Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Сайт-специфическая рекомбинация , также известная как консервативная сайт-специфическая рекомбинация , представляет собой тип генетической рекомбинации, при которой происходит обмен цепями ДНК между сегментами, обладающими по крайней мере определенной степенью гомологии последовательностей . [1] [2] [3] Ферменты, известные как сайт-специфические рекомбиназы.(SSR) осуществляют перестройку сегментов ДНК путем распознавания и связывания с короткими специфическими последовательностями ДНК (сайтами), в которых они расщепляют основную цепь ДНК, обмениваются двумя задействованными спиралями ДНК и воссоединяются с цепями ДНК. В некоторых случаях для протекания реакции достаточно наличия фермента рекомбиназы и сайтов рекомбинации; в других системах требуется ряд дополнительных белков и / или дополнительных сайтов. Многие различные стратегии модификации генома , среди которых опосредованный рекомбиназой обмен кассет (RMCE), усовершенствованный подход для целевого введения единиц транскрипции в заранее определенные геномные локусы, основаны на SSR.

Системы сайт-специфической рекомбинации высокоспецифичны, быстры и эффективны даже при работе со сложными эукариотическими геномами. [4] Они естественным образом используются в различных клеточных процессах, включая репликацию бактериального генома , дифференциацию и патогенез , а также перемещение мобильных генетических элементов . [5] По тем же причинам они представляют собой потенциальную основу для разработки инструментов генной инженерии . [6]

Сайты рекомбинации обычно имеют длину от 30 до 200 нуклеотидов и состоят из двух мотивов с частичной симметрией инвертированного повтора, с которыми связывается рекомбиназа и которые фланкируют центральную последовательность кроссовера, в которой происходит рекомбинация. Пары сайтов, между которыми происходит рекомбинация, обычно идентичны, но есть исключения (например, attP и attB интегразы λ ). [7]

Классификация: тирозин- и серин-рекомбиназы [ править ]

Рис. 1. Тир-рекомбиназы: детали ступени кроссовера.

Вверху: традиционный вид, включающий обмен нитями с последующим переносом ветвей (корректура). Механизм происходит в рамках синаптического комплекса (1), включающего оба сайта ДНК в параллельной ориентации. Хотя ветвящаяся миграция напрямую объясняет специфические требования гомологии и обратимость процесса, она не может быть согласована с движениями субъединиц рекомбиназы в трех измерениях.

Внизу: текущий вид. Две одновременные замены цепей, каждая из которых зависит от комплементарности трех последовательных оснований на краях спейсера из 8 пар оснований (или рядом с ними) (пунктирные линии указывают на спаривание оснований). Дидактические сложности возникают из-за того, что в этой модели синаптический комплекс должен вмещать оба субстрата в антипараллельной ориентации.

Этот синаптический комплекс (1) возникает в результате ассоциации двух индивидуальных субъединиц рекомбиназы («протомеры»; серые овалы) с соответствующим сайтом-мишенью. Его образование зависит от межпротомерных контактов и изгиба ДНК, которые, в свою очередь, определяют субъединицы (зеленый цвет), играющие активную роль во время первой реакции кроссовера. Оба изображения иллюстрируют только половину соответствующего пути. Эти части разделяются стадией соединения Холлидея / изомеризации перед высвобождением продукта (3).
Рис. 2. Сер-рекомбиназы: (по существу необратимый) путь вращения субъединиц.

В отличие от Tyr-рекомбиназ, четыре участвующих нити ДНК разрезаются синхронно в точках, разнесенных только на 2 п.н. (оставляя мало места для корректуры). Вращение субъединицы (180 °) позволяет обмениваться цепями, будучи ковалентно связанными с белком-партнером. Промежуточное воздействие двухцепочечных разрывов несет риск запуска незаконной рекомбинации и, следовательно, вторичных реакций.

Здесь синаптический комплекс возникает в результате ассоциации предварительно сформированных димеров рекомбиназы с соответствующими сайтами-мишенями (CTD / NTD, C- / N-концевой домен). Как и в случае Tyr-рекомбиназ, каждый сайт содержит два плеча, в каждом из которых находится один протомер. Поскольку оба плеча структурированы немного по-разному, субъединицы становятся конформационно настроенными и тем самым готовятся к их соответствующей роли в цикле рекомбинации. В отличие от представителей Tyr-класса, путь рекомбинации преобразует два разных сайта субстрата (attP и attB) в сайт-гибриды (attL и attR) . Это объясняет необратимую природу этого конкретного пути рекомбинации, который может быть преодолен только с помощью вспомогательных «факторов направленности рекомбинации» (RDF).

На основании гомологии аминокислотных последовательностей и механистического родства большинство сайт-специфических рекомбиназ сгруппированы в одно из двух семейств: семейство тирозиновых (Tyr) рекомбиназ или семейство серин (Ser) рекомбиназ . Названия происходят от консервативного нуклеофильного аминокислотного остатка, присутствующего в каждом классе рекомбиназы, который используется для атаки ДНК и который становится ковалентно связанным с ней во время обмена цепью. Самые ранние идентифицированные члены семейства сериновых рекомбиназ были известны как резольвазы или ДНК-инвертазы , в то время как член-основатель тирозиновых рекомбиназ, лямбда- фаговая интеграза (с использованием сайтов узнавания attP / B), отличается от хорошо известных сейчас ферментов, таких как Cre(из фага P1 ) и FLP (из дрожжей Saccharomyces cerevisiae ). Известные сериновые рекомбиназы включают ферменты, такие как гамма-дельта-резольваза (из транспозона Tn 1000 ), резольваза Tn3 (из транспозона Tn3) и интеграза φ C31 (из фага φ C31). [8]

Хотя отдельные члены двух семейств рекомбиназ могут выполнять реакции с одинаковыми практическими результатами, семейства не связаны друг с другом, имея разные белковые структуры и механизмы реакции. В отличие от тирозиновых рекомбиназ, сериновые рекомбиназы имеют высокую модульность, на что сначала намекали биохимические исследования [9], а затем показали кристаллографические структуры. [10] [11] Знание этих белковых структур может оказаться полезным при попытке реконструировать рекомбиназные белки в качестве инструментов для генетических манипуляций.

Механизм [ править ]

Рекомбинация между двумя сайтами ДНК начинается с распознавания и связывания этих сайтов - по одному сайту на каждой из двух отдельных двухцепочечных молекул ДНК или по крайней мере двух удаленных сегментах одной и той же молекулы - ферментом рекомбиназой. Затем следует синапс , т. Е. Объединение сайтов в синаптический комплекс. Именно в этом синаптическом комплексе происходит обмен цепями, поскольку ДНК расщепляется и воссоединяется с помощью контролируемых реакций переэтерификации . Во время обмена цепями каждая двухцепочечная молекула ДНК разрезается в фиксированной точке в пределах перекрестной области сайта узнавания, высвобождая гидроксильную группу дезоксирибозы , в то время как фермент рекомбиназа образует временную ковалентную связь.к фосфату остова ДНК . Эта фосфодиэфирная связь между гидроксильной группой нуклеофильного серина или остатком тирозина сохраняет энергию, которая была затрачена на расщепление ДНК. Энергия, запасенная в этой связи, впоследствии используется для воссоединения ДНК с соответствующей гидроксильной группой дезоксирибозы на другой молекуле ДНК. Таким образом, вся реакция протекает без потребности во внешних богатых энергией кофакторах, таких как АТФ .

Хотя основная химическая реакция одинакова как для тирозиновых, так и для сериновых рекомбиназ, между ними есть некоторые различия. [12] Тирозиновые рекомбиназы, такие как Cre или FLP , расщепляют одну цепь ДНК за раз в точках, расположенных в шахматном порядке на 6-8 п.н., связывая 3'-конец цепи с гидроксильной группой тирозинового нуклеофила (рис. 1). . [13] Обмен цепями затем происходит через промежуточное соединение перекрещенных цепей, аналогичное соединению Холлидея, в котором произошел обмен только одной парой цепей. [14] [15]

Механизм и контроль сериновых рекомбиназ изучены гораздо хуже. Эта группа ферментов была открыта только в середине 1990-х годов и до сих пор остается относительно небольшой. Теперь уже классические члены гамма-дельта и резольваза Tn3 , а также новые дополнения, такие как интегразы φC31-, Bxb1- и R4, разрезают все четыре цепи ДНК одновременно в точках, разнесенных на 2 п.н. (Рис. 2). [16] Во время расщепления связь белок-ДНК образуется посредством реакции переэтерификации , в которой фосфодиэфирная связь заменяется фосфосериновой связью между 5'-фосфатом в сайте расщепления и гидроксильной группой консервативного остатка серина (S10 в резольваза). [17] [18]

Рис. 3A. Обратимое введение и удаление с помощью системы Cre-lox.
Рис. 3B. Инверсия по системе Cre-lox.

