Конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия , наиболее часто конфокальные лазерная сканирующая микроскопия ( CLSM ) или лазерная конфокальная сканирующая микроскопия ( ЛКСМ ), представляет собой оптический метод визуализации для увеличения оптического разрешения и контраста в виде микрофотографии с помощью с помощью пространственного крошечного отверстия , чтобы блокировать фокус света в формировании имиджа. [1] Получение нескольких двумерных изображений на разной глубине в образце позволяет реконструировать трехмерные структуры (процесс, известный как оптическое сечение) внутри объекта. Этот метод широко используется в научных и промышленных кругах, а типичное применение - в науках о жизни , контроле полупроводников и материаловедении .

Конфокальная микроскопия
MeSHD018613
Код ОПС-3013-301
"> Файл: Люминесцентные и конфокальные микроскопы.ogvВоспроизвести медиа
Принцип работы флуоресцентного и конфокального микроскопов

Свет проходит через образец под обычным микроскопом настолько глубоко в образец, насколько он может проникнуть, в то время как конфокальный микроскоп фокусирует только меньший луч света на одном узком уровне глубины за раз. CLSM обеспечивает контролируемую и сильно ограниченную глубину резкости .

Принцип сенсора конфокальной точки из патента Мински
Слитый белок GFP экспрессируется в Nicotiana benthamiana . Флуоресценция видна с помощью конфокальной микроскопии.

Принцип конфокальной визуализации был запатентован в 1957 году Марвином Мински [2] и направлен на преодоление некоторых ограничений традиционных широкопольных флуоресцентных микроскопов . [3] В обычном (т.е. широкопольном) флуоресцентном микроскопе весь образец равномерно залит светом от источника света. Все части образца могут быть возбуждены одновременно, и результирующая флуоресценция обнаруживается фотодетектором или камерой микроскопа, включая большую несфокусированную часть фона. В отличие от этого, конфокальный микроскоп использует точечное освещение (см. Раздел «Функция рассеивания точки» ) и точечное отверстие в оптически сопряженной плоскости перед детектором для устранения сигнала не в фокусе - от этой конфигурации происходит название «конфокальный». Поскольку можно обнаружить только свет, производимый флуоресценцией очень близко к фокальной плоскости , оптическое разрешение изображения , особенно в направлении глубины образца, намного лучше, чем у широкопольных микроскопов. Однако, поскольку большая часть света от флуоресценции образца блокируется на отверстии, это повышенное разрешение достигается за счет снижения интенсивности сигнала - поэтому часто требуются длительные экспозиции . Чтобы компенсировать это падение сигнала после точечного отверстия , интенсивность света определяется чувствительным детектором, обычно фотоумножителем (ФЭУ) или лавинным фотодиодом , преобразующим световой сигнал в электрический. [4]

Поскольку одновременно освещается только одна точка в образце, для получения двухмерных или трехмерных изображений требуется сканирование по обычному растру (т. Е. По прямоугольному шаблону с параллельными линиями сканирования) в образце. Луч сканируется по образцу в горизонтальной плоскости с помощью одного или нескольких ( сервоуправляемых ) колеблющихся зеркал. Этот метод сканирования обычно имеет низкую задержку реакции, и скорость сканирования можно варьировать. Более медленное сканирование обеспечивает лучшее отношение сигнал / шум , что приводит к лучшему контрасту .

Достижима толщина фокальной плоскости определяется главным образом от длины волны используемого света , деленной на числовой апертуры этого объектива , но и оптических свойств образца. Возможность тонкого оптического сечения делает эти типы микроскопов особенно хорошими для получения трехмерных изображений и профилирования поверхности образцов.

Последовательные срезы составляют «z-стек», который можно либо обработать для создания трехмерного изображения, либо объединить в двухмерный стек (в основном берется максимальная интенсивность пикселей, другие распространенные методы включают использование стандартного отклонения или суммирование пикселей). [1]

Конфокальная микроскопия обеспечивает возможность прямого, неинвазивного, серийного оптического сечения неповрежденных, толстых, живых образцов с минимальной подготовкой образцов, а также незначительное улучшение латерального разрешения по сравнению с широкопольной микроскопией. [4] Биологические образцы часто обрабатывают флуоресцентными красителями, чтобы сделать видимыми выбранные объекты. Однако фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы минимизировать нарушение биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные флуоресцентные молекулы. Кроме того, трансгенные методы могут создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные химерные молекулы (например, слияние GFP, зеленого флуоресцентного белка с интересующим белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (дифракционно ограниченное пятно) и точечного обнаружения результирующего флуоресцентного сигнала. Точечное отверстие в детекторе обеспечивает физический барьер, который блокирует расфокусированную флуоресценцию. Записывается только сфокусированная или центральная точка диска Эйри . Растровое сканирование образца по одной точке позволяет собирать тонкие оптические срезы простым изменением z-фокуса. Полученные изображения можно сложить, чтобы получить трехмерное изображение образца.

На этом конфокальном изображении, сделанном на установке световой микроскопии EMBL , показана группа диатомовых водорослей с голубыми клеточными стенками, красными хлоропластами, синей ДНК и зелеными мембранами и органеллами.

Коммерчески доступны четыре типа конфокальных микроскопов:

Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы используют несколько зеркал (обычно 2 или 3 сканирующих линейно по осям x и y) для сканирования лазером по образцу и «десканирования» изображения по фиксированному отверстию и детектору.

Конфокальные микроскопы с вращающимся диском ( диск Нипкова ) используют серию движущихся отверстий на диске для сканирования световых пятен. Поскольку серия точечных отверстий сканирует область параллельно, каждому точечному отверстию позволяют парить над определенной областью в течение более длительного периода времени, тем самым уменьшая энергию возбуждения, необходимую для освещения образца, по сравнению с лазерными сканирующими микроскопами. Пониженная энергия возбуждения снижает фототоксичность и фотообесцвечивание образца, что часто делает его предпочтительной системой для визуализации живых клеток или организмов.

Конфокальные микроскопы с микролинзой или двойным вращающимся диском работают по тем же принципам, что и конфокальные микроскопы с вращающимся диском, за исключением того, что второй вращающийся диск, содержащий микролинзы, помещается перед вращающимся диском, содержащим микроотверстия. С каждым отверстием связана микролинза. Микролинзы захватывают широкую полосу света и фокусируют его в каждое точечное отверстие, значительно увеличивая количество света, направляемого в каждое точечное отверстие, и уменьшая количество света, блокируемого вращающимся диском. Конфокальные микроскопы, усиленные микролинзами, поэтому значительно более чувствительны, чем стандартные системы с вращающимся диском. Компания Yokogawa Electric изобрела эту технологию в 1992 году. [5]

Микроскопы с программируемой матрицей (PAM) используют пространственный модулятор света (SLM) с электронным управлением, который создает набор движущихся точечных отверстий. SLM - это устройство, содержащее массив пикселей с некоторыми свойствами ( непрозрачность , отражательная способность или оптическое вращение ) отдельных пикселей, которые можно регулировать электронным способом. SLM содержит микроэлектромеханические зеркала или жидкокристаллические компоненты. Изображение обычно получается камерой с зарядовой связью (ПЗС).

Каждый из этих классов конфокальных микроскопов имеет свои преимущества и недостатки. Большинство систем либо оптимизированы для скорости записи (например, захвата видео), либо для высокого пространственного разрешения. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы могут иметь программируемую плотность выборки и очень высокое разрешение, в то время как Nipkow и PAM используют фиксированную плотность выборки, определяемую разрешением камеры. Формирования изображения частота кадров , как правило , медленнее для одиночных точечных лазерных сканирующих систем , чем прядильные-диск или PAM систем. Коммерческие конфокальные микроскопы с вращающимся диском обеспечивают частоту кадров более 50 в секунду [6], что является желательной функцией для динамических наблюдений, таких как визуализация живых клеток.

На практике Nipkow и PAM позволяют сканировать несколько отверстий параллельно одной и той же области [7], если отверстия находятся на достаточно большом расстоянии друг от друга.

Передовые разработки конфокальной лазерной сканирующей микроскопии теперь позволяют получать изображения с более высокой, чем при стандартной скорости видео (60 кадров в секунду) изображениями, используя несколько микроэлектромеханических сканирующих зеркал.

Конфокальная рентгенофлуоресцентная визуализация - это новый метод, который позволяет контролировать глубину в дополнение к горизонтальному и вертикальному наведению, например, при анализе скрытых слоев на картине. [8]

CLSM - это метод сканирования изображений, при котором полученное разрешение лучше всего объясняется путем сравнения его с другим методом сканирования, таким как сканирующий электронный микроскоп (SEM). CLSM имеет то преимущество, что не требует подвешивания зонда на несколько нанометров от поверхности, как, например, в AFM или STM , где изображение получается путем сканирования поверхности с помощью тонкого наконечника. Расстояние от линзы объектива до поверхности (так называемое рабочее расстояние ) обычно сравнимо с расстоянием в обычном оптическом микроскопе. Это зависит от оптической конструкции системы, но типичное рабочее расстояние составляет от сотен микрометров до нескольких миллиметров.

