Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Деградация по Эдману , разработанная Пером Эдманом , представляет собой метод секвенирования аминокислот в пептиде . [1] В этом методе аминоконцевой остаток метят и отщепляют от пептида без разрыва пептидных связей между другими аминокислотными остатками.

Механизм [ править ]

Деградация по Эдману с помощью общей аминокислотной пептидной цепи

Фенилизотиоцианат реагирует с незаряженной N-концевой аминогруппой в слабощелочных условиях с образованием циклического фенилтиокарбамоильного производного. Затем в кислых условиях это производное концевой аминокислоты расщепляется как производное тиазолинона. Затем тиазолиноновую аминокислоту селективно экстрагируют органическим растворителем и обрабатывают кислотой с образованием более стабильного фенилтиогидантоина (ПТГ) - производного аминокислоты, которое можно идентифицировать с помощью хроматографии или электрофореза.. Затем эту процедуру можно повторить еще раз, чтобы определить следующую аминокислоту. Главный недостаток этого метода состоит в том, что секвенируемые таким образом пептиды не могут иметь более 50-60 остатков (а на практике менее 30). Длина пептида ограничена из-за того, что циклическая дериватизация не всегда завершается. Проблема дериватизации может быть решена путем расщепления больших пептидов на более мелкие пептиды перед продолжением реакции. Он способен точно секвенировать до 30 аминокислот с помощью современных машин, обеспечивающих эффективность более 99% на каждую аминокислоту . Преимущество Эдмана является то , что он использует только 10 - 100 Pico-молей из пептидадля процесса секвенирования. Реакция разложения Эдмана была автоматизирована в 1967 году Эдманом и Беггсом для ускорения процесса [2], и к 1973 году во всем мире использовалось 100 автоматических устройств. [3]

Ограничения [ править ]

Поскольку деградация по Эдману происходит от N-конца белка, она не будет работать, если N-конец был химически модифицирован (например, путем ацетилирования или образования пироглутаминовой кислоты ). Секвенирование остановится, если встретится не-α-аминокислота (например, изоаспарагиновая кислота ), поскольку предпочтительный пятичленный кольцевой интермедиат не может образоваться. Деградация по Эдману обычно не используется для определения положения дисульфидных мостиков. Для заметных результатов также требуется количество пептида 1 пикомоль или выше.

Парный анализ [ править ]

После 2D SDS PAGE белки могут быть перенесены на мембрану для блоттинга из поливинилидендифторида (PVDF) для дальнейшего анализа. Разложение по Эдману можно проводить непосредственно с мембраны из ПВДФ. Секвенирование N-концевого остатка, дающее от пяти до десяти аминокислот, может быть достаточным для идентификации представляющего интерес белка (POI).

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Эдман, П .; Хёгфельдт, Эрик; Силлен, Ларс Гуннар; Кинелл, Пер-Олоф (1950). «Метод определения аминокислотной последовательности в пептидах» . Acta Chem. Сканд . 4 : 283–293. DOI : 10.3891 / acta.chem.scand.04-0283 ..
  2. ^ Edman P, Begg G (март 1967). «Секвенатор белка». Евро. J. Biochem . 1 (1): 80–91. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1967.tb00047.x . PMID 6059350 . 
  3. Перейти ↑ Niall HD (1973). «Автоматическая деградация Эдмана: секвенатор белка». Meth. Энзимол . Методы в энзимологии. 27 : 942–1010. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (73) 27039-8 . ISBN 978-0-12-181890-6. PMID  4773306 .