Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Технологии сайт-специфической рекомбиназы - это инструменты геномной инженерии , которые зависят от ферментов рекомбиназы для замены целевых участков ДНК.

История [ править ]

В конце 1980-х гг. Нацеливание на гены в эмбриональных стволовых клетках мыши (ESC) сделало возможным передачу мутаций в зародышевую линию мыши и стало новым вариантом для изучения генетической основы регуляторных сетей, существующих в геноме. Тем не менее, классическое нацеливание на геныоказался ограниченным по нескольким причинам, поскольку функции гена были необратимо разрушены маркером, который должен был быть введен для отбора рекомбинантных ESC. Эти первые шаги привели к появлению животных, у которых мутация присутствовала во всех клетках тела с самого начала, что привело к сложным фенотипам и / или ранней летальности. Существовала явная потребность в методах ограничения этих мутаций определенными точками развития и конкретными типами клеток. Эта мечта стала реальностью, когда группы в США смогли ввести бактериофаги и дрожжевые системы сайт-специфической рекомбинации (SSR-) в клетки млекопитающих, а также в мыши. [1] [2] [3]

Классификация, свойства и специальные приложения [ править ]

Общие стратегии генной инженерии требуют постоянной модификации целевого генома. С этой целью необходимо приложить немало усилий для разработки маршрутов доставки трансгенов. Хотя для биотехнологических целей случайная интеграция все еще распространена, она может привести к непредсказуемой экспрессии генов из-за переменного числа копий трансгена, отсутствия контроля над сайтами интеграции и связанных мутаций. Молекулярные требования в области стволовых клеток намного строже. Здесь гомологичная рекомбинация(HR) может, в принципе, обеспечивать специфичность процесса интеграции, но для эукариот это скомпрометировано из-за чрезвычайно низкой эффективности. Хотя мегануклеазы, эффекторные нуклеазы типа цинковых пальцев и активатора транскрипции (ZFN и TALEN) являются реальными инструментами, поддерживающими HR, именно доступность сайт-специфичных рекомбиназ (SSR) запустила рациональное построение клеточных линий с предсказуемыми свойствами. В настоящее время обе технологии, HR и SSR, могут быть объединены в высокоэффективные «технологии tag-and-exchange». [4]

Было идентифицировано множество систем сайт-специфической рекомбинации для выполнения этих перестроек ДНК для различных целей, но почти все они принадлежат к любому из двух семейств, тирозин-рекомбиназ (YR) и сериновых рекомбиназ (SR), в зависимости от их механизма . Эти два семейства могут опосредовать до трех типов перестройки ДНК (интеграция, вырезание / разрешение и инверсия) по различным маршрутам реакции в зависимости от их происхождения и архитектуры. [5]

Tyr- и Ser-SSR прокариот (фаги; серый цвет) и эукариот (дрожжи; коричневый цвет); полный обзор (включая ссылки) можно найти в [6]

Членом-основателем семейства YR является лямбда-интеграза , кодируемая бактериофагом λ , что позволяет интегрировать ДНК фага в бактериальный геном. Общей чертой этого класса является консервативный нуклеофил тирозина, атакующий расщепляющийся ДНК-фосфат с образованием 3'-фосфотирозиновой связи. Ранними членами семейства SR являются тесно связанные резольваза  /  ДНК-инвертазы из бактериальных транспозонов Tn3 и γδ, которые полагаются на каталитический серин, ответственный за атаку ножничного фосфата с образованием 5'-фосфосериновой связи. Эти неоспоримые факты, однако, были скомпрометированы из-за большой путаницы, когда на сцену вышли другие члены, например рекомбиназы YR Cre и Flp.(способные к интеграции, вырезанию / разрешению, а также к инверсии), которые, тем не менее, приветствовались как новые члены «семейства интегразы». Обратными примерами являются PhiC31 и родственные им SR, которые первоначально были введены как резольваза / инвертазы, хотя в отсутствие вспомогательных факторов их единственной функцией является интеграция. В настоящее время стандартная активность каждого фермента определяет его классификацию, оставляя за собой общий термин «рекомбиназа» для членов семейства, которые, по сути, включают все три пути, INT, RES и INV:

Наша таблица расширяет выбор обычных систем SSR и группирует их в соответствии с их характеристиками. Все эти ферменты рекомбинируют два сайта-мишени, которые либо идентичны (подсемейство A1), либо различаются (ферменты фагового происхождения в A2, B1 и B2). [6] В то время как для A1 эти сайты имеют индивидуальные обозначения (« FRT » в случае Flp-рекомбиназы, loxP для Cre-рекомбиназы), термины « att P» и « att B» (сайты прикрепления на фаговой и бактериальной части, соответственно) действительны в остальных случаях. В случае подсемейства A1 мы имеем дело с короткими (обычно 34 п.н.) сайтами, состоящими из двух (почти) идентичных плеч по 13 п.н. (стрелки), фланкирующих спейсер 8 п.н. (область кроссовера, обозначенная дублетами красной линией).[7] Обратите внимание, что для Flp существует альтернативный сайт из 48 пар оснований, доступный с тремя ветвями, каждое из которых вмещает единицу Flp (так называемый «протомер»). Сайты att P и att B подчиняются схожим архитектурным правилам, но здесь рукава демонстрируют лишь частичную идентичность (обозначенную пунктирными линиями) и различаются в обоих случаях. Эти особенности объясняют существенные различия:

  • рекомбинация двух идентичных сайтов эдукта приводит к сайтам продуктов с одинаковым составом, хотя они содержат ответвления от обоих субстратов; эти преобразования обратимы;
  • в случае att P x att B рекомбинационные кроссоверы могут происходить только между этими комплементарными партнерами в процессах, которые необратимо приводят к двум различным продуктам ( att P x att B → att R + att L).

Чтобы упростить эту главу, следующие реализации будут сосредоточены на двух рекомбиназах (Flp и Cre) и только на одной интегразе (PhiC31), поскольку их спектр охватывает инструменты, которые в настоящее время в основном используются для направленных модификаций генома. Это будет сделано в рамках следующего обзора.

Паттерны рекомбинации в зависимости от (подсемейства) рекомбиназ и ориентации сайта-мишени. ГОИ, «ген интереса»; [+/-], маркер положительно-отрицательной селекции, такой как ген hygtk-fusion. Обратите внимание, что взаимодействие двух идентичных сайтов субстрата (loxP x loxP или FRT x FRT) приводит к продуктам одного и того же состава, тогда как рекомбинация двух неидентичных исходных продуктов приводит к двум различным гибридным сайтам (attP x attB → attR + attL)

Пути реакции [ править ]

Интеграция режима / разрешение и инверсии (INT / RES и INV) зависят от ориентации мишени рекомбиназы сайтов (РТС), среди этих пар Att Р и Att В. Секция C показывают, в обтекаемой моде, способ рекомбиназы-опосредованный Замена кассет (RMCE) может быть достигнута с помощью синхронных двусторонних кроссоверов (а не интеграции с последующим разрешением). [8] [9]

Тир-рекомбиназы обратимы, а Сер-интеграза однонаправлена. Следует отметить способ, которым обратимая интеграция / разрешение Flp (Tyr-рекомбиназы) модулируется 48 п.н. (вместо минимальных 34 п.н.) версиями FRT : дополнительные 13 п.н. служат в качестве «посадочного пути» Flp, способствующего формированию синаптический комплекс, как в контексте функций Flp-INT, так и Flp-RMCE (см. соответствующие ситуации равновесия). Хотя едва ли возможно предотвратить (управляемую энтропией) реверсию интеграции в разделе A для Cre и трудно достичь для Flp, RMCE может быть завершен, если донорская плазмида предоставляется в избытке из-за бимолекулярного характера обеих прямых - и обратная реакция. Позирует как FRTСайты обратным образом приведут к равновесию обеих ориентаций вставки (зеленая стрелка). В отличие от Flp, Ser-интеграза PhiC31 (нижние изображения) приводит к однонаправленной интеграции, по крайней мере, в отсутствие фактора направленности рекомбиназы (RDF-). [10] По сравнению с Flp-RMCE, для которого требуются два разных («гетероспецифических») мутанта-спейсера FRT, партнер по реакции ( att B) первого реагирующего сайта att P поражается произвольно, так что нет контроля над направлением донорская кассета попадает в мишень (см. альтернативные продукты). Также отличается от Flp-RMCE, несколько различных мишеней RMCE не могут быть установлены параллельно из-за отсутствия гетероспецифических (не перекрестно взаимодействующих) комбинаций att P / att B.