В CLSM образец освещается точечным лазерным источником, и каждый элемент объема связан с дискретной интенсивностью рассеяния или флуоресценции. Здесь размер сканируемого объема определяется размером пятна (близким к дифракционному пределу) оптической системы, поскольку изображение сканирующего лазера представляет собой не бесконечно маленькую точку, а трехмерную дифракционную картину. Размер этой дифракционной картины и определяемый ею фокусный объем контролируются числовой апертурой линзы объектива системы и длиной волны используемого лазера. Это можно рассматривать как классический предел разрешения обычных оптических микроскопов, использующих широкопольное освещение. Однако с помощью конфокальной микроскопии можно даже улучшить предел разрешения методов широкопольного освещения, поскольку конфокальная апертура может быть закрыта для устранения дифракционной картины более высоких порядков [ необходима цитата ] . Например, если диаметр точечного отверстия установлен на 1 единицу Эйри, то дифракционная картина первого порядка проходит через апертуру к детектору, в то время как более высокие порядки блокируются, что улучшает разрешение за счет небольшого уменьшения яркости. При флуоресцентных наблюдениях предел разрешения конфокальной микроскопии часто ограничивается отношением сигнал / шум, вызванным небольшим количеством фотонов, обычно доступных в флуоресцентной микроскопии. Компенсировать этот эффект можно, используя более чувствительные фотоприемники или увеличивая интенсивность точечного источника лазерного излучения. Увеличение интенсивности освещения лазером может привести к чрезмерному обесцвечиванию или другому повреждению исследуемого образца, особенно для экспериментов, в которых требуется сравнение яркости флуоресценции. При визуализации тканей с дифференциальной рефракцией, таких как губчатый мезофилл листьев растений или другие ткани, содержащие воздушное пространство, часто проявляются сферические аберрации, ухудшающие качество конфокального изображения. Однако такие аберрации можно значительно уменьшить, помещая образцы в оптически прозрачные, нетоксичные перфторуглероды, такие как перфтордекалин , который легко проникает в ткани и имеет показатель преломления, почти идентичный показателю преломления воды. [9]

CLSM широко используется во многих биологических научных дисциплин, от клеточной биологии и генетики в области микробиологии и биологии развития . [10] Он также используется в квантовой оптике, формировании изображений нанокристаллов и спектроскопии.

Биология и медицина

Пример стопки изображений конфокального микроскопа, показывающих распределение актиновых филаментов по клетке.

Клинически CLSM используется для оценки различных заболеваний глаз и особенно полезен для визуализации, качественного анализа и количественного определения эндотелиальных клеток роговицы . [11] Он используется для локализации и идентификации присутствия нитчатых грибковых элементов в строме роговицы в случаях кератомикоза , что позволяет быстро диагностировать и, таким образом, рано начать окончательную терапию. Перспективными являются исследования методов CLSM для эндоскопических процедур ( эндомикроскопия ). [12] В фармацевтической промышленности рекомендуется следить за процессом производства тонкопленочных фармацевтических форм, чтобы контролировать качество и равномерность распределения лекарств. [13] Конфокальная микроскопия также используется для изучения биопленок - сложных пористых структур, которые являются предпочтительной средой обитания микроорганизмов. Некоторые временные и пространственные функции биопленок можно понять, только изучив их структуру на микро- и мезомасштабах. Исследование на микроуровне необходимо для выявления активности и организации отдельных микроорганизмов. [14]

Оптика и кристаллография

CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых трехмерных оптических системах хранения данных и помогла определить возраст папируса Магдалины .

Сохранение аудио

Система IRENE использует конфокальную микроскопию для оптического сканирования и восстановления поврежденного исторического аудио. [15]

Улучшение осевого разрешения

Функция рассеяния точки для микроотверстия представляет собой эллипсоид, длина которого в несколько раз превышает его ширину. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Одним из способов преодоления этого является микроскопия 4Pi, при которой падающий и / или испускаемый свет может мешать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативный метод - конфокальная тета-микроскопия . В этой технике конус освещающего света и обнаруживаемый свет расположены под углом друг к другу (лучший результат, когда они перпендикулярны). Пересечение двух функций рассеяния точки дает гораздо меньший эффективный объем выборки. На основе этого появился микроскоп с одноплоскостной подсветкой . Дополнительно можно использовать деконволюцию , используя экспериментально полученную функцию рассеяния точки, чтобы удалить не в фокусе свет, улучшая контраст как в осевой, так и в боковой плоскостях.

Супер разрешение

Существуют конфокальные варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как микроскопия истощения с использованием стимулированного излучения (STED). Помимо этого метода , доступен широкий спектр других (не основанных на конфокальной основе) методов сверхвысокого разрешения , таких как PALM, (d) STORM, SIM и т. Д. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость в специальном оборудовании, буферах или флуорофорах.

