Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Диаграмма, иллюстрирующая процесс разработки вакцины от птичьего гриппа с помощью методов обратной генетики

Обратная генетика - это метод молекулярной генетики, который используется для понимания функции (функций) гена путем анализа фенотипических эффектов, вызванных генной инженерией конкретных последовательностей нуклеиновых кислот в гене. Процесс идет в обратном направлении, чтобы продвигать генетические экраны классической генетики . В то время как прямая генетика стремится найти генетическую основу фенотипа или признака, обратная генетика стремится найти, какие фенотипы контролируются конкретными генетическими последовательностями.

Автоматизированная секвенирования ДНК генерирует большие объемы геномной последовательности данных относительно быстро. Многие генетические последовательности обнаруживаются раньше, чем другая, менее доступная биологическая информация. Обратная генетика пытается связать данную генетическую последовательность со специфическим воздействием на организм. [1]

Используемые методы [ править ]

Чтобы узнать влияние последовательности на фенотип или выяснить ее биологическую функцию, исследователи могут спроектировать изменение или разрушить ДНК . После того, как это изменение было внесено, исследователь может искать влияние таких изменений на весь организм . Существует несколько различных методов обратной генетики:

Направленные удаления и точечные мутации [ править ]

Сайт-направленный мутагенез - это сложный метод, который может либо изменять регуляторные области в промоторе гена, либо производить тонкие изменения кодонов в открытой рамке считывания для идентификации важных аминокислотных остатков для функции белка . [ необходима цитата ]

Physcomitrella patens (A) дикого типа и нокаутные мхи (BD): отклоняющиеся фенотипы, индуцированные в трансформантах библиотеки с нарушением генов. Физкомитреллы дикого типа и трансформированные растения выращивали на минимальной среде Кнопа для индукции дифференциации и развития гаметофоров . Для каждого растения показаны обзор (верхний ряд; масштабная полоса соответствует 1 мм) и крупный план (нижний ряд; масштабная полоса равна 0,5 мм). A: Гаплоидный мох дикого типа, полностью покрытый лиственными гаметофорами, и крупный план листа дикого типа. B – D: разные мутанты. [2]

В качестве альтернативы эту технику можно использовать для создания нулевых аллелей, чтобы ген не работал. Например, делеция гена путем нацеливания на ген ( нокаут гена ) может быть осуществлена ​​у некоторых организмов, таких как дрожжи , мыши и мох . