеазы лактозы.) Что касается того, почему E. coliтак работает, можно только догадываться. Все кишечные бактерии ферментируют глюкозу, что говорит о том, что они часто с ней сталкиваются. Возможно, что небольшая разница в эффективности транспорта или метаболизма глюкозы по сравнению с лактозой позволяет клеткам таким образом регулировать lac- оперон. [21]

Использование в молекулярной биологии [ править ]

Ген lac и его производные можно использовать в качестве репортерного гена в ряде методов селекции на основе бактерий, таких как двухгибридный анализ, в котором необходимо определить успешное связывание активатора транскрипции с конкретной последовательностью промотора. [14] В чашках LB, содержащих X-gal , изменение цвета с белых колоний на оттенок синего соответствует примерно 20–100 единицам β-галактозидазы, в то время как лактоза тетразолия и лактозная среда MacConkey имеют диапазон 100–1000 единиц, т.е. наиболее чувствительны в верхней и нижней частях этого диапазона соответственно. [14]Поскольку лактозные и тетразолиевые лактозные среды MacConkey зависят от продуктов расщепления лактозы, они требуют присутствия генов lacZ и lacY . Таким образом, многие методы слияния лака , которые включают только ген lacZ , подходят для чашек с X-gal [14] или жидких бульонов ONPG . [22]

См. Также [ править ]

  • Катаболит репрессии

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Гриффитс, Энтони Дж. Ф.; Wessler, Susan R .; Кэрролл, Шон Б.; Добли, Джон (2015). Введение в генетический анализ (11-е изд.). Фриман, WH & Company. С. 400–412. ISBN 9781464109485.
  2. ^ МакКлин, Филипп (1997). «Экспрессия прокариотического гена» . ndsu.edu . Дата обращения 19 мая 2017 .
  3. ^ «Прокариотическая экспрессия гена» . ndsu.edu . Дата обращения 19 мая 2017 .
  4. ^ Басби С., Эбрайт Р. (2001). «Активация транскрипции белком-активатором катаболита (CAP)». J. Mol. Биол . 293 (2): 199–213. DOI : 10.1006 / jmbi.1999.3161 . PMID 10550204 . 
  5. ^ Кеннелл, Дэвид; Рицман, Ховард (июль 1977 г.). «Частоты инициации транскрипции и трансляции lac-оперона Escherichia coli». Журнал молекулярной биологии . 114 (1): 1–21. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (77) 90279-0 . PMID 409848 . 
  6. ^ Малан, Т. Филип; Колб, Энни; Бук, Анри; МакКлюр, Уильям (декабрь 1984 г.). «Механизм активации CRP-cAMP lac-оперона. Активация инициации транскрипции промотора P1». J. Mol. Биол . 180 (4): 881–909. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (84) 90262-6 . PMID 6098691 . 
  7. ^ Gorke B, Stülke J (август 2008). «Подавление катаболитов углерода в бактериях: множество способов максимально использовать питательные вещества». Обзоры природы. Микробиология . 6 (8): 613–24. DOI : 10.1038 / nrmicro1932 . PMID 18628769 . S2CID 8782171 .  
  8. ^ Oehler, S .; Eismann, ER; Krämer, H .; Мюллер-Хилл, Б. (1990). «Три оператора lac-оперона сотрудничают в репрессиях» . Журнал EMBO . 9 (4): 973–979. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1990.tb08199.x . PMC 551766 . PMID 2182324 .  
  9. ^ Гриффитс, Энтони JF; Гелбарт, Уильям М .; Миллер, Джеффри Х .; Левонтин, Ричард С. (1999). «Регулирование лактозной системы» . Современный генетический анализ . Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 0-7167-3118-5.
  10. ^ фон Хиппель, PH; Ревзин, А .; Гросс, Калифорния; Ван, AC (декабрь 1974 г.). «Неспецифическое связывание ДНК белков, регулирующих геном, как механизм биологического контроля: I. lac-оперон: аспекты равновесия» . PNAS . 71 (12): 4808–12. DOI : 10.1073 / pnas.71.12.4808 . PMC 433986 . PMID 4612528 .  
  11. ↑ Hansen LH, Knudsen S, Sørensen SJ (июнь 1998 г.). «Влияние гена lacY на индукцию индуцируемых IPTG промоторов, изучено на Escherichia coli и Pseudomonas fluorescens » . Curr. Microbiol . 36 (6): 341–7. DOI : 10.1007 / s002849900320 . PMID 9608745 . S2CID 22257399 . Архивировано из оригинального 18 октября 2000 года.  
  12. ^ Марбы A, Bettenbrock K (январь 2012). «Индукция lac-оперона в Escherichia coli: систематическое сравнение индукции IPTG и TMG и влияние трансацетилазы LacA». Журнал биотехнологии . 157 (1): 82–88. DOI : 10.1016 / j.jbiotec.2011.10.009 . PMID 22079752 . 
  13. ^ «Тест ONPG (β-галактозидаза)» . Сентябрь 2000 Архивировано из оригинала 3 ноября 2007 года . Проверено 25 октября 2007 года .
  14. ^ Б с д Joung Дж, Рамм Е, Pabo С (2000). «Бактериальная двухгибридная система отбора для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий» . Proc Natl Acad Sci USA . 97 (13): 7382–7. DOI : 10.1073 / pnas.110149297 . PMC 16554 . PMID 10852947 .  
  15. ^ «Веха 2 - пара дальновидных: вехи природы в экспрессии генов» . www.nature.com . Проверено 27 декабря 2015 года .
  16. Перейти ↑ Muller-Hill, Benno (1996). Лак-оперон, краткая история генетической парадигмы . Берлин: Вальтер де Грюйтер. С. 7–10. ISBN 3-11-014830-7.
  17. ^ Макнайт, Стивен Л. (1992). Транскрипционная регуляция . Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. С.  3–24 . ISBN 0-87969-410-6.
  18. ^ Джейкоб Ф .; Monod J (июнь 1961 г.). «Генетические механизмы регуляции синтеза белков». J Mol Biol . 3 (3): 318–56. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (61) 80072-7 . PMID 13718526 . 
  19. ^ Montminy, М. (1997). «Регуляция транскрипции циклическим АМФ». Ежегодный обзор биохимии . 66 : 807–822. DOI : 10.1146 / annurev.biochem.66.1.807 . ISSN 0066-4154 . PMID 9242925 .  
  20. ^ Ботсфорд, JL; Харман, Дж. Г. (март 1992 г.). «Циклический АМФ в прокариотах» . Микробиологические обзоры . 56 (1): 100–122. DOI : 10.1128 / MMBR.56.1.100-122.1992 . ISSN 0146-0749 . PMC 372856 . PMID 1315922 .   
  21. ^ Васкес А., Бег К.К., Деменезес М.А. и др. (2008). «Влияние ограничения емкости растворителя на метаболизм E. coli» . BMC Syst Biol . 2 : 7. DOI : 10,1186 / 1752-0509-2-7 . PMC 2270259 . PMID 18215292 .  
  22. ^ "Индукция lac оперона в кишечной палочке" (PDF) . SAPS . Проверено 29 июня +2016 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Lac + Operon в Национальной медицинской библиотеке США по предметным заголовкам по медицинским предметам (MeSH)
  • lac оперон на книжной полке NCBI [2]
  • Представляем коллекцию анимаций виртуальной клетки : Lac Operon
  • Лак-оперон: наука Бозмана
  • Окрашивание целых эмбрионов мыши на активность β-галактозидазы (lacZ)