Работоспособность при низких температурах

Для получения изображений образцов при низких температурах использовались два основных подхода, основанные на архитектуре лазерной сканирующей конфокальной микроскопии . Один из подходов заключается в использовании криостата с непрерывным потоком : только образец имеет низкую температуру, и к нему оптически обращаются через прозрачное окно. [16] Другой возможный подход состоит в том, чтобы иметь часть оптики (особенно объектив микроскопа) в криогенном хранилище Дьюара . [17] Этот второй подход, хотя и более громоздкий, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из-за окна.

  • β-тубулин у Tetrahymena (мерцательное простейшее ).

  • Частичный профиль поверхности монеты номиналом 1 евро, измеренный с помощью дискового конфокального микроскопа Нипкова.

  • Данные отражения для монеты номиналом 1 евро.

  • Цветное изображение актиновых филаментов в раковой клетке.

  • Зеленый сигнал от антитела к тубулину, конъюгированного с Alexa Fluor 488) и ядер (синий сигнал от ДНК, окрашенной DAPI) в клетках корневой меристемы 4-дневного возраста Arabidopsis thaliana (Col-0). Шкала шкалы: 5 мкм.

Начало: 1940–1957 гг.

Схема из патентной заявки Мински, показывающая принцип работы конфокального сканирующего микроскопа, который он построил.

В 1940 году офтальмолог из Берна , Швейцария, Ганс Гольдманн разработал систему щелевой лампы для документирования результатов обследования глаз. [18] Эта система рассматривается некоторыми более поздними авторами как первая конфокальная оптическая система. [19] [20]

В 1943 году Зюн Коана опубликовал конфокальную систему. [21] [19] На рисунке в этой публикации показан путь конфокального передающего луча.

В 1951 году Хирото Наора, коллега Коаны, описал конфокальный микроскоп в журнале Science для спектрофотометрии . [22]

Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Марвином Мински в 1955 году, а патент был подан в 1957 году. Сканирование точки освещения в фокальной плоскости осуществлялось перемещением предметного столика. Никаких научных публикаций представлено не было, изображения, сделанные с их помощью, не сохранились. [23] [24]

Сканирующий микроскоп-тандем

Схема тандемного сканирующего микроскопа Петра. Красная полоса добавлена ​​для обозначения Nipkow-Disk.

В 1960-х годах чехословацкий Моймир Петрад с медицинского факультета Карлова университета в Пльзене разработал тандемный сканирующий микроскоп, первый коммерческий конфокальный микроскоп. Он был продан небольшой компанией в Чехословакии и в Соединенных Штатах компанией Tracor-Northern (позже Noran) и использовал вращающийся диск Нипкова для создания множественных точечных отверстий возбуждения и излучения. [20] [25]

Чехословацкий патент был подан в 1966 году Петраем и Миланом Хадравски, чехословацкими коллегами. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученными с помощью этого микроскопа, была опубликована в журнале Science в 1967 году под авторством М. Дэвида Эггера из Йельского университета и Петраша. [26] В качестве сноски к этой статье упоминается, что Петрад сконструировал микроскоп и руководил его конструкцией, и что он был отчасти «научным сотрудником» Йельского университета. Во второй публикации 1968 года описывалась теория и технические детали инструмента , а дополнительными авторами были Хадравски и Роберт Галамбос , глава группы в Йельском университете. [27] В 1970 году был получен патент США. Он был подан в 1967 году. [28]

1969: Первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.

В 1969 и 1971 годах М. Дэвид Эггер и Пол Давидовиц из Йельского университета опубликовали две статьи, описывающие первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. [29] [30] Это был точечный сканер, то есть генерировалось только одно пятно освещения. Он использовал микроскопию эпи-освещения-отражения для наблюдения за нервной тканью. Гелий-неоновый лазер мощностью 5 мВт с длиной волны 633 нм отражался полупрозрачным зеркалом в сторону объектива. Объектив представлял собой простую линзу с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличие от всех более ранних и более поздних систем, образец сканировался путем движения этой линзы (сканирование объектива), что приводило к перемещению фокальной точки. Отраженный свет возвращался к полупрозрачному зеркалу, прошедшая часть фокусировалась другой линзой на точечное отверстие детектирования, за которым помещалась трубка фотоумножителя. Сигнал визуализировался на ЭЛТ осциллографа, катодный луч перемещался одновременно с объективом. Специальное устройство позволяло делать фотографии Polaroid , три из которых были показаны в публикации 1971 года.

Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований in vivo . Они цитируют патент Мински, благодарят Стива Бэра, в то время докторанта Медицинской школы Альберта Эйнштейна в Нью-Йорке, где он разработал конфокальный линейный сканирующий микроскоп [31], за предложение использовать лазер с «микроскопом Мински» и поблагодарить Галамбоса, Хадравского и Петра за обсуждения, приведшие к разработке их микроскопа. Мотивация для их разработки заключалась в том, что в тандемном сканирующем микроскопе только часть 10 -7 освещаемого света участвует в создании изображения в окуляре. Таким образом, качество изображения было недостаточным для большинства биологических исследований. [19] [32]

1977–1985: Точечные сканеры с лазерами и сценическим сканированием.

В 1977 году Колин Дж. Р. Шеппард и Амарджиоти Чоудхури , Оксфорд , Великобритания, опубликовали теоретический анализ конфокальных и лазерных сканирующих микроскопов. [33] Вероятно, это первая публикация, в которой используется термин «конфокальный микроскоп». [19] [32]

В 1978 году братья Кристоф Кремер и Томас Кремер опубликовали проект конфокального лазерного сканирующего микроскопа, использующего флуоресцентное возбуждение с электронным автофокусом. Они также предложили лазерное точечное освещение с помощью «4π-точечной голограммы ». [32] [34] Эта конструкция CLSM впервые объединила метод лазерного сканирования с трехмерным обнаружением биологических объектов, помеченных флуоресцентными маркерами .

В 1978 и 1980 годах оксфордская группа Колина Шеппарда и Тони Уилсона описала конфокальный микроскоп с эпи-лазерным освещением, сканирующим столиком и фотоумножителями в качестве детекторов. Столик мог перемещаться по оптической оси (оси z), что позволяло производить оптические последовательные секции. [32]

В 1979 году Фред Бракенхофф и его коллеги продемонстрировали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимы на практике. В 1985 году эта группа стала первой, кто опубликовал убедительные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, которые смогли ответить на биологические вопросы. [35] Вскоре после этого многие другие группы начали использовать конфокальную микроскопию для ответа на научные вопросы, которые до этого оставались загадкой из-за технологических ограничений.

В 1983 году Ай Джей Кокс и К. Шеппард из Оксфорда опубликовали первую работу, в которой конфокальный микроскоп управлялся компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, столик-сканер SOM-25, был предложен Oxford Optoelectronics (после нескольких поглощений, приобретенных BioRad), начиная с 1982 года. Он был основан на дизайне оксфордской группы. [20] [36]

С 1985 года: лазерные точечные сканеры со сканированием луча.

В середине 1980-х Уильям Брэдшоу Амос и Джон Грэм Уайт и его коллеги, работающие в Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже, создали первый сканирующий микроскоп с конфокальным лучом. [37] [38] Столик с образцом не двигался, вместо этого было пятно освещения, что позволяло получать изображения быстрее: четыре изображения в секунду по 512 строк в каждом. Сильно увеличенные промежуточные изображения благодаря длине пути луча 1-2 метра позволили использовать обычную ирисовую диафрагму в качестве «точечного отверстия» с диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были сделаны с длительной выдержкой на пленке до того, как была добавлена ​​цифровая камера. Дальнейшее улучшение позволило впервые увеличить масштаб подготовки. Zeiss , Leitz и Cambridge Instruments не интересовались коммерческим производством. [39] Совет медицинских исследований (MRC) наконец спонсировал разработку прототипа. Дизайн был приобретен компанией Bio-Rad , изменен с помощью компьютерного управления и выпущен на рынок под названием «MRC 500». Преемник MRC 600 позже стал основой для разработки первого двухфотонно-флуоресцентного микроскопа, разработанного в 1990 году в Корнельском университете . [35]

Разработки в Королевском технологическом институте KTH в Стокгольме примерно в то же время привели к созданию коммерческого CLSM, распространяемого шведской компанией Sarastro. [40] Предприятие было приобретено в 1990 году компанией Molecular Dynamics [41], но в конечном итоге производство CLSM было прекращено. В Германии компания Heidelberg Instruments , основанная в 1984 году, разработала CLSM, которая изначально предназначалась для промышленных приложений, а не для биологии. Этот прибор был приобретен в 1990 году компанией Leica Lasertechnik . Компания Zeiss уже представила на рынке неконфокальный лазерный сканирующий микроскоп для определения летающего пятна, который был модернизирован до конфокального. В отчете 1990 г. [42] упоминаются некоторые производители конфокальных линз: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern и Zeiss. [35]

В 1989 году Фриц Карл Прейкшат вместе с сыном Экхардом Прейкшатом изобрели сканирующий лазерный диодный микроскоп для анализа размеров частиц. [43] [44] Он и Экхард Прейкшат стали соучредителями Lasentec для его коммерциализации. В 2001 году Lasentec была приобретена Mettler Toledo . [45] Они используются в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля процесса кристаллизации на месте в больших системах очистки.

  • Спектроскопия модуляции заряда
  • Деконволюция
  • Флуоресцентный микроскоп
  • Сфокусированный ионный пучок
  • Наложение фокуса
  • Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
  • Визуализация живых клеток
  • Объектив микроскопа
  • Предметное стекло микроскопа
  • Оптический микроскоп
  • Оптическое сечение
  • Фотоприемник
  • Функция разброса точки
  • Микроскоп истощения с вынужденным излучением
  • Микроскопия сверхвысокого разрешения
  • Флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF)
  • Микроскопия с двухфотонным возбуждением : хотя они используют родственную технологию (оба являются лазерными сканирующими микроскопами), многофотонные флуоресцентные микроскопы не являются строго конфокальными микроскопами. Термин конфокальный возникает из-за наличия диафрагмы в сопряженной фокальной плоскости (конфокальной). В многофотонных микроскопах эта диафрагма обычно отсутствует.

  1. ^ a b Pawley JB (редактор) (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). Берлин: Springer. ISBN 0-387-25921-X.CS1 maint: дополнительный текст: список авторов ( ссылка )
  2. ^ Поданный в 1957 году и получил 1961. США 3013467 
  3. ↑ Воспоминания об изобретении конфокального сканирующего микроскопа , Scanning 10 (1988), pp128–138.
  4. ^ а б Fellers TJ, Дэвидсон MW (2007). «Введение в конфокальную микроскопию» . Ресурсный центр Olympus Fluoview . Национальная лаборатория сильного магнитного поля . Проверено 25 июля 2007 .
  5. ^ «Аналитика для патента США № 5162941, Конфокальный микроскоп» .
  6. ^ "Технические данные конфокального микроскопа белого света NanoFocus µsurf с вращающимся диском" . Архивировано из оригинала на 2014-01-20 . Проверено 14 августа 2013 .
  7. ^ «Технические данные сенсорной головки Sensofar 'PLu neox' Dual, объединяющей конфокальную и интерферометрическую методы, а также спектроскопическую рефлектометрию» .
  8. ^ Винце Л. (2005). «Конфокальная рентгеновская флуоресцентная визуализация и рентгенофлуоресцентная томография для трехмерного микроанализа микроэлементов» . Микроскопия и микроанализ . 11 (Приложение 2). DOI : 10.1017 / S1431927605503167 .
  9. ^ Литтлджон, Джордж Р .; Gouveia, João D .; Эднер, Кристоф; Смирнов, Николай; С любовью, Джон (2010). «Перфтордекалин повышает разрешение мезофилла Arabidopsis thaliana in vivo при конфокальной микроскопии». Новый фитолог . 186 (4): 1018–1025. DOI : 10.1111 / j.1469-8137.2010.03244.x . ЛВП : 10026,1 / 9344 . ISSN  1469-8137 . PMID  20374500 .
  10. ^ Хуан Карлос Штокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). "Глава 6 Флуоресцентные приборы и методы" . Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. С. 180–184. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 года .
  11. ^ Патель Д.В., МакГи К.Н. (2007). «Современная конфокальная микроскопия in vivo роговицы живого человека с использованием белого света и методов лазерного сканирования: большой обзор». Clin. Экспериментируйте. Офтальмол . 35 (1): 71–88. DOI : 10.1111 / j.1442-9071.2007.01423.x . PMID  17300580 . S2CID  23029612 .
  12. ^ Hoffman A, Goetz M, Vieth M, Galle PR, Neurath MF, Kiesslich R (2006). «Конфокальная лазерная эндомикроскопия: техническое состояние и текущие показания». Эндоскопия . 38 (12): 1275–83. DOI : 10,1055 / с-2006-944813 . PMID  17163333 .
  13. ^ Le Person, S .; Пуиггали, младший; Барон, М .; Рокес, М. (1998). «Сушка в ближнем инфракрасном диапазоне фармацевтических тонких пленок: экспериментальный анализ внутреннего массопереноса». Химическая инженерия и переработка: интенсификация процессов . 37 (3): 257–263. DOI : 10.1016 / S0255-2701 (98) 00032-4 .