До сих пор не совсем ясно, как происходит обмен цепей после расщепления ДНК. Однако было показано, что цепи обмениваются, будучи ковалентно связанными с белком, с результирующим чистым вращением на 180 °. [19] [20] Наиболее цитируемой (но не единственной) моделью, объясняющей эти факты, является «модель вращения субъединиц» (рис. 2). [12] [21]Независимо от модели, дуплексы ДНК расположены за пределами белкового комплекса, и для достижения обмена цепями необходимо большое перемещение белка. В этом случае сайты рекомбинации слегка асимметричны, что позволяет ферменту различать левый и правый концы сайта. При создании продуктов левые концы всегда присоединяются к правым концам сайтов-партнеров, и наоборот. Это вызывает воссоздание различных сайтов рекомбинации в продуктах рекомбинации. Соединение левых концов с левым или справа направо избегается из-за асимметричной последовательности «перекрытия» между смещенными точками обмена верхней и нижней цепей, что резко контрастирует с механизмом, используемым тирозиновыми рекомбиназами. [12]

Реакция, катализируемая Cre-рекомбиназой, например, может привести к вырезанию сегмента ДНК, фланкированного двумя сайтами (рис. 3A), но также может привести к интеграции или инверсии ориентации фланкированного сегмента ДНК (рис. 3B). ). Результат реакции определяется в основном относительным расположением и ориентацией сайтов, которые должны быть рекомбинированы, но также и врожденной специфичностью рассматриваемой сайт-специфической системы. Вырезания и инверсии происходят, если рекомбинация происходит между двумя сайтами, которые находятся на одной и той же молекуле (внутримолекулярная рекомбинация), и если сайты находятся в одной и той же (прямой повтор) или в противоположной ориентации (инвертированный повтор), соответственно. Вставки же,имеет место, если рекомбинация происходит на сайтах, которые расположены на двух разных молекулах ДНК (межмолекулярная рекомбинация), при условии, что хотя бы одна из этих молекул является кольцевой. Большинство сайт-специфичных систем являются узкоспециализированными, катализирующими только один из этих различных типов реакции, и эволюционировали, чтобы игнорировать сайты, которые находятся в «неправильной» ориентации.

См. Также [ править ]

  • Cre рекомбиназа
  • Cre-Lox рекомбинация
  • Рекомбинация FLP-FRT
  • Генетическая рекомбинация
  • Гомологичная рекомбинация
  • Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой
  • Технология сайт-специфической рекомбиназы

Ссылки [ править ]