Cre рекомбиназа [ править ]

Cre-рекомбиназа (Cre) способна рекомбинировать определенные последовательности ДНК без использования кофакторов . Фермент распознает последовательности ДНК из 34 пар оснований, называемых loxP («локус кроссовера в фаге P1»). В зависимости от ориентации сайтов-мишеней относительно друг друга Cre будет интегрировать / вырезать или инвертировать последовательности ДНК. После иссечения (называемого «разрешением» в случае кольцевого субстрата) определенной области ДНК нормальная экспрессия гена значительно нарушается или прекращается. [11]

Из-за выраженной разрешающей активности Cre одним из его начальных применений было вырезание lox P-фланкированных («флоксованных») генов, что привело к нокауту клеточно-специфического гена такого флоксованного гена после того, как Cre стал экспрессироваться в интересующей ткани. Современные технологии включают методы, которые позволяют как пространственный, так и временной контроль активности Cre. Обычный метод, облегчающий пространственный контроль генетических изменений, включает выбор тканеспецифического промотора для управления экспрессией Cre. Размещение Cre под контролем такого промотора приводит к локальной тканеспецифичной экспрессии. Например, Leone et al. поместили единицу транскрипции под контроль регуляторных последовательностей миелинаген протеолипидного белка (PLP), приводящий к индуцированному удалению целевых последовательностей генов в олигодендроцитах и шванновских клетках . [12] Специфический фрагмент ДНК, распознаваемый Cre, остается нетронутым в клетках, которые не экспрессируют ген PLP; это, в свою очередь, облегчает эмпирическое наблюдение за локализованными эффектами изменений генома в миелиновой оболочке, окружающей нервные волокна в центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (ПНС). [13] Селективная экспрессия Cre была достигнута также во многих других типах клеток и тканях.

Чтобы контролировать временную активность реакции вырезания, были разработаны формы Cre, которые используют различные домены связывания лиганда . Одна успешная стратегия индукции специфической временной активности Cre включает слияние фермента с мутантным лиганд-связывающим доменом для рецептора эстрогена человека (ERt). После введения тамоксифена ( антагониста рецепторов эстрогена ) конструкция Cre-ERt способна проникать в ядро ​​и вызывать целевую мутацию. ERt связывает тамоксифен с большей аффинностью, чем эндогенные эстрогены , что позволяет Cre-ERt оставаться цитоплазматическим.у животных, не получавших тамоксифена. Временной контроль активности SSR тамоксифеном позволяет индуцировать генетические изменения позже в эмбриогенезе и / или во взрослых тканях. [12] Это позволяет исследователям избежать эмбриональной летальности, продолжая исследовать функцию генов-мишеней.

Недавнее расширение этих общих концепций привело к созданию «Cre-zoo», то есть коллекций сотен линий мышей, для которых определенные гены могут быть удалены с помощью целевой экспрессии Cre. [3]

Унифицированная стратегия "теги и обмен". Стратегия "теги и обмен", основанная на гомологичной рекомбинации (HR; этап тегирования), за которой следует RMCE (SSR; этап обмена). На рисунке показаны аналогичные принципы двойного взаимного кроссовера для HR и RMCE, Основное различие заключается в кардинально разных требованиях к гомологичным последовательностям, которые находятся в диапазоне kb для HR, но всего лишь ~ 50 bp для SSR.

Рекомбиназа Flp [ править ]

