Темно-поле микроскопия (также называемая темно-земля микроскопией ) описывает микроскопию методы, в оба свете и электронной микроскопии , исключающую нерассеянный луч из изображения. В результате поле вокруг образца (то есть там, где нет образца для рассеивания луча) обычно темное.
В оптических микроскопах необходимо использовать конденсорную линзу темного поля, которая направляет конус света от линзы объектива. Чтобы максимизировать способность линзы объектива собирать рассеянный свет, используется масляная иммерсия, а числовая апертура (NA) линзы объектива должна быть меньше 1,0. Объективы с более высокой числовой апертурой можно использовать, но только если они имеют регулируемую диафрагму, которая уменьшает числовую апертуру. Часто эти линзы объектива имеют числовую апертуру от 0,7 до 1,25. [1]
Приложения световой микроскопии
В оптической микроскопии темное поле описывает метод освещения , используемый для увеличения контраста неокрашенных образцов . Он работает, освещая образец светом, который не будет собираться линзой объектива и, следовательно, не будет составлять часть изображения. Это создает классический вид темного, почти черного фона с яркими объектами на нем.
Путь света
Шаги показаны на рисунке, где используется инвертированный микроскоп .
- Свет попадает в микроскоп для освещения образца.
- Диск особого размера, патч-стоп (см. Рисунок), блокирует часть света от источника света, оставляя внешнее кольцо освещения. Широкое фазовое кольцо также может быть разумно заменено при малом увеличении.
- Конденсаторная линза фокусирует свет в стороне образца.
- Свет попадает в образец. Большая часть передается напрямую, а часть рассеивается от образца.
- Рассеянный свет входит в линзу объектива, в то время как непосредственно передается свет просто не попадает в объектив и не собирается из - за блока прямого освещения (смотри рисунок).
- Только рассеянный свет продолжает создавать изображение, тогда как прямой проходящий свет опускается.
Преимущества и недостатки
Микроскопия в темном поле - очень простой, но эффективный метод, который хорошо подходит для использования с живыми и неокрашенными биологическими образцами, такими как мазок из тканевой культуры или отдельных, передающихся через воду, одноклеточных организмов. Учитывая простоту настройки, качество изображений, полученных с помощью этого метода, впечатляет.
Одним из ограничений темнопольной микроскопии является низкий уровень освещенности на конечном изображении. Это означает, что образец должен быть очень сильно освещен, что может привести к его повреждению.
Методы темнопольной микроскопии почти полностью исключают появление ореолов или артефактов в виде рельефа, типичных для ДИК и фазово-контрастных изображений. Это происходит за счет чувствительности к фазовой информации.
Интерпретация изображений в темном поле должна выполняться с большой осторожностью, поскольку общие темные элементы изображений, полученных с помощью светлопольной микроскопии, могут быть невидимы, и наоборот. В общем, изображению в темном поле не хватает низких пространственных частот, связанных с изображением в светлом поле, что делает изображение высокочастотной версией базовой структуры.
Хотя изображение в темном поле может сначала показаться негативом изображения в светлом поле, в каждом из них видны разные эффекты. В светлопольной микроскопии видны особенности там, где либо тень падает на поверхность падающим светом, либо часть поверхности имеет меньшую отражающую способность, возможно, из-за наличия ямок или царапин. Выступающие элементы, которые слишком гладкие, чтобы отбрасывать тени, не будут отображаться на изображениях с ярким полем, но свет, отражающийся от сторон элемента, будет виден на изображениях с темным полем.
- Сравнение методов просвечивания, используемых для создания контраста в образце тонкой бумаги (1,559 мкм / пиксель при просмотре в полном разрешении)
Темнопольное освещение, контраст образца достигается за счет рассеянного им света
Яркое освещение, контраст образца обусловлен ослаблением света в образце
Освещение кроссполяризованным светом , контраст образца достигается за счет вращения поляризованного света через образец
Фазово-контрастное освещение, контраст образца возникает из-за интерференции света разной длины через образец
Использование в вычислениях
Микроскопия темного поля недавно была применена в указывающих устройствах компьютерных мышей, чтобы позволить мыши работать с прозрачным стеклом, отображая микроскопические дефекты и пыль на поверхности стекла.
