Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

RMCE ( опосредованный рекомбиназой обмен кассет ) - это процедура обратной генетики, позволяющая систематически повторять модификацию геномов высших эукариот путем целевой интеграции, основанной на особенностях процессов сайт-специфической рекомбинации (SSR). Для RMCE это достигается за счет чистой замены кассеты уже существующего гена на аналогичную кассету, несущую «представляющий интерес ген» (GOI).

Генетическая модификация клеток млекопитающих - это стандартная процедура получения правильно модифицированных белков, имеющих фармацевтическое значение. Чтобы быть успешным, перенос и экспрессия трансгена должны быть высокоэффективными и иметь в значительной степени предсказуемый результат. Современные разработки в области генной терапии основаны на тех же принципах. Традиционные процедуры, используемые для переноса ГОИ, недостаточно надежны, главным образом потому, что соответствующие эпигенетические влияния недостаточно изучены: трансгены интегрируются в хромосомы с низкой эффективностью и в локусах, которые обеспечивают лишь субоптимальные условия для их экспрессии.. Как следствие, вновь введенная информация может не быть реализована (выражена), ген (ы) могут быть потеряны и / или повторно вставлены, и они могут привести клетки-мишени в нестабильное состояние. Именно здесь RMCE выходит на поле боя. Эта процедура была введена в 1994 году [1] и использует инструменты, которые дрожжи и бактериофаги [2] разработали для эффективного воспроизведения важной генетической информации:

Общие принципы [ править ]

Рисунок 1: Принцип RMCE: обмен генетическими кассетами (шаг «перевернуть») обеспечивается рекомбиназой («Flp») из дрожжей. В части B показаны мутанты (Fn) встречающегося в природе 48-п.н. FRT- сайта (F). Если генная кассета фланкирована набором этих сайтов (например, F и Fn), она может меняться местами посредством двойной реципрокной рекомбинации со второй кассетой, которая является частью обменной плазмиды (Рисунок 1, часть A). В части C показан модельный эксперимент, в котором «пустая» клетка модифицируется либо стандартной трансфекцией.подход или через RMCE. Обратите внимание, что в первом случае поражаются несколько геномных сайтов, каждый из которых дает разный уровень экспрессии (см. Широкое распределение зеленых точек). Если предварительно определенный геномный адрес используется для введения одного и того же гена-репортера, каждый клон, полученный в результате такого события, показывает сопоставимые характеристики экспрессии.

Большинство штаммов дрожжей содержат кольцевые плазмидоподобные ДНК, называемые «двухмикронными кругами». Устойчивость этих объектов обеспечивается рекомбиназой, называемой «флиппаза» или «Flp» . Четыре мономера этого фермента связываются с двумя идентичными короткими (48 п.н.) сайтами-мишенями, называемыми FRT («мишени флип-рекомбиназы»), в результате чего происходит их кроссовер . Результат такого процесса зависит от относительной ориентации участвующих FRT, приводящей к

  • инверсии последовательности , которые примыкают два идентичных , но обратно ориентированных FRT сайтов
  • удаление / разрешение последовательности , которые примыкают два одинаково ориентированных идентичными FRT с
  • неэффективная реверсия буквенного процесса, обычно называемая интеграцией или «добавлением» дополнительной части ДНК, несущей единственный сайт FRT, идентичный целевому сайту

Этот спектр вариантов может быть значительно расширен за счет создания спейсерных мутантов для удлиненных 48 п.н. сайтов FRT (заштрихованные полустрелки на рисунке 1). Каждый мутантный Fn рекомбинирует с идентичным мутантным Fn с эффективностью, равной сайтам дикого типа (F x F). Перекрестное взаимодействие (F x Fn) строго предотвращается особенностями конструкции этих компонентов. Это создает основу для ситуации, изображенной на Рисунке 1A:

  • кассета-мишень (здесь составной +/- маркер выбора) фланкирована сайтами F- и Fn. После его введения в геном клетки-хозяина охарактеризованы свойства многих сайтов интеграции (геномных «адресов») и выделены соответствующие клоны.
  • GOI (представляющий интерес ген) является частью кольцевой «плазмиды обмена» и фланкируется набором совпадающих сайтов. Эта обменная плазмида может быть введена в клетку при большом молекулярном избытке и, таким образом, будет проходить описанную реакцию обмена (RMCE-) с предварительно выбранным геномным адресом (т.е. мишенью F <+/-> Fn).
  • этот принцип RMCE представляет собой процесс, который можно повторить с той же или другой обменной плазмидой («серийный RMCE»). Обратите внимание, что RMCE вводит только одну копию GOI в заранее определенном локусе и не вводит совместно последовательности прокариотических векторов (пунктирные линии), которые в противном случае запускали бы иммунологические или эпигенетические защитные механизмы.

