В генетике , Flp- FRT рекомбинации является сайт-направленный рекомбинации технологии, все шире используется для манипулирования ДНК организма при контролируемых условиях в естественных условиях . Она аналогична твор- LOX рекомбинации , но включает в себя рекомбинацию последовательностей между мишенью распознавания короткого флиппазы ( FRT ) сайтами с помощью рекомбиназы флиппазов ( Flp ) , полученных из 2 μ плазмиды пекарских дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE .
Сайт-специфическая рекомбиназа Flp | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Идентификаторы | ||||||
Организм | ||||||
Символ | FLP1 | |||||
UniProt | P03870 | |||||
|
Последовательность минимального сайта FRT из 34 пар оснований имеет последовательность
- 5 'GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC3 '
для которых флиппаза (Flp) связывается с обоими плечами 5'-GAAGTTCCTATTC-3 'из 13 п.н., фланкирующими спейсер из 8 п.н., т.е. сайт-специфическая рекомбинация (область кроссовера) в обратной ориентации. FRT- опосредованное расщепление происходит сразу перед асимметричной коровой областью 8 п.н. ( 5 'tctagaaa3 ' ) на верхней пряди и за этой последовательностью на нижней пряди. [1] Существует несколько вариантов сайтов FRT , но рекомбинация обычно может происходить только между двумя идентичными FRT, но обычно не между неидентичными («гетероспецифическими») FRT . [2] [3]
Биологическая функция
У дрожжей этот фермент корректирует уменьшение числа копий плазмиды 2 мкм, вызванное редкими случаями неправильной сегрегации. Это происходит за счет рекомбинации между двумя перевернутыми повторами на плазмиде 2 мкм во время репликации ДНК . Это изменяет направление одной репликационной вилки, вызывая несколько раундов копирования за одно инициирование. [4]
Мутации последовательности сайта FRT
Senecoff et al. (1987) исследовали, как нуклеотидные замены в FRT влияют на эффективность FLP-опосредованной рекомбинации. Авторы индуцировали замены оснований в одном или обоих сайтах FRT и тестировали концентрацию FLP, необходимую для наблюдения сайт-специфических рекомбинаций. Каждую замену оснований выполняли на каждом из тринадцати нуклеотидов в пределах сайта FRT (пример G на A, T и C). Во-первых, авторы показали, что большинство мутаций в последовательности FRT вызывают минимальные эффекты, если присутствуют только в одном из двух сайтов. Если мутации произошли в обоих сайтах, эффективность FLP резко снижается. Во-вторых, авторы предоставили данные о том, какие нуклеотиды наиболее важны для связывания FLP и эффективности сайт-специфической рекомбинации. Если первый нуклеотид в обоих сайтах FRT заменен на цитозин (с G на C), третий нуклеотид заменен на тимин (от A до T) или седьмой нуклеотид заменен на аденозин (с G на A), тогда Эффективность FLP-опосредованной сайт-специфической рекомбинации снижается более чем в 100 раз. [5] В то время как замена основания любого из вышеупомянутых нуклеотидов только в одном из сайтов FRT приводила к десятикратному, десятикратному и пятикратному снижению эффективности, соответственно. [5]
Замены оснований в нуклеотидах, начисленных с заглавной буквы, привели к наибольшему снижению FLP-опосредованной сайт-специфической рекомбинации (мутант дикого типа x и мутант x мутант):
- 5 'GaAtagGaacttc3 ' [5]
Многие доступные конструкции включают дополнительные последовательности плеч (5'-GAAGTTCCTATTCC-3 ') на одну пару оснований от предшествующего элемента и в той же ориентации:
- 5 'GAAGTTCCTATTC c GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC3 '
Этот сегмент необязателен для удаления, но необходим для интеграции, включая опосредованный рекомбиназой обмен кассет . [6]
Поскольку активность рекомбинации может быть нацелена на выбранный орган или низкий уровень активности рекомбинации может использоваться для последовательного изменения ДНК только подмножества клеток, Flp- FRT можно использовать для построения генетической мозаики в многоклеточных организмах. Используя эту технологию , потерю или изменение гена можно изучить в данном интересующем органе-мишени, даже в тех случаях, когда экспериментальные животные не пережили бы потерю этого гена в других органах ( пространственный контроль ). Эффект изменения гена также можно изучить с течением времени, используя индуцибельный промотор для запуска рекомбинации на поздних стадиях развития ( временной контроль ) - это предотвращает изменение.
Биохимическая структура Флп и механизм действия
Биохимически релевантная структура и активный сайт
Белок Flp, как и Cre, представляет собой сайт-специфичную рекомбиназу семейства тирозина. [7] Это семейство рекомбиназ выполняет свою функцию через механизм топоизомеразы типа IB, вызывая рекомбинацию двух отдельных цепей ДНК. [7] Рекомбинация осуществляется повторяющимся двухэтапным процессом. Первый шаг вызывает создание промежуточного звена Холлидея . Второй шаг способствует результирующей рекомбинации двух комплементарных цепей. Как следует из их фамилии, высококонсервативный нуклеофил тирозина расщепляет нити ДНК. [7] Нуклеофильные свойства тирозина атакуют и связываются с 3'-фосфатом в точке расщепления ДНК. [7] Образовавшаяся 5'-гидроксильная группа расщепленной ДНК действует как нуклеофил и атакует 3'-фосфат на комплементарно расщепленной цепи ДНК, что приводит к успешной рекомбинации. [7] Помимо остатка тирозина, существует консервативная каталитическая пентада. Эта пентада состоит из лизина (Lysβ), двух аргининов (Arg I и II), гистидина (His-II) и гистидина / триптофана (His / Trp-III), который составляет обязательную и высококонсервативную совокупность остатки активного центра Flp и Cre (наряду с другими топиосомеразами IB). [7] Эти другие остатки имеют решающее значение для правильной ориентации связывания Flp и позиционирования на нитях ДНК.
Применение FLP-опосредованной сайт-специфической рекомбинации
Начальные проблемы
Термолабильность
Первоначальное применение рекомбиназы FLP-FRT не помогло у млекопитающих. Белок FLP был термолабильным (денатурировался при повышенных температурах) и поэтому не использовался в модели на млекопитающих из-за повышенных температур тела этих модельных систем. Однако из-за патентов и ограничений на использование рекомбинации Cre-Lox был проявлен большой интерес к производству более термостабильной кассеты FLP-FRT. Некоторые из первых результатов были получены Buchholz et al. (1997) с использованием циклического мутагенеза в Escherichia coli . В своих исследованиях авторы трансфицировали клетки E. coli двумя плазмидами: одна кодирует случайно мутированные белки FLP ниже промотора арабинозы, а другая содержит промотор гена lacZ в кассете FRT. Кишечная палочка выращивала на арабинозах пластин при 37 ° C и 40 ° C, и , если произошла рекомбинация, выражение LacZ будет ослаблено, и колония будет казаться белой. Белые колонии отбирали из каждого поколения и выращивали на новых чашках с арабинозой при прежних температурах в течение восьми поколений. [8] После рекомбинации была подтверждена вестерн-блоттинга и мутированных генов FLP были секвенированы, это е ighth поколение FLP белка (FLPe) трансфицировали в культуре клеток млекопитающих, и рекомбинации в клетках млекопитающих был подтвержден. [8] Этот вариант FLP имеет только 4 аминокислотные замены: P2S, L33S, Y108N и S294P.
Генерация генетической мозаики
Генетический мозаицизм возникает в организме, когда похожие типы клеток выражают разные фенотипы из-за разных генотипов в определенных локусах. Проще говоря, это происходит, когда один организм содержит разные генотипы, что обычно бывает редко в природе. Однако это можно легко (и проблематично) получить с помощью рекомбинации FLP-FRT. Если в клетке присутствуют два разных сайта FRT и FLP присутствует в соответствующих концентрациях, кассета FRT будет продолжать вырезаться и вставляться между двумя сайтами FRT. Этот процесс будет продолжаться до тех пор, пока белки FLP не упадут ниже требуемых концентраций, в результате чего клетки внутри организма будут обладать разными генотипами. [9] Это было замечено от дрозофилы до мышей и неизбирательно по отдельным хромосомам (соматическим и половым) или типам клеток (соматическим и зародышевым). [9] [10]
Определение клеточных линий
До публикации Dymecki et al . (1998), рекомбиназа Cre была использована для картирования клеточных судеб предшественников нейронов у мышей с использованием промотора En2 . [11] Таким образом, авторы Dymecki et al . (1998) предположили, что рекомбиназа FLP может использоваться аналогичным образом с такой же эффективностью, как рекомбиназа Cre у мышей. Авторы создали две линии трансгенных мышей: линию слияния нейронов Wnt1 :: Flp и линию, которая обладала кассетой FRT, фланкирующей 18-й экзон tm1Cwr . [9] Авторы выбрали этот экзон для иссечения, потому что его удаление приводит к нулевому фенотипу. Авторы скрестили две линии и позволили потомству достичь взрослого состояния до того, как потомство было умерщвлено. Экстракцию РНК проводили на нейрональной, мышечной, кишечной ткани и ткани хвоста. ПЦР с обратной транскрипцией и нозерн-блоттинг подтвердили удаление 18-го экзона tm1Cwr в больших количествах в ткани мозга и умеренно в мышечной ткани (из-за клеток Scwhann в мышцах). Как и ожидалось, в других тканях иссечения не наблюдалось. Авторы увидели равную, если не лучшую, эффективность рекомбиназы FLP в определении судьбы клеток по сравнению с рекомбиназой Cre.
У Drosophila melanogaster (плодовая муха)
К настоящему времени рекомбиназа Flp использовалась много раз у D. melanogaster. Сравнение рекомбиназы Flp с рекомбиназой Cre у D. melanogaster было опубликовано Frickenhaus et al. (2015) [12] . Авторы Frickenhaus et al. (2015) преследовали двоякую цель: охарактеризовать и сравнить эффективность «нокаута» рекомбиназы Flp с «нокаутом» рекомбиназы Cre и нокаутом РНКи и выявить функцию cabeza (caz), ортолога мух для FUS , в нейронах и мышечной ткани D. melanogaster . FUS сильно вовлечен в боковой амиотрофический склероз (БАС) и лобно-височную деменцию у людей [12] . Авт. Использовали систему elav - Gal4 / UAS -Flp или Cre для специфической экспрессии рекомбиназы в нейронах и систему Mef2 -Gal4 / UAS-Flp или Cre для специфической экспрессии ее в мышцах. [12] Авторы приходят к выводу, что инструмент «нокаута» рекомбиназы Flp более эффективен, чем рекомбиназа РНКи и Cre, для нокаута специфических генов в определенных тканях или клеточных линиях из-за отсутствия утечки экспрессии, наблюдаемой в обоих белок Cre и транскрипт РНКи. Кроме того, авторы стали свидетелями токсичности для белка Cre, которая не наблюдается у белка Flp. [12]
In Danio rerio (Рыбка-данио)
Эффективность системы рекомбиназы FLPe оценивалась на рыбках данио Wong et al . (2009). [13] Эмбрионы, которые были гемизиготными по FRT-фланкированному усиленному зеленому флуоресцентному белку (EGFP) ниже мышечно-специфического промотора, инъецировали белок FLPe. Без FLPe эти эмбрионы должны экспрессировать EGFP во всей мышечной ткани, и при скрещивании с цепью дикого типа 50% полученного потомства также должны экспрессировать EGFP в мышечной ткани. Эмбрионы, которым инъецировали FLPe, имели значительно сниженную экспрессию EGFP в мышечной ткани, также наблюдался мозаицизм. [13] Когда эти эмбрионы достигли зрелого возраста, они были скрещены со штаммом дикого типа, и полученные кладки дали значительно меньшее количество потомства, которое экспрессировало EGFP в мышечной ткани (0-4%). [13] Эти результаты показывают, что FLPe высокоэффективен не только в соматических клетках, но и в зародышевой линии рыбок данио, а также
В растениях
Создание «фитосенсоров» или «часовых» у Arabidopsis thaliana и табака.