В своем естественном хозяине (S. cerevisiae) система Flp / FRT обеспечивает репликацию «плазмиды 2µ» путем инверсии сегмента, который фланкирован двумя идентичными, но противоположно ориентированными сайтами FRT (активность «флиппазы»). Эта инверсия изменяет относительную ориентацию вилок репликации внутри плазмиды, обеспечивая «катящийся круг» - усиление кольцевой 2-микронной составляющей до того, как мультимерные промежуточные соединения разрешатся с высвобождением множества мономерных продуктов. В то время как минимальные участки FRT размером 34 п.н. способствуют удалению / разрешению в такой же степени, как и аналог loxP-сайты для Cre, естественных, более протяженных вариантов FRT размером 48 п.н., обеспечивают более высокую степень интеграции, преодолевая при этом определенные беспорядочные взаимодействия, как описано для фаговых ферментов, таких как Cre- [5] и PhiC31. [6] Дополнительным преимуществом является тот факт, что простые правила могут быть применены для создания гетероспецифических сайтов FRT, которые подвергаются кроссоверам с равными партнерами, но не с FRT дикого типа . Эти факты позволили с 1994 года разрабатывать и непрерывно совершенствовать стратегии обмена кассет, опосредованных рекомбиназой (RMCE-), позволяющие чисто заменять целевую кассету на поступающую донорскую кассету. [6]

Основанный на технологии RMCE, определенный ресурс предварительно охарактеризованных штаммов ES, который поддается дальнейшей разработке, был разработан в рамках программы EUCOMM (Европейский условный мутагенез мышей), основанной на ныне установленных Cre- и / или Flp- основанные на "FlExing" (Flp-опосредованном эксцизии / инверсии) установках [6], включающих эксцизию и инверсию. Этот проект, начатый в 2005 году, в первую очередь был сфокусирован на мутагенезе насыщения, чтобы обеспечить полную функциональную аннотацию генома мыши (координируемый Международным консорциумом нокаут-мышей, IKMC) с конечной целью, чтобы все гены белка были мутированы посредством перехвата генов и нацеливания на мыши ES клетки. [14]Эти усилия знаменуют собой вершину различных стратегий «метки и обмена», которые посвящены метке отдельного геномного сайта, так что «метка» может служить адресом для введения новой (или изменения существующей) генетической информации. Шаг тегирования сам по себе может адресовать определенные классы сайтов интеграции, используя предпочтения интеграции ретровирусов или даже интеграций, специфичных для сайта, таких как PhiC31, которые действуют по существу однонаправленным образом.

Традиционные трудоемкие процедуры «метки и обмена» основывались на двух последовательных стадиях гомологичной рекомбинации (HR-), первая из которых («HR1») предназначена для введения метки, состоящей из гена маркера селекции. Затем «HR2» использовали для замены маркера на «GOI». В первой реакции («нокаут» -) ген был помечен селективным маркером, обычно путем вставки кассеты hygtk ([+/-]). обеспечение устойчивости к G418. На следующем этапе «нокаута» помеченная геномная последовательность была заменена гомологичными геномными последовательностями с определенными мутациями. Затем можно выделить клоны клеток по их устойчивости к ганцикловиру из-за потери гена HSV-tk, т.е. («отрицательный выбор»). Это обычная двухэтапная процедура «теги и обмен» [15] можно было бы оптимизировать после появления RMCE, который мог бы взять на себя и повысить эффективность этапа врезки.

Интеграза PhiC31 [ править ]

Без особых сомнений, Ser- интегразы являются в настоящее время предпочтительными инструментами для интеграции трансгенов в ограниченное количество хорошо изученных геномных акцепторных сайтов, которые в основном (но не всегда) имитируют сайт att P фага, поскольку они привлекают донорский вектор, содержащий att B. . В настоящее время наиболее заметным членом является PhiC31-INT с доказанным потенциалом в контексте геномов человека и мыши.

В отличие от вышеупомянутых рекомбиназ Tyr, PhiC31-INT как таковой действует однонаправленно, прочно фиксируя донорный вектор на геномно заякоренной мишени. Очевидным преимуществом этой системы является то, что она может полагаться на немодифицированные нативные донорные сайты att P (акцептор) и att B. Дополнительные преимущества (вместе с некоторыми осложнениями) могут возникнуть из-за того, что геномы мыши и человека сами по себе содержат ограниченное количество эндогенных мишеней (так называемые " attP-псевдозиты "). Имеющаяся информация свидетельствует о том, что значительные требования к последовательности ДНК позволяют интегразе распознавать меньше сайтов, чем системы интеграции на основе ретровирусов или даже транспозаз, открывая свою карьеру в качестве превосходного носителя для транспорта и вставки в ряд хорошо установленных геномных сайтов. , некоторые из которых обладают так называемыми «безопасными» свойствами. [10]

Используя факт специфических ( att P x att B) маршрутов рекомбинации, RMCE становится возможным без потребности в синтетических, гетероспецифических атт- сайтах. Однако это очевидное преимущество достигается за счет определенных недостатков, таких как отсутствие контроля над видом или направленностью входящей (донорной) кассеты. [6] Дальнейшие ограничения наложены тем фактом, что необратимость не допускает стандартные установки RMCE мультиплексирования, включая «последовательные реакции RMCE», то есть повторные замены кассет в данном локусе генома .

Перспективы и перспективы [ править ]

Аннотации геномов человека и мыши привели к идентификации> 20 000 генов, кодирующих белок, и> 3 000 генов некодирующих РНК, которые направляют развитие организма от оплодотворения через эмбриогенез до взрослой жизни. Хотя отмечается значительный прогресс, актуальность редких вариантов генов остается центральной темой исследований.

В качестве одной из наиболее важных платформ для работы с функциями генов позвоночных в крупном масштабе были созданы полногеномные генетические ресурсы мутантных мышиных ES-клеток. С этой целью в Европе и Северной Америке были основаны четыре международные программы, направленные на насыщающий мутагенез генома мыши (EUCOMM, KOMP, NorCOMM и TIGM). Эти репозитории ES-клеток, координируемые Международным консорциумом нокаут-мышей (IKSC), доступны для обмена между международными исследовательскими подразделениями. В настоящее время ресурсы включают мутации в 11 539 уникальных генах, 4 414 из которых являются условными. [14]

Соответствующие технологии сейчас достигли уровня, позволяющего распространить их на другие виды млекопитающих и стволовые клетки человека, в первую очередь на те, которые имеют статус iPS (индуцированный плюрипотент) .

См. Также [ править ]

  • Сайт-специфическая рекомбинация
  • Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой
  • Cre рекомбиназа
  • Cre-Lox рекомбинация
  • Рекомбинация FLP-FRT
  • Генетическая рекомбинация
  • Гомологичная рекомбинация

Ссылки [ править ]

  1. ^ Зауэр, Брайан; Хендерсон, Нэнси (1988). «Сайт-специфическая рекомбинация ДНК в клетках млекопитающих с помощью Cre-рекомбиназы бактериофага P1» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (14): 5166–70. Bibcode : 1988PNAS ... 85.5166S . DOI : 10.1073 / pnas.85.14.5166 . JSTOR  32380 . PMC  281709 . PMID  2839833 .
  2. ^ О'Горман, Стивен; Фокс, Дэниел Т .; Уол, Джеффри М. (1991). «Активация гена, опосредованная рекомбиназой, и сайт-специфическая интеграция в клетках млекопитающих». Наука . 251 (4999): 1351–5. Bibcode : 1991Sci ... 251.1351O . DOI : 10.1126 / science.1900642 . JSTOR 2875533 . PMID 1900642 .  
  3. ^ a b Раевский, Клаус (2007). «От мечты к реальности» . Европейский журнал иммунологии . 37 : S134–7. DOI : 10.1002 / eji.200737819 . PMID 17972357 . 
  4. ^ Бранда, Кэтрин С .; Димеки, Сьюзан М. (2004). «Говоря о революции. Влияние сайт-специфичных рекомбиназ на генетический анализ мышей». Клетка развития . 6 (1): 7–28. DOI : 10.1016 / S1534-5807 (03) 00399-X . PMID 14723844 .  CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  5. ^ a b Nern, A .; Pfeiffer, BD; Свобода, К .; Рубин, GM (2011). «Множественные новые сайт-специфические рекомбиназы для использования в манипулировании геномами животных» . Труды Национальной академии наук . 108 (34): 14198–203. Bibcode : 2011PNAS..10814198N . DOI : 10.1073 / pnas.1111704108 . PMC 3161616 . PMID 21831835 .  
  6. ^ a b c d e е Turan, S .; Боде, Дж. (2011). «Сайт-специфичные рекомбиназы: от геномных модификаций на основе меток и мишеней до модификаций на основе меток и обмена». Журнал FASEB . 25 (12): 4088–107. DOI : 10.1096 / fj.11-186940 . PMID 21891781 . 
  7. ^ Боде, Юрген; Шлейк, Томас; Ибер, Микаэла; Шубелер, Дирк; Зейблер, Йост; Снежков, Евгений; Николаев, Лев (2000). «Набор инструментов трансгенетиков: новые методы целевой модификации геномов эукариот». Биологическая химия . 381 (9–10): 801–13. DOI : 10.1515 / BC.2000.103 . PMID 11076013 . 
  8. ^ Lyznik, Leszek A .; Митчелл, Джон С .; Хираяма, Линн; Ходжес, Томас К. (1993). «Активность дрожжевой рекомбиназы FLP в протопластах кукурузы и риса» . Исследования нуклеиновых кислот . 21 (4): 969–75. DOI : 10.1093 / NAR / 21.4.969 . PMC 309231 . PMID 8451196 .  
  9. ^ Lauth, M .; Spreafico, F; Детлеффсен, К; Мейер, М (2002). «Стабильный и эффективный обмен кассет в неизбираемых условиях путем комбинированного использования двух сайт-специфичных рекомбиназ» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (21): 115e. DOI : 10.1093 / NAR / gnf114 . PMC 135837 . PMID 12409474 .  
  10. ^ a b Каров, Мариса; Калос, Мишель П (2011). «Терапевтический потенциал интегразы phiC31 как системы генной терапии». Экспертное заключение по биологической терапии . 11 (10): 1287–96. DOI : 10.1517 / 14712598.2011.601293 . PMID 21736536 . 
  11. ^ Oumard, Андре; Цяо, Цзюньхуа; Джосток, Томас; Ли, Цзяньдун; Боде, Юрген (2006). «Рекомендуемый метод использования хромосом: системы обмена кассет на основе RMCE в биотехнологии клеток животных» . Цитотехнология . 50 (1–3): 93–108. DOI : 10.1007 / s10616-006-6550-0 . PMC 3476001 . PMID 19003073 .  
  12. ^ а б Леоне, Дино П; Genoud, S.Téphane; Атанасоски, Сузана; Граузенбургер, Рейнхард; Бергер, Филипп; Мецгер, Даниэль; МакКлин, Венди Б; Шамбон, Пьер; Сутер, Ули (2003). «Тамоксифен-индуцируемые глиозависимые мыши Cre для соматического мутагенеза в олигодендроцитах и ​​шванновских клетках». Молекулярная и клеточная неврология . 22 (4): 430–40. DOI : 10.1016 / S1044-7431 (03) 00029-0 . PMID 12727441 . 
  13. ^ Koenning, M .; Джексон, S .; Hay, CM; Faux, C .; Килпатрик, Т.Дж.; Willingham, M .; Эмери, Б. (2012). «Регулирующий фактор гена миелина необходим для поддержания идентичности миелина и зрелых олигодендроцитов в ЦНС взрослого» . Журнал неврологии . 32 (36): 12528–42. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.1069-12.2012 . PMC 3752083 . PMID 22956843 .  
  14. ^ а б Брэдли, Аллан; Анастассиадис, Константинос; Аяди, Абделькадер; Бэтти, Джеймс Ф .; Белл, Синди; Бирлинг, Мари-Кристин; Боттомли, Джоанна; Браун, Стив Д .; и другие. (2012). "Ресурс функции генов млекопитающих: Международный консорциум нокаутных мышей" . Геном млекопитающих . 23 (9–10): 580–6. DOI : 10.1007 / s00335-012-9422-2 . PMC 3463800 . PMID 22968824 .  
  15. ^ Аскью, Г. Роджер; Дётчман, Томас; Лингрел, Джерри Б. (1993). «Сайт-направленные точечные мутации в эмбриональных стволовых клетках: стратегия меток и обмена генов» . Молекулярная и клеточная биология . 13 (7): 4115–24. DOI : 10,1128 / MCB.13.7.4115 . PMC 359961 . PMID 8391633 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • http://www.knockoutmouse.org/
  • Emes, RD; Goodstadt, L; Winter, EE; Понтинг, CP (2003). «Сравнение геномов человека и мыши закладывает основы зоологии генома» . Hum Mol Genet . 12 (7): 701–9. DOI : 10,1093 / HMG / ddg078 . PMID  12651866 .