Эта новая процедура, впервые примененная для Tyr-рекомбиназы Flp, не только актуальна для рационального конструирования биотехнологически значимых клеточных линий, но также находит все более широкое применение для систематического получения стволовых клеток . Стволовые клетки можно использовать для замены поврежденной ткани или для создания трансгенных животных с заранее определенными свойствами.

Dual RMCE [ править ]

Ранее было установлено, что совместная экспрессия рекомбиназ Cre и Flp катализирует обмен последовательностями, фланкированными отдельными сайтами loxP и FRT, интегрированными в геном в случайном месте. Однако эти исследования не изучали, можно ли использовать такой подход для модификации условных аллелей мыши, несущих один или несколько сайтов loxP и FRT. двойной RMCE (dRMCE; Osterwalder et al., 2010) был недавно разработан как инструмент реинжиниринга, применимый к огромному количеству условных аллелей мыши, которые несут сайты loxP и FRT дикого типа и, следовательно, несовместимы с обычным RMCE. Общая стратегия dRMCE использует тот факт, что большинство условных аллелей кодируют кассету отбора, фланкированную сайтами FRT, в дополнение к сайтам loxP, которые фланкируют функционально релевантные экзоны («флокированные» экзоны).Кассета селекции, фланкированная FRT, обычно размещается вне области, фланкированной loxP, что делает эти аллели непосредственно совместимыми с dRMCE. Одновременная экспрессия рекомбиназ Cre и Flp индуцирует цис-рекомбинацию и образование удаленного аллеля, который затем служит «стыковочным сайтом», в который можно вставить замещающий вектор посредством транс-рекомбинации. Правильно замененный локус будет кодировать пользовательскую модификацию и другую кассету для отбора лекарств, фланкированную одиночными сайтами loxP и FRT. Таким образом, dRMCE представляется очень эффективным инструментом для целенаправленной реинжиниринга тысяч аллелей мыши, произведенных консорциумом IKMC.Одновременная экспрессия рекомбиназ Cre и Flp индуцирует цис-рекомбинацию и образование удаленного аллеля, который затем служит «сайтом стыковки», в который можно вставить замещающий вектор путем транс-рекомбинации. Правильно замененный локус будет кодировать пользовательскую модификацию и другую кассету для отбора лекарств, фланкированную одиночными сайтами loxP и FRT. Таким образом, dRMCE представляется очень эффективным инструментом для целенаправленной реинжиниринга тысяч аллелей мыши, произведенных консорциумом IKMC.Одновременная экспрессия рекомбиназ Cre и Flp индуцирует цис-рекомбинацию и образование удаленного аллеля, который затем служит «стыковочным сайтом», в который можно вставить замещающий вектор посредством транс-рекомбинации. Правильно замененный локус будет кодировать пользовательскую модификацию и другую кассету для отбора лекарств, фланкированную одиночными сайтами loxP и FRT. Таким образом, dRMCE представляется очень эффективным инструментом для целенаправленной реинжиниринга тысяч аллелей мыши, произведенных консорциумом IKMC.Таким образом, dRMCE представляется очень эффективным инструментом для целенаправленной реинжиниринга тысяч аллелей мыши, произведенных консорциумом IKMC.Таким образом, dRMCE представляется очень эффективным инструментом для целенаправленной реинжиниринга тысяч аллелей мыши, произведенных консорциумом IKMC.

Мультиплексирование RMCE [ править ]

Рисунок 2: Мультиплексирование RMCE . В данном примере в геном вводится кассета репортерного гена (gfp / tk / neo), фланкированная четырьмя гетероспецифическими FRT- сайтами (F5 / F3-F / Fn). Затем уникальный адрес F5 / F3 может использоваться для введения регулирующего элемента восходящего потока, а адрес F / Fn - для применения аналогичной модификации на нисходящем конце. после того, как экспрессия gfp-репортера была оптимизирована систематическими изменениями этого типа, центральную кассету репортера можно заменить на любой «представляющий интерес ген» (GOI): GOI будет фланкирован F3 и F-сайтами , соответственно и введены соответствующим образом, при этом боковые элементы останутся на своих местах

Установки мультиплексирования основаны на том факте, что каждая пара F-Fn (состоящая из сайта FRT дикого типа и мутанта под названием «n») или каждая пара Fn-Fm (состоящая из двух мутантов «m» и «n») представляет собой уникальный «адрес» в геноме. Обязательным условием является различие в четырех из восьми положений спейсера (см. Рисунок 1B). Если разница ниже этого порога, может происходить перекрестное взаимодействие между мутантами, приводящее к ошибочной делеции последовательности между гетероспецифическими (Fm / Fn или F / Fn) сайтами.

