Рекомбинация FLP-FRT
В генетике рекомбинация Flp- FRT представляет собой технологию сайт-направленной рекомбинации , все чаще используемую для манипулирования ДНК организма в контролируемых условиях in vivo . Он аналогичен рекомбинации Crelox, но включает рекомбинацию последовательностей между короткими сайтами-мишенями распознавания флиппаз ( FRT ) с помощью рекомбиназы флиппазы ( Flp ), полученной из 2 мк плазмиды пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae .
для которого флиппаза (Flp) связывается с обоими плечами 13 п.н. 5'-GAAGTTCCTATTC-3', фланкирующими спейсер из 8 п.н., т.е. сайт-специфическая рекомбинация (область кроссинговера) в обратной ориентации. Расщепление, опосредованное FRT , происходит прямо перед асимметричной сердцевинной областью из 8 п.н. ( 5'tctagaaa3' ) на верхней нити и позади этой последовательности на нижней нити. [1] Существует несколько вариантов сайтов FRT , но рекомбинация обычно может происходить только между двумя идентичными FRT , но обычно не между неидентичными ("гетероспецифическими") FRT . [2] [3]
У дрожжей этот фермент исправляет уменьшение числа копий плазмиды размером 2 мкм, вызванное редкими случаями неправильной сегрегации. Он делает это, вызывая рекомбинацию между двумя инвертированными повторами на 2-мкм плазмиде во время репликации ДНК . Это изменяет направление одной вилки репликации, вызывая несколько циклов копирования за одну инициацию. [4]
Сенекофф и др.(1987) исследовали, как нуклеотидные замены в FRT влияют на эффективность FLP-опосредованной рекомбинации. Авторы индуцировали замены оснований в одном или обоих сайтах FRT и тестировали концентрацию FLP, необходимую для наблюдения сайт-специфических рекомбинаций. Каждую замену оснований выполняли для каждого из тринадцати нуклеотидов в сайте FRT (пример G на A, T и C). Во-первых, авторы показали, что большинство мутаций в последовательности FRT вызывают минимальные эффекты, если присутствуют только в одном из двух сайтов. Если мутации произошли в обоих сайтах, эффективность FLP резко снижается. Во-вторых, авторы предоставили данные о том, какие нуклеотиды наиболее важны для связывания FLP и эффективности сайт-специфической рекомбинации. Если первый нуклеотид в обоих сайтах FRT заменен на цитозин (G на C),[5] В то время как замена основания любого из вышеупомянутых нуклеотидов только в одном из сайтов FRT приводила к десятикратному, десятикратному и пятикратному снижению эффективности соответственно. [5]
Замены оснований в нуклеотидах с заглавной буквы привели к наибольшему снижению сайт-специфической рекомбинации, опосредованной FLP (мутант дикого типа x и мутант x мутант):
Многие доступные конструкции включают дополнительные последовательности плеча (5'-ГААГТТЦТАТТЦК-3') одна пара оснований от элемента выше по потоку и в той же ориентации:
