Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Футболка с прозрачным сиреневым раствором.
Характерный цвет положительной биуретовой пробы

Тест биурета , также известный как тест Piotrowski в , является химический тест используется для обнаружения присутствия пептидных связей . В присутствии пептидов ион меди (II) образует в щелочном растворе координационные комплексы розовато-лилового цвета . [1] Было разработано несколько вариантов теста, таких как тест BCA и модифицированный тест Лоури. [2]

Биуретовую реакцию можно использовать для оценки концентрации белков, поскольку пептидные связи возникают с одинаковой частотой на аминокислоту в пептиде. Интенсивность цвета и, следовательно, поглощение при 540 нм прямо пропорциональны концентрации белка в соответствии с законом Бера-Ламберта .

Несмотря на свое название, реагент фактически не содержит биурета ((H 2 N-CO-) 2 NH). Тест назван так потому, что он также дает положительную реакцию на пептидоподобные связи в молекуле биурета.

В этом анализе медь (II) связывается с атомами азота, присутствующими в пептидах белков. Во вторичной реакции медь (II) восстанавливается до меди (I). Буферы, такие как трис и аммиак, мешают этому анализу, поэтому этот анализ не подходит для образцов белка, очищенных от осаждения сульфатом аммония. Из-за своей нечувствительности и небольшого влияния свободных аминокислот этот анализ наиболее полезен для образцов цельной ткани и других источников с высокой концентрацией белка. [3]

Процедура [ править ]

Водный образец обрабатывают равным объемом 1% сильного основания (гидроксид натрия или калия) с последующим добавлением нескольких капель водного сульфата меди (II) . Если раствор становится фиолетовым, он содержит белок. Можно определить 5–160 мг / мл . Пептиды с правильной длиной, по крайней мере, из 3 аминокислот необходимы для значительного, измеримого изменения цвета с этими реагентами. [4]

Реагент биурета [ править ]

Реагент биурета изготовлен из гидроксида натрия (NaOH) и гидратированные меди (II) сульфата , вместе с тартратом натрия калия , [5] последние из которых добавляют к хелат и таким образом стабилизировать ионы двухвалентных меди. Реакция ионов двухвалентной меди с атомами азота, участвующими в пептидных связях, приводит к смещению атомов водорода пептида в щелочных условиях. Три- или тетрадентатное хелатирование с азотом пептида дает характерный цвет. Это обнаружено с дипептидами. [6]

Реагент обычно используется в биуретовом анализе белка , колориметрическом тесте, используемом для определения концентрации белка с помощью УФ / видимой спектроскопии при длине волны 540 нм.

Варианты биуретовой пробы с высокой чувствительностью [ править ]

В современном колориметрическом анализе пептидов обычно применяются две основные модификации биуретового теста: анализ бицинхониновой кислоты (BCA) и анализ Лоури. В этих тестах Cu +, образующийся во время реакции биурета, вступает в реакцию с другими реагентами, что приводит к более глубокому цвету.

В тесте BCA Cu + образует темно-фиолетовый комплекс с бицинхониновой кислотой (BCA) [7], который поглощает около 562 нм, создавая характерный лиловый цвет. Водорастворимый комплекс BCA / медь абсорбируется намного сильнее, чем комплекс пептид / медь, повышая чувствительность биуретового теста примерно в 100 раз: анализ BCA позволяет обнаруживать белки в диапазоне от 0,0005 до 2 мг / мл. ). Кроме того, анализ белка BCA дает важное преимущество совместимости с такими веществами, как поверхностно-активные вещества до 5% в образцах белка.

В анализе белка Лоури Cu + снова окисляется до Cu 2+ с помощью Mo VI в реактиве Фолина-Чокальтеу , который образует молибденовый синий (Mo IV ). В этих условиях остатки тирозина в белке также образуют молибденовый синий. Таким образом, белки могут быть обнаружены в концентрациях от 0,005 до 2 мг / мл. [8] Молибденовый синий, в свою очередь, может связывать определенные органические красители, такие как малахитовый зеленый и аурамин O , что приводит к дальнейшему усилению сигнала. [9]

В Польше биуретовый тест также известен как тест Пиотровского в честь польского физиолога Густава Пиотровского (р. 1833 г.), который описал этот тест в 1857 г. [10]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Реакция впервые наблюдалась в 1833 году: Фердинанд Роуз (1833) «Uber die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden» (О соединениях альбумина с оксидами металлов), Poggendorfs Annalen der Physik und Chemie , vol. 104, стр 132-142, DOI : 10.1002 / andp.18331040512 . Он был независимо повторно открыт в 1857 году польским физиологом: Г. Пиотровским (1857) «Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge» (Новая реакция белков и их родственных производных) Sitzungsberichte der Kaiserliche Akademie der Wissenschaften in- Wissenschaften naturwissenschaftliche Classe (Труды Императорской философской академии в Вене, секция математических и естественных наук), vol. 24, страницы 335-337.
  2. ^ Библиотека методов анализа белков Thermo Scientific «Химия протеина». http://www.piercenet.com
  3. ↑ Нинфа, Александр; Баллоу, Дэвид; Бенор, Марили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Вайли. п. 111. ISBN 978-0470087664.
  4. ^ Фенк, CJ; Кауфман, Н .; и Gerbig, DGJ Chem. Educ. 2007, 84, 1676–1678.
  5. ^ «Химические реактивы» . Архивировано из оригинала на 2010-02-13 . Проверено 30 января 2010 .
  6. ^ Датта, ИП; Леберман, Р .; Рабин Б.Р. (1959). «Хелатирование ионов металлов дипептидами и родственными веществами. Часть 5. Медные комплексы саркозильных и лейцильных лигандов» . Пер. Faraday Soc . 55 : 2141–2151. DOI : 10.1039 / TF9595502141 . ISSN 0014-7672 . 
  7. ^ Смит, ПК и др.: Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Анальный. Биохим. 150 (1985) 76-85.
  8. ^ OH Lowry, NJ Rosebrough, AL Farr, RJ Randall: Измерение белка с помощью реагента Folin Phenol, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265 - 275.
  9. ^ Сарджент, MG: Пятидесятикратное усиление анализа белка Лоури. Анальный. Биохим. 163 (1987) 476-481.
  10. ^ Д-р Г. фон Пиотровски (1857). "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge" . Sitzungsberichte der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Classe . 24 : 335-337.

Внешние ссылки и примечания [ править ]

  • Золото. 1990. Органические соединения в биологических системах, 2-е изд. John Wiley & Sons, Inc.
  • Химические реагенты