Темнопольная микроскопия в сочетании с гиперспектральной визуализацией
В сочетании с гиперспектральной визуализацией микроскопия темного поля становится мощным инструментом для характеристики наноматериалов, встроенных в клетки. В недавней публикации Пацковский и др. использовали эту технику для изучения прикрепления наночастиц золота (AuNP) к раковым клеткам CD44 +. [2]
Применения просвечивающего электронного микроскопа
Исследования темного поля в просвечивающей электронной микроскопии играют важную роль в изучении кристаллов и дефектов кристаллов, а также в визуализации отдельных атомов.
Обычная визуализация в темном поле
Вкратце, формирование изображения [3] включает наклон падающего света до тех пор, пока дифрагированный, а не падающий луч не пройдет через маленькую апертуру объектива в задней фокальной плоскости линзы объектива. Изображения темного поля в этих условиях позволяют отображать дифрагированную интенсивность, исходящую от одного набора дифрагирующих плоскостей, как функцию проецируемого положения на образце и как функцию наклона образца.
В монокристаллических образцах одноотражательные темнопольные изображения образца, наклоненного сразу после условия Брэгга, позволяют «засветить» только те дефекты решетки, как дислокации или преципитаты, которые изгибают один набор плоскостей решетки по соседству. . Затем можно использовать анализ интенсивности в таких изображениях для оценки величины этого изгиба. В поликристаллических образцах, с другой стороны, изображения в темном поле служат для освещения только той части кристаллов, которые отражают Брэгга в данной ориентации.
| Анимация: отображение кристаллов в темном поле |
|---|
 Цифровое моделирование темного поля металлических частиц размером 2 нм на наноцилиндре |
Визуализация в слабом луче
Визуализация слабым лучом включает в себя оптику, аналогичную традиционной темному полю, но использующую гармонику дифрагированного луча, а не сам дифрагированный луч. Таким образом можно получить гораздо более высокое разрешение напряженных областей вокруг дефектов.
Получение кольцевых темнопольных изображений под низким и большим углом
Для получения изображений в кольцевом темном поле необходимо формировать изображения с электронами, дифрагировавшими в кольцевую апертуру, центрированную на нерассеянном пучке, но не включая его. Для больших углов рассеяния в сканирующем просвечивающем электронном микроскопе это иногда называют Z- контрастным изображением из-за усиленного рассеяния на атомах с большим атомным числом.
Цифровой анализ темного поля
Это математический метод, промежуточный между прямым и обратным (преобразование Фурье) пространством для исследования изображений с четко определенной периодичностью, таких как изображения решетчатых полос с помощью электронного микроскопа. Как и в случае аналоговой визуализации в темном поле в просвечивающем электронном микроскопе, он позволяет «осветить» те объекты в поле зрения, где находятся интересующие периодичности. В отличие от аналоговой визуализации темного поля, он также может позволить отобразить Фурье-фазу периодичностей и, следовательно, фазовые градиенты, которые предоставляют количественную информацию о векторной деформации решетки.
Смотрите также
Сноски
- ^ Nikon: Темнопольное Освещение
- ^ С. Пацковский; и другие. (2014). «Широкопольное гиперспектральное трехмерное изображение функционализированных наночастиц золота, нацеленных на раковые клетки, с помощью микроскопии в отраженном свете». Журнал биофотоники . 8 (5): 1–7. DOI : 10.1002 / jbio.201400025 . PMID 24961507 .
- ^ П. Хирш, А. Хоуи, Р. Николсон, Д. В. Пэшли и М. Дж. Уилан (1965/1977) Электронная микроскопия тонких кристаллов (Баттервортс / Кригер, Лондон / Малабар, Флорида) ISBN 0-88275-376-2 .
Внешние ссылки
- Nikon - Стереомикроскопия> Освещение темного поля
- Молекулярные выражения
- Праймер Darkfield Illumination Primer
- Gage SH . 1920. Современная темнопольная микроскопия и история ее развития . Труды Американского общества микроскопии 39 (2): 95–141.
- Микроскопы темного поля и фазового контраста (Université Paris Sud)