ДНКазы футпринтинг анализ [1] представляет собой ДНК футпринтинга техник из молекулярной биологии / биохимии , который обнаруживает ДНК - белок взаимодействие , используя тот факт , что белок связывается с ДНК часто защитить эту ДНК от ферментативного расщепления. Это позволяет найти сайт связывания белка на конкретной молекуле ДНК. В этом методе используется фермент дезоксирибонуклеаза (для краткости ДНКаза) для разрезания ДНК с радиоактивной меткой на концах с последующим гель-электрофорезом для определения результирующей картины расщепления.
Например, интересующий фрагмент ДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР с использованием праймера, меченного 32 P 5 ', в результате чего будет много молекул ДНК с радиоактивной меткой на одном конце одной цепи каждой двухцепочечной молекулы. Расщепление ДНКазой приведет к образованию фрагментов. Фрагменты, которые меньше по сравнению с концом, меченным 32 P, будут появляться на геле дальше, чем более длинные фрагменты. Затем гель используется для экспонирования специальной фотопленки.
Картина расщепления ДНК в отсутствие ДНК-связывающего белка, обычно называемая свободной ДНК, сравнивается с картиной расщепления ДНК в присутствии ДНК-связывающего белка. Если белок связывает ДНК, сайт связывания защищен от ферментативного расщепления. Эта защита приведет к появлению на геле чистой области, называемой «следом».
Варьируя концентрацию ДНК-связывающего белка, можно оценить сродство связывания белка в соответствии с минимальной концентрацией белка, при которой наблюдается след.
Этот метод был разработан Дэвидом Галасом и Альбертом Шмитцем в Женеве в 1977 г. [2]
Смотрите также
Рекомендации
- ^ Brenowitz M, Senear DF, Shea MA, Ackers GK (1986). «Количественное титрование следа ДНКазы: метод изучения взаимодействий белок-ДНК». Методы в энзимологии . 130 : 132–81. DOI : 10.1016 / 0076-6879 (86) 30011-9 . ISBN 9780121820305. PMID 3773731 .
- ^ Galas DJ, Schmitz A (сентябрь 1978 г.). «ДНК-следы: простой метод определения специфичности связывания белок-ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 5 (9): 3157–70. DOI : 10.1093 / NAR / 5.9.3157 . PMC 342238 . PMID 212715 .