Из Википедии, свободной энциклопедии
  (Перенаправлено из криоэлектронной томографии )
Перейти к навигации Перейти к поиску
На этой схеме показана концепция электронной томографии. Образец отображается в ПЭМ, поскольку он наклонен под разными углами, что приводит к «серии наклона» 2D-изображений (вверху). Затем эта серия наклона с помощью вычислений преобразуется в трехмерную «томограмму» (внизу).

Электронная криотомография ( CryoET ) - это метод визуализации, используемый для получения трехмерных изображений образцов с высоким разрешением (~ 1–4 нм), обычно биологических макромолекул и клеток . [1] [2] CryoET - это специализированное приложение трансмиссионной электронной криомикроскопии (CryoTEM), в котором образцы визуализируются при наклоне, что приводит к серии 2D-изображений, которые можно комбинировать для создания 3D-реконструкции, похожей на компьютерную томографию. человеческого тела. В отличие от других методов электронной томографии , образцы иммобилизуют в некристаллическом («стекловидном») льду и визуализируют в криогенных условиях.условиях (<-150 ° C), что позволяет получать изображения без обезвоживания или химической фиксации, которые в противном случае могли бы нарушить или исказить биологические структуры. [3] [4]

Описание техники [ править ]

Пример электронной криотомографии. На изображении показан центральный срез томографической реконструкции интактной клетки Bdellovibrio bacteriovorus . Масштабная шкала 200 нм.

В электронной микроскопии (ЭМ) образцы отображаются в сверхвысоком вакууме. Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; вода закипит, и при перепаде давления ячейка взорвется. Поэтому в методах ЭМ при комнатной температуре образцы готовят путем фиксации и дегидратации. Однако другой подход к стабилизации биологических образцов - их замораживание ( электронная криомикроскопия ). Как и в других методах электронной криомикроскопии, образцы для CryoET (обычно маленькие клетки (например, бактерии , археи или вирусы ) готовятся в стандартных водных средах и наносятся на решетку ЭМ. Затем сетка погружается в криоген (обычно этан) настолько эффективен, что молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. [3] Получающееся в результате состояние воды называется «стекловидным льдом» и сохраняет естественные клеточные структуры, такие как липидные мембраны , которые обычно разрушаются при замораживании. Затем образцы, замороженные погружением, хранятся и визуализируются при температуре жидкого азота, так что вода никогда не нагревается достаточно для кристаллизации.

Образцы отображаются в просвечивающем электронном микроскопе (ТЕМ). Как и в других методах электронной томографии , образец наклоняется под разными углами относительно электронного луча (обычно каждые 1 или 2 градуса от примерно -60 ° до + 60 °), и изображение получается под каждым углом. [5] Затем эту серию изображений с наклоном можно реконструировать с помощью вычислений в трехмерное изображение интересующего объекта. [6] Это называется томограммой или томографической реконструкцией.

Приложения [ править ]

В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом, разрешение ограничено толщиной образца. Кроме того, толщина образца увеличивается по мере его наклона, и более толстые образцы могут полностью блокировать электронный луч, делая изображение темным или полностью черным. Следовательно, для CryoET образцы должны иметь толщину менее ~ 500 нм для достижения «макромолекулярного» разрешения (~ 4 нм). По этой причине большинство исследований ЭСТ было сосредоточено на очищенных макромолекулярных комплексах, вирусах или малых клетках, таких как клетки многих видов бактерий и архей. [1]

Клетки большего размера и даже ткани могут быть подготовлены для CryoET путем утонения, криосрезов или измельчения сфокусированным ионным пучком (FIB). В крио-секционировании, замороженные блоки из клеток или тканей подразделяются на тонкие образцы с крио- микротомом . [7] При фрезеровании FIB замороженные образцы подвергаются воздействию сфокусированного пучка ионов, обычно галлия, который точно смывает материал с верха и низа образца, оставляя тонкую пластинку, подходящую для визуализации ЭСТ. [8]

Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Поскольку образец наклоняется во время визуализации, электронный луч взаимодействует с относительно большей площадью поперечного сечения при более высоких углах наклона. На практике углы наклона более 60–70 ° не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к "отсутствующему клину" информации на окончательной томограмме, что снижает разрешение параллельно электронному пучку. [6]

Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях на одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) может быть получено путем усреднения субтомограмм. [9] [10] Подобно анализу отдельных частиц , при усреднении субтомограммы путем вычислений объединяются изображения идентичных объектов для увеличения отношения сигнал / шум .

Основным препятствием в CryoET является идентификация интересующих структур в сложных клеточных средах. Одним из решений является применение коррелированных крио флуоресцентной световой микроскопии , [11] и даже супер-разрешения световой микроскопии (например , крио-PALM [12] ), и CryoET. В этих методах образец, содержащий интересующий флуоресцентно меченый белок, подвергается глубокой заморозке и сначала отображается в световом микроскопе, оборудованном специальным предметным столиком, позволяющим хранить образец при температурах субкристаллизации (<-150 ° C). Местоположение флуоресцентного сигнала идентифицируется, и образец переносится в CryoTEM, где то же место затем отображается с высоким разрешением с помощью CryoET.