Фитосенсоры - это генетически модифицированные растения, которые могут сообщать о наличии биотических или абиотических загрязнителей. [14] Очевидно, что производство этих инженерных растений имеет большие перспективы для сельского хозяйства и лабораторий. Однако создание подходящего репортерного вектора оказалось проблематичным. цис -регуляторные элементы играют важную роль в активации транскрипции генов у растений, и многие из них не совсем понятны. Многие фитосенсоры либо недостаточно экспрессируют свои репортерные гены, либо сообщают о ложноположительных результатах из-за синтетических промоторов. [14] Авторы Rao et al. (2010) использовали инструмент рекомбиназы FLP для производства высокоэффективных фитосенсоров. Авторы использовали промотор теплового шока для индукции продукции FLP, в то время как вектор, фланкированный FRT, отделял промотор 35S CaMV от гена бета-глюкуронидазы (GUS). Когда растения подвергались тепловому шоку, индукция FLP приводила к удалению вектора, фланкированного FRT, эффективно перемещая ген GUS непосредственно ниже промотора 35S CaMV. Активация GUS привела к тому, что листья растений изменили цвет с зеленого на синий; таким образом, фитосенсор эффективно сообщает о стрессе модельной системе! [14]
С Cre-рекомбиназой
Производство экспрессирующей системы индуцибельной MiRNA (GRIM), готовой к работе
РНК-интерференция (РНКи) вызвала сдвиг парадигмы в экспрессии генов и потенциальные нокауты генов у эукариот. До создания системы экспрессии GRIM создание векторов РНКи было дорогостоящим и требовало много времени. Векторы были получены традиционным методом молекулярного клонирования методом копирования и вставки. [15] Гарвик-Коппенс и др . (2011) разработали гораздо более эффективный метод получения векторов РНКи, в которых экспрессия РНКи может быть выбита с помощью Cre-рекомбиназы и подавлена с помощью Flp-рекомбиназы. Новая система экспрессии GRIM позволяет гораздо быстрее генерировать векторы экспрессии, содержащие конструкции искусственной РНКи. [15] Далее авторы показали, что их система экспрессии довольно эффективно работает в клетках эмбриональных почек человека (HEK), обычной иммортализованной клеточной линии человека в молекулярных исследованиях.
Смотрите также
- Технология сайт-специфической рекомбиназы
- Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой
- Cre рекомбиназа
- Cre-Lox рекомбинация
- Генетическая рекомбинация
- Гомологичная рекомбинация
Рекомендации
- ^ Zhu XD, Садовский PD (сентябрь 1995). «Зависимое от расщепления лигирование рекомбиназой FLP. Характеристика мутантного белка FLP с изменением каталитической аминокислоты» . Журнал биологической химии . 270 (39): 23044–54. DOI : 10.1074 / jbc.270.39.23044 . PMID 7559444 .
- ^ Шлейк Т., Боде Дж. (Ноябрь 1994 г.). «Использование мутировавших сайтов-мишеней распознавания FLP (FRT) для обмена кассет экспрессии в определенных хромосомных локусах». Биохимия . 33 (43): 12746–51. DOI : 10.1021 / bi00209a003 . PMID 7947678 .
- ^ Туран С., Кюле Дж., Шамбах А., Баум С., Боде Дж. (Сентябрь 2010 г.). «Мультиплексирование RMCE: универсальные расширения технологии обмена кассет, опосредованной Flp-рекомбиназой». Журнал молекулярной биологии . 402 (1): 52–69. DOI : 10.1016 / j.jmb.2010.07.015 . PMID 20650281 .
- ^ Рейнольдс AE, Мюррей AW, Szostak JW (октябрь 1987 г.). «Роли генных продуктов размером 2 микрона в стабильном поддержании плазмиды 2 микрона Saccharomyces cerevisiae» . Молекулярная и клеточная биология . 7 (10): 3566–73. DOI : 10.1128 / mcb.7.10.3566 . PMC 368010 . PMID 3316982 .
- ^ а б в Сенекофф Дж. Ф., Россмейсл П. Дж., Кокс М. М. (май 1988 г.). «Распознавание ДНК рекомбиназой FLP дрожжевой плазмиды 2 mu. Мутационный анализ сайта связывания FLP». Журнал молекулярной биологии . 201 (2): 405–21. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (88) 90147-7 . PMID 3047402 .
- ^ Туран С., Боде Дж. (Декабрь 2011 г.). «Сайт-специфичные рекомбиназы: от геномных модификаций на основе меток и мишеней до модификаций на основе меток и обмена». Журнал FASEB . 25 (12): 4088–107. DOI : 10.1096 / fj.11-186940 . PMID 21891781 .
- ^ а б в г д е Ma CH, Kwiatek A, Bolusani S, Voziyanov Y, Jayaram M (апрель 2007 г.). «Выявление скрытого каталитического вклада консервативного His / Trp-III в тирозиновые рекомбиназы: сборка нового активного сайта в рекомбиназе Flp, несущего аланин в этом положении» . Журнал молекулярной биологии . 368 (1): 183–96. DOI : 10.1016 / j.jmb.2007.02.022 . PMC 2002523 . PMID 17367810 .
- ^ а б Бухгольц Ф., Ангранд П.О., Стюарт А.Ф. (июль 1998 г.). «Улучшенные свойства рекомбиназы FLP, полученные за счет циклического мутагенеза». Природа Биотехнологии . 16 (7): 657–62. DOI : 10.1038 / nbt0798-657 . PMID 9661200 . S2CID 21298037 .
- ^ а б в Dymecki SM, Tomasiewicz H (сентябрь 1998 г.). «Использование Flp-рекомбиназы для характеристики экспансии Wnt1-экспрессирующих нейральных предшественников у мышей». Биология развития . 201 (1): 57–65. DOI : 10,1006 / dbio.1998.8971 . PMID 9733573 .
- ^ Голич М.М., Ронг Ю.С., Петерсен Р.Б., Линдквист С.Л., Голич К.Г. (сентябрь 1997 г.). «FLP-опосредованная мобилизация ДНК к определенным сайтам-мишеням в хромосомах дрозофилы» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (18): 3665–71. DOI : 10.1093 / NAR / 25.18.3665 . PMC 146935 . PMID 9278488 .
- ^ Зиник Д.Л., Мерсер Э.Х., Харрис Э., Андерсон Д.Д., Джойнер А.Л. (май 1998 г.). «Картирование судьбы сужения среднего и заднего мозга мышей с использованием системы сайт-специфической рекомбинации» . Текущая биология . 8 (11): 665–8. DOI : 10.1016 / S0960-9822 (98) 70255-6 . PMID 9635195 .
- ^ а б в г Frickenhaus M, Wagner M, Mallik M, Catinozzi M, Storkebaum E (март 2015 г.). «Высокоэффективная инактивация гена, специфичного для клеточного типа, выявляет ключевую функцию cabeza гомолога FUS Drosophila в нейронах» . Научные отчеты . 5 : 9107. DOI : 10.1038 / srep09107 . PMC 5390904 . PMID 25772687 .
- ^ а б в Wong AC, Draper BW, Van Eenennaam AL (апрель 2011 г.). «Функции FLPe в эмбрионах рыбок данио» . Трансгенные исследования . 20 (2): 409–15. DOI : 10.1007 / s11248-010-9410-9 . PMC 3051101 . PMID 20552273 .
- ^ а б в Рао М.Р., Мун Х.С., Шенк TM, Беккер Д., Мазарей М., Стюарт К.Н. (13 сентября 2010 г.). «Рекомбинация FLP / FRT из дрожжей: применение кассетной схемы с двумя генами в качестве индуцибельной системы у растений» . Датчики . 10 (9): 8526–35. DOI : 10.3390 / s100908526 . PMC 3231192 . PMID 22163670 .
- ^ а б Garwick-Coppens SE, Herman A, Harper SQ (ноябрь 2011 г.). «Конструирование постоянно индуцируемых экспрессионных векторов на основе miRNA с использованием сайт-специфичных рекомбиназ» . BMC Biotechnology . 11 : 107. DOI : 10,1186 / 1472-6750-11-107 . PMC 3252340 . PMID 22087765 .
Внешние ссылки
- Рекомбиназа Flp-FRT: механизм действия
- Видео об использовании рекомбиназы Flp-FRT в фоторецепторе D. melanoster
- Применение ФЛП в мутатогенезе холерного вибриона