  1. ^ Боде, J; Schlake, T; асадасасада Ибер, М; Schuebeler, D; Сейблер, Дж; Снежков, Э; Николаев, Л (2000). «Набор инструментов трансгенетика: новые методы целевой модификации геномов эукариот». Биол. Chem . 381 (9–10): 801–813. DOI : 10.1515 / BC.2000.103 . PMID  11076013 . S2CID  36479502 .
  2. Перейти ↑ Kolb, AF (2002). «Геномная инженерия с использованием сайт-специфичных рекомбиназ». Клонирование и стволовые клетки . 4 (1): 65–80. DOI : 10.1089 / 153623002753632066 . PMID 12006158 . 
  3. ^ Коутс, CJ; Камински, JM; Саммерс, JB; Сигал, диджей; Миллер, AD; Колб, АФ (2005). «Сайт-направленная модификация генома: производные ферментов, модифицирующих БАЛ, как инструменты нацеливания» (PDF) . Тенденции в биотехнологии . 23 (8): 407–19. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2005.06.009 . PMID 15993503 . Архивировано из оригинального (PDF) 29 августа 2006 года.  
  4. ^ Зауэр, Б. (1998). «Индуцибельное нацеливание на гены у мышей с использованием Cre / loxSystem» (PDF) . Методы . 14 (4): 381–92. DOI : 10,1006 / meth.1998.0593 . PMID 9608509 . Архивировано из оригинального (PDF) 11.06.2011.  
  5. Перейти ↑ Nash, HA (1996). Сайт-специфическая рекомбинация: интеграция, вырезание, разрешение и инверсия определенных сегментов ДНК. Escherichia coli и Salmonella: клеточная и молекулярная биология , 2, стр. 2363–2376.
  6. ^ Акопян, А .; Старк, WM (2005). Сайт-специфичные рекомбиназы ДНК как инструменты геномной хирургии . Успехи в генетике. 55 . С. 1–23. DOI : 10.1016 / S0065-2660 (05) 55001-6 . ISBN 978-0-12-017655-7. PMID  16291210 .
  7. ^ Лэнди, A. (1989). «Динамические, структурные и регуляторные аспекты лямбда-сайт-специфической рекомбинации». Ежегодный обзор биохимии . 58 (1): 913–41. DOI : 10.1146 / annurev.bi.58.070189.004405 . PMID 2528323 . 
  8. ^ Старк, WM; Букок, MR (1995). «Топологическая селективность в сайт-специфической рекомбинации». Мобильные генетические элементы . Издательство Оксфордского университета. С. 101–129.
  9. ↑ Абдель-Мегид, СС; Гриндли, Северная Дакота; Темплтон, штат Нью-Йорк; Steitz, TA (апрель 1984 г.). «Расщепление сайт-специфической рекомбинации белка гамма-дельта-резольвазой: меньший из двух фрагментов специфически связывает ДНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 81 (7): 2001–5. Bibcode : 1984PNAS ... 81.2001A . DOI : 10.1073 / pnas.81.7.2001 . PMC 345424 . PMID 6326096 .  
  10. ^ Ян, Вт .; Стейтц, Т.А. (1995). «Кристаллическая структура сайт-специфической рекомбиназы гамма-дельта-резольвазы в комплексе с сайтом расщепления 34 п.н.». Cell . 82 (2): 193–207. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (95) 90307-0 . PMID 7628011 . S2CID 15849525 .  
  11. ^ Li, W .; Камтекар, S; Xiong, Y; Саркис, Г.Дж.; Гриндли, Северная Дакота; Стейтц, Т.А. (2005). «Структура тетрамера синаптической гамма-дельта-резолвазы, ковалентно связанного с двумя расщепленными ДНК». Наука . 309 (5738): 1210–5. Bibcode : 2005Sci ... 309.1210L . DOI : 10.1126 / science.1112064 . PMID 15994378 . S2CID 84409916 .  
  12. ^ a b c Turan, S .; Боде, Дж. (2011). «Обзор: сайт-специфические рекомбиназы: от геномных модификаций на основе тегов и мишеней до модификаций на основе тегов и обмена». FASEB J . 25 (12): 4088–4107. DOI : 10.1096 / fj.11-186940 . PMID 21891781 . 
  13. ^ Ван Duyne, GD (2002). «Структурный вид сайт-специфической рекомбинации тирозин-рекомбиназы». Мобильная ДНК II . ASM Press. С. 93–117.
  14. ^ Холлидей, Р. (1964). «Механизм преобразования генов в грибах» (PDF) . Генетические исследования . 5 (2): 282–304. DOI : 10.1017 / S0016672300001233 .
  15. ^ Grainge, I .; Джаярам, ​​М. (1999). «Интегразное семейство рекомбиназ: организация и функция активного сайта» . Молекулярная микробиология . 33 (3): 449–56. DOI : 10.1046 / j.1365-2958.1999.01493.x . PMID 10577069 . 
  16. ^ Старк, WM; Boocock, MR; Шеррат, DJ (1992). «Катализ сайт-специфическими рекомбиназами». Тенденции в генетике . 8 (12): 432–9. DOI : 10.1016 / 0168-9525 (92) 90327-Z . PMID 1337225 . 
  17. ^ Рид, RR; Гриндли, Н.Д. (1981). «Опосредованная транспозоном сайт-специфическая рекомбинация in vitro: расщепление ДНК и связывание белок-ДНК в сайте рекомбинации». Cell . 25 (3): 721–8. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (81) 90179-3 . PMID 6269756 . S2CID 28410571 .  
  18. ^ Рид, RR; Мозер, CD (1984). «Промежуточные продукты рекомбинации, опосредованной резолвазой, содержат остаток серина, ковалентно связанный с ДНК». Колд Спринг Харб Symp Quant Biol . 49 : 245–9. DOI : 10.1101 / sqb.1984.049.01.028 . PMID 6099239 . 
  19. ^ Старк, МВт; Шеррат, диджей; Букок, MR (1989). «Сайт-специфическая рекомбинация резольвазой Tn 3: топологические изменения в прямой и обратной реакциях». Cell . 58 (4): 779–90. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (89) 90111-6 . PMID 2548736 . S2CID 46508016 .  
  20. ^ Старк, WM; Букок, MR (1994). «Изменение сцепления реакции завязывания узлов, катализируемой Tn3 Resolvase». Журнал молекулярной биологии . 239 (1): 25–36. DOI : 10.1006 / jmbi.1994.1348 . PMID 8196046 . 
  21. ^ Саркис, GJ; Мерли, LL; Leschziner, AE; Boocock, MR; Старк, ВМ; Гриндли, Северная Дакота (2001). «Модель синаптического комплекса гамма-дельта-резольваза». Молекулярная клетка . 8 (3): 623–31. DOI : 10.1016 / S1097-2765 (01) 00334-3 . PMID 11583624 .