См. Также [ править ]

  • Электронная микроскопия
  • Электронная томография
  • Просвечивающая электронная криомикроскопия
  • Просвечивающая электронная микроскопия

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б Ган, Лу; Дженсен, Грант Дж. (01.02.2012). «Электронная томография клеток» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 45 (1): 27–56. DOI : 10.1017 / S0033583511000102 . ISSN  1469-8994 . PMID  22082691 .
  2. ^ Додонова, Светлана О; Адерхолд, Патрик; Копп, Юрген; Ганева, Ива; Рёлинг, Симона; Hagen, Wim JH; Грех, Ирмгард; Виланд, Феликс; Бриггс, Джон А.Г. (16.06.2017). «Структура 9Å оболочки COPI показывает, что ГТФаза Arf1 занимает два контрастирующих молекулярных окружения» . eLife . 6 . DOI : 10.7554 / eLife.26691 . ISSN 2050-084X . PMC 5482573 . PMID 28621666 .   
  3. ^ a b Dubochet, J .; Адриан, М .; Чанг, JJ; Homo, JC; Lepault, J .; McDowall, AW; Шульц, П. (1988-05-01). «Криоэлектронная микроскопия застеклованных образцов» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 21 (2): 129–228. DOI : 10.1017 / s0033583500004297 . ISSN 0033-5835 . PMID 3043536 .   
  4. ^ Oikonomou, CM; Jensen, GJ; Чанг, Ю.В. (апрель 2016 г.). «Новый взгляд на биологию прокариотических клеток с помощью электронной криотомографии» . Обзоры природы. Микробиология . 14 (4): 205–20. DOI : 10.1038 / nrmicro.2016.7 . PMC 5551487 . PMID 26923112 .  
  5. ^ Р. Ховден; Д.А. Мюллер (2020). «Электронная томография функциональных наноматериалов». Бюллетень МИССИС . 45 (4): 298–304. arXiv : 2006.01652 . DOI : 10.1557 / mrs.2020.87 .
  6. ^ a b Лучич, Владан; Ригорт, Александр; Баумейстер, Вольфганг (05.08.2013). «Криоэлектронная томография: проблема структурной биологии на месте» . Журнал клеточной биологии . 202 (3): 407–419. DOI : 10,1083 / jcb.201304193 . ISSN 1540-8140 . PMC 3734081 . PMID 23918936 .   
  7. ↑ Аль-Амуди, Ашраф; Чанг, Цзинь-Джу; Лефорстье, Амели; Макдауэл, Аласдер; Саламин, Лоре Мишель; Норлен, Ларс П.О.; Рихтер, Карстен; Блан, Натали Сартори; Студер, Дэниел (2004-09-15). «Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела» . Журнал EMBO . 23 (18): 3583–3588. DOI : 10.1038 / sj.emboj.7600366 . ISSN 0261-4189 . PMC 517607 . PMID 15318169 .   
  8. ^ Вилла, Элизабет; Шаффер, Мирослава; Плитцко, Юрген М .; Баумейстер, Вольфганг (01.10.2013). «Открытие окон в ячейке: фрезерование сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии». Текущее мнение в структурной биологии . 23 (5): 771–777. DOI : 10.1016 / j.sbi.2013.08.006 . ISSN 1879-033X . PMID 24090931 .  
  9. ^ Бриггс, Джон AG (2013-04-01). «Структурная биология in situ - возможности усреднения субтомограмм». Текущее мнение в структурной биологии . 23 (2): 261–267. DOI : 10.1016 / j.sbi.2013.02.003 . ISSN 1879-033X . PMID 23466038 .  
  10. ^ Шур, Флориан К.М.; Дик, Роберт А .; Hagen, Wim JH; Vogt, Volker M .; Бриггс, Джон AG (2015-10-15). «Структура незрелых вирусоподобных частиц кляпов вируса саркомы Рауса показывает структурную роль домена p10 в сборке» . Журнал вирусологии . 89 (20): 10294–10302. DOI : 10,1128 / JVI.01502-15 . ISSN 1098-5514 . PMC 4580193 . PMID 26223638 .   
  11. ^ Zhang, Peijun (2013-10-01). «Корреляционная криоэлектронная томография и оптическая микроскопия клеток» . Текущее мнение в структурной биологии . 23 (5): 763–770. DOI : 10.1016 / j.sbi.2013.07.017 . ISSN 1879-033X . PMC 3812453 . PMID 23962486 .   
  12. ^ Чанг, И-Вэй; Чен, Сонгье; Точева, Элица И .; Treuner-Lange, Anke; Лёбах, Стефани; Согаард-Андерсен, Лотте; Дженсен, Грант Дж. (2014-07-01). «Коррелированная криогенная фотоактивированная локализационная микроскопия и криоэлектронная томография» . Методы природы . 11 (7): 737–739. DOI : 10.1038 / nmeth.2961 . ISSN 1548-7105 . PMC 4081473 . PMID 24813625 .   

Внешние ссылки [ править ]

  • Начало работы с курсом крио-ЭМ (Калифорнийский технологический институт)