Тем временем стали доступны 13 мутантов FRT [3] [4] , которые позволяют установить несколько уникальных геномных адресов бок о бок (например, F-Fn и Fm-Fo). Эти адреса будут распознаваться донорскими плазмидами, которые были сконструированы в соответствии с теми же принципами, что позволяет проводить последовательные (но также синхронные) модификации в заранее определенных локусах . Эти модификации могут быть доведены до завершения в случае, если совместимая донорская плазмида (и) предоставляется в избытке (принципы действия массы). Рисунок 2 иллюстрирует одно использование принципа мультиплексирования: поэтапное расширение кодирующей области, в которой базовая единица экспрессии обеспечивается геномными инсуляторами , энхансерами или другими.цис- действующие элементы.

Недавний вариант общей концепции основан на PhiC31 (интеграза класса Ser) , который позволяет вводить другую цель RMCE на вторичный сайт после того, как произошла первая модификация на основе RMCE. Это связано с тем, что каждый обмен, катализируемый phiC31, разрушает сайты attP и attB, которые он адресовал [2], превращая их в сайты продуктов att R и att L , соответственно. Хотя эти изменения допускают последующую установку новых (и, скорее всего, удаленных) мишеней, они не позволяют адресовать несколько мишеней RMCE параллельно , а также не допускают «последовательных RMCE», то есть последовательных пошаговых модификаций в данном локусе генома.

Это отличается от Flp-RMCE, для которого статус FRT после RMCE соответствует их начальному состоянию. Это свойство делает возможным преднамеренную, повторяющуюся мобилизацию целевой кассеты путем добавления новой донорной плазмиды с совместимой архитектурой. Эти параметры "мультиплексирования-RMCE" открывают неограниченные возможности для последовательной и параллельной специфической модификации заранее определенных целей RMCE [5]

Приложения [ править ]

Генерация трансгенных животных [ править ]

Получение трансгенных мышей с нокаутом / -ин и их генетическая модификация с помощью RMCE. [6] [7]

Мечение и обмен кассет в клетках DG44 в суспензионной культуре [ править ]

Вставка целевой кассеты в линию клеток-хозяев млекопитающих (CHO DG44 в суспензионной культуре) и обмен с репортерной конструкцией стресса ER посредством целевой интеграции (RMCE). [8]

См. Также [ править ]

  • Технология сайт-специфической рекомбиназы
  • Сайт-специфическая рекомбинация
  • Рекомбинация FLP-FRT
  • Cre рекомбиназа
  • Cre-Lox рекомбинация
  • Генетическая рекомбинация
  • Гомологичная рекомбинация

Ссылки [ править ]