  14. ^ Гитис, Виталий; Ротенберг, Гади (2020). Гитис, Виталий; Ротенберг, Гади (ред.). Справочник по пористым материалам . Сингапур: World Scientific. С. 63–64. DOI : 10.1142 / 11909 . ISBN 978-981-122-322-8.
  15. ^ Процесс оцифровки . Проект IRENE, Калифорнийский университет, библиотеки Беркли .
  16. ^ Hirschfeld, V .; Хабнер, CG (2010). «Чувствительный и универсальный лазерный сканирующий конфокальный оптический микроскоп для флуоресценции одиночных молекул при 77 К». Обзор научных инструментов . 81 (11): 113705–113705–7. Bibcode : 2010RScI ... 81k3705H . DOI : 10.1063 / 1.3499260 . PMID  21133476 .
  17. ^ Grazioso, F .; Паттон, Бразилия; Смит, JM (2010). «Конфокальный оптический микроскоп со сканирующим лучом высокой стабильности для работы при низких температурах». Обзор научных инструментов . 81 (9): 093705–4. Bibcode : 2010RScI ... 81i3705G . DOI : 10.1063 / 1.3484140 . PMID  20886985 .
  18. ^ Ганс Гольдманн (1939). "Spaltlampenphotographie und –photometrie". Ophthalmologica . 98 (5/6): 257–270. DOI : 10.1159 / 000299716 . Примечание: 98-й том относится к 1939 году, однако на первой странице статьи январь 1940 года указан как дата публикации.
  19. ^ а б в г Колин Дж. Р. Шеппард (3 ноября 2009 г.). «Конфокальная микроскопия. Развитие современной микроскопии». Визуализация и микроскопия .онлайн
  20. ^ a b c Барри Р. Мастерс: конфокальная микроскопия и микроскопия с многофотонным возбуждением. Генезис визуализации живых клеток. SPIE Press, Беллингем, Вашингтон, США, 2006 г., ISBN  978-0-8194-6118-6 , С. 120-121.
  21. ^ Зюн Коана (1942). Журнал Института светотехники . 26 (8): 371–385. Отсутствует или пусто |title=( справка ) Статья размещена на сайте журнала . PDF-файл с пометкой «P359 - 402» имеет размер 19020 килобайт и содержит также соседние статьи из того же номера. На рисунке 1б статьи показана схема конфокального тракта прохождения луча.
  22. ^ Наора, Хирото (1951). «Микроспектрофотометрия и цитохимический анализ нуклеиновых кислот». Наука . 114 (2959): 279–280. Bibcode : 1951Sci ... 114..279N . DOI : 10.1126 / science.114.2959.279 . PMID  14866220 .
  23. ^ Марвин Мински: Аппарат для микроскопии. Патент США 3.013.467 , подана 7 ноября 1957 г., выдана 19 декабря 1961 г.
  24. ^ Марвин Мински (1988). «Воспоминания об изобретении конфокального сканирующего микроскопа». Сканирование . 10 (4): 128–138. DOI : 10.1002 / sca.4950100403 .
  25. ^ Гай Кокс: методы оптического изображения в клеточной биологии. 1. издание. CRC Press, Taylor & Francis Group, Бока-Ратон, Флорида, США, 2006 г., ISBN  0-8493-3919-7 , страницы 115-122.
  26. ^ Эггер, доктор медицины, Петран М. (июль 1967 г.). «Новый микроскоп в отраженном свете для просмотра неокрашенных клеток головного мозга и ганглиев». Наука . 157 (786): 305–7. Bibcode : 1967Sci ... 157..305E . DOI : 10.1126 / science.157.3786.305 . PMID  6030094 . S2CID  180450 .
  27. ^ MOJMÍR PETRÁ; МИЛАН АДРАВСКИЙ; М. ДЭВИД ЭГГЕР; РОБЕРТ ГАЛАМБОС (1968). "Сканирующий тандемный микроскоп в отраженном свете". Журнал Оптического общества Америки . 58 (5): 661–664. Bibcode : 1968JOSA ... 58..661P . DOI : 10.1364 / JOSA.58.000661 .
  28. ^ Моймир Петрад, Милан Хадравски: МЕТОД И МЕРОПРИЯТИЯ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ РАЗРЕШЕНИЯ, СИЛЫ И КОНТРАСТНОСТИ. онлайн в Google Patents, подана 4 ноября 1967 г., предоставлена ​​30 июня 1970 г.
  29. ^ Давидовиц, П .; Эггер, доктор медицины (1969). «Сканирующий лазерный микроскоп» . Природа . 223 (5208): 831. Bibcode : 1969Natur.223..831D . DOI : 10.1038 / 223831a0 . PMID  5799022 . S2CID  4161644 .
  30. ^ Давидовиц, П .; Эггер, доктор медицины (1971). «Сканирующий лазерный микроскоп для биологических исследований». Прикладная оптика . 10 (7): 1615–1619. Bibcode : 1971ApOpt..10.1615D . DOI : 10,1364 / AO.10.001615 . PMID  20111173 .
  31. ^ Барри Р. Мастерс: конфокальная микроскопия и микроскопия с многофотонным возбуждением. Генезис визуализации живых клеток. SPIE Press, Беллингем, Вашингтон, США, 2006 г., ISBN  978-0-8194-6118-6 , стр. 124-125.
  32. ^ а б в г Шинья Иноуэ (2006). «Глава 1: Основы конфокального сканирования изображений в световой микроскопии». В Джеймсе Паули (ред.). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". стр.  1 -19. ISBN 978-0-387-25921-5.
  33. ^ Шеппард, CJR; Чоудхури, А. (1977). «Формирование изображения в сканирующем микроскопе». Optica Acta: Международный журнал оптики . 24 (10): 1051–1073. DOI : 10.1080 / 713819421 .
  34. ^ Cremer, C .; Кремер Т. (1978). «Соображения по поводу лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости». Microscopica Acta . 81 : 31–44. PMID  713859 .
  35. ^ а б в Амос, ВБ ; Белый, JG (2003). «Как конфокальный лазерный сканирующий микроскоп попал в биологические исследования» . Биология клетки . 95 (6): 335–342. DOI : 10.1016 / S0248-4900 (03) 00078-9 . PMID  14519550 . S2CID  34919506 .
  36. ^ Кокс, Эй Джей; Шеппард, CJ (1983). «Сканирующий оптический микроскоп, включающий в себя цифровой каркас и микрокомпьютер». Прикладная оптика . 22 (10): 1474. Bibcode : 1983ApOpt..22.1474C . DOI : 10,1364 / ao.22.001474 . PMID  18195988 .
  37. ^ Уайт, JG (1987). «Оценка конфокального по сравнению с традиционным отображением биологических структур с помощью флуоресцентной световой микроскопии» . Журнал клеточной биологии . 105 (1): 41–48. DOI : 10,1083 / jcb.105.1.41 . ISSN  0021-9525 . PMC  2114888 . PMID  3112165 .
  38. ^ Анон (2005). "Доктор Джон Уайт FRS" . royalsociety.org . Лондон: Королевское общество . Архивировано из оригинала на 2015-11-17.
  39. ^ Амос, ВБ; Белый, JG (2003). «Как конфокальный лазерный сканирующий микроскоп попал в биологические исследования» . Биология клетки . 95 (6): 335–342. DOI : 10.1016 / S0248-4900 (03) 00078-9 . PMID  14519550 . S2CID  34919506 .
  40. ^ Carlsson, K .; Danielsson, PE; Lenz, R .; Liljeborg, A .; Majlöf, L .; Ослунд, Н. (1985). «Трехмерная микроскопия с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа». Письма об оптике . 10 (2): 53–55. Bibcode : 1985OptL ... 10 ... 53C . DOI : 10.1364 / OL.10.000053 . PMID  19724343 .
  41. ^ Брент Джонсон (1 февраля 1999 г.). «Образ - это все». Ученый . онлайн
  42. ^ Дайана Морган (23 июля 1990 г.). "Конфокальные микроскопы расширяют горизонты карьеры в области клеточной биологии". Ученый . онлайн
  43. ^ «Аппарат и метод анализа частиц» .
  44. ^ «Аппарат и метод анализа частиц» .
  45. ^ Все права защищены, Mettler-Toledo International Inc. «Анализ распределения частиц по размерам» . Архивировано из оригинала на 2016-10-09 . Проверено 6 октября 2016 .
  • Хоффман, Дэвид П .; Штенгель, Глеб; Xu, C. Shan; Кэмпбелл, Кирби Р .; Фриман, Мелани; Ван, Лэй; Милки, Дэниел Э .; Пазолли, Х. Амалия; Айер, Нирмала; Богович, Джон А .; Стейбли, Дэниел Р .; Ширинифард, Аббас; Пан, Песня; Пил, Дэвид; Шефер, Кэти; Pomp, Wim; Чанг, Чи-Лун; Липпинкотт-Шварц, Дженнифер; Кирххаузен, Том; Solecki, Дэвид Дж .; Бетциг, Эрик; Гесс, Харальд Ф. (2020). «Корреляционная трехмерная электронная микроскопия сверхвысокого разрешения и блочная лицевая микроскопия целых замороженных клеток стекловидного тела» . Наука . 367 (6475): eaaz5357. DOI : 10.1126 / science.aaz5357 . ISSN  0036-8075 . PMC  7339343 . PMID  31949053 .

  • Виртуальный CLSM (на основе Java)
  • Анимации и пояснения к различным типам микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы (Université Paris Sud)