  1. ^ Schlake, Т., Боде, J. (1994). «Использование мутированных сайтов-мишеней распознавания Flp ( FRT -) для обмена кассетами экспрессии в определенных хромосомных локусах ». Биохимия . 33 (43): 12746–12751. DOI : 10.1021 / bi00209a003 . PMID  7947678 .
  2. ^ а б Бейтман, Джек Р.; Энн М. Ли; Ч.-тин Ву (июнь 2006 г.). "Сайт-специфическая трансформация дрозофилы посредством phiC31-интегразы-опосредованного кассетного обмена" . Генетика . 173 (2): 769–777. DOI : 10.1534 / genetics.106.056945 . PMC 1526508 . PMID 16547094 .  
  3. ^ Боде, J; Т. Шлейк; М. Ибер; Д. Шубелер; Дж. Зайблер; Е. Снежков; Л. Николаев (2000). «Набор инструментов трансгенетика - новые методы адресной модификации геномов эукариот». Биол. Chem . 381 (9–10): 801–813. DOI : 10.1515 / BC.2000.103 . PMID 11076013 . 
  4. ^ Turan, S .; Kuehle, J .; Schambach, A .; Baum, C .; Боде, Дж. (2010). «Мультиплексирование RMCE: универсальные расширения технологии обмена кассет, опосредованной Flp-рекомбиназой». J. Mol. Биол . 402 (1): 52–69. DOI : 10.1016 / j.jmb.2010.07.015 . PMID 20650281 . 
  5. ^ Туран, S; Дж. Боде (2011). «Сайт-специфичные рекомбиназы: от геномных модификаций на основе меток и мишеней до модификаций на основе меток и обмена». FASEB J . 25 (12): 4088–4107. DOI : 10.1096 / fj.11-186940 . PMID 21891781 . 
  6. ^ Чезари Р, Rennekampff В, Vintersten К, Вуонг Л.Г., Seibler J, J Боде, Wiebel FF, Нордгейм А (февраль 2004 года). «Мыши с нокаутом Elk-1, сконструированные путем обмена кассет, опосредованного рекомбиназой Flp». Бытие . 38 (2): 87–92. DOI : 10.1002 / gene.20003 . PMID 14994271 . 
  7. ^ Roebroek AJ, Reekmans S, Lauwers A, Feyaerts N, Smeijers L, Hartmann D (январь 2006). «Мыши с мутантным Lrp1-нокаутом, полученные с помощью опосредованного рекомбиназой обмена кассет, обнаруживают дифференциальную важность мотивов NPXY во внутриклеточном домене LRP1 для нормального развития плода» . Mol Cell Biol . 26 (2): 605–16. DOI : 10.1128 / MCB.26.2.605-616.2006 . PMC 1346909 . PMID 16382151 .  
  8. ^ Кобер л, Zehe С, J Боде (октябрь 2012 г.). «Разработка новой системы отбора на основе стресса ER для выделения высокопродуктивных клонов». Biotechnol. Bioeng . 109 (10): 2599–611. DOI : 10.1002 / bit.24527 . PMID 22510960 . 
  • Й. Боде, С. Гётце, М. Клар, К. Маас, К. Нельсен, А. Умар и С. Винкельманн (2004) BIOForum 34-36 Den Viren nachempfunden: Effiziente Modifikation von Säugerzellen.
  • Cesari F, Rennekampff V, Vintersten K, Vuong LG, Seibler J, Bode J, Wiebel FF, Nordheim A (2004). «Мыши с нокаутом Elk-1, сконструированные путем обмена кассет, опосредованного рекомбиназой Flp». Бытие . 38 (2): 87–92. DOI : 10.1002 / gene.20003 . PMID  14994271 .
  • Робрук, AJM; Reekmans, S .; Lauwers, A .; Feyaerts, N .; Smeijers, L .; Хартманн, Д. (2006). «Мутантные мыши с нокаутом Lrp1, полученные с помощью RMCE, демонстрируют дифференциальную важность мотивов NPXY во внутриклеточном домене LRP1 для нормального развития плода» . Мол. Клетка. Биол . 26 (2): 605–616. DOI : 10.1128 / MCB.26.2.605-616.2006 . PMC  1346909 . PMID  16382151 .
  • Бранда, CS; Димецки С.М. (2004). «Говоря о революции: влияние сайт-специфичных рекомбиназ на генетический анализ мышей. Разработка». Клетка развития . 6 (1): 7–28. DOI : 10.1016 / S1534-5807 (03) 00399-X . PMID  14723844 .
  • Oumard, A .; Qiao, J .; Jostock, T .; Li, J .; Боде, Дж. (2006). «Рекомендуемый метод использования хромосом: системы обмена кассет на основе RMCE в биотехнологии клеток животных» . Цитотехнология . 50 (1–3): 93–108. DOI : 10.1007 / s10616-006-6550-0 . PMC  3476001 . PMID  19003073 .
  • Qiao, J .; Oumard, A .; Wegloehner, W .; Боде, Дж. (2009). «Новые стратегии Tag-and-Exchange (RMCE) создают клоны мастер-клеток с предсказуемыми и стабильными свойствами экспрессии трансгена». J. Mol. Биол . 390 (4): 579–594. DOI : 10.1016 / j.jmb.2009.05.012 . ЛВП : 10033/76653 . PMID  19447116 .
  • Туран, Серен; Галла, Мелани; Эрнст, Эллен; Цяо, Цзюньхуа; Фолькель, Кристина; Шидльмайер, Бернхард; Зехе, Кристоф; Боде, Юрген (2011). «Рекомбиназа-опосредованный кассетный обмен (RMCE): традиционные концепции и современные проблемы». Журнал молекулярной биологии . 407 (2): 193–221. DOI : 10.1016 / j.jmb.2011.01.004 . PMID  21241707 .
  • Туран, С; Zehe, C; Kuehle, J; Цяо, Дж; Боде, Дж (2013). «Рекомбиназа-опосредованный обмен кассет (RMCE) - быстро расширяющийся набор инструментов для целевых модификаций генома». Джин . 515 (1): 1-27. DOI : 10.1016 / j.gene.2012.11.016 . PMID  23201421 .
  • Lauth, M .; Spreafico, F .; Dethleffsen, K .; Мейер, М (2002). «Стабильный и эффективный обмен кассет в неизбираемых условиях путем комбинированного использования двух сайт-специфичных рекомбиназ» . Nucleic Acids Res . 30 (21): e115. DOI : 10.1093 / NAR / gnf114 . PMC  135837 . PMID  12409474 .
  • Остервальдер, Марко; Галли, Антонелла; Розен, Барри; Скарнес, Уильям С; Целлер, Рольф; Лопес-Риос, Хавьер (2010). «Двойной RMCE для эффективной реинжиниринга мутантных аллелей мыши» . Методы природы . 7 (11): 893–895. DOI : 10.1038 / nmeth.1521 . PMC  3576631 . PMID  20953177 .

Внешние ссылки [ править ]

  • https://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111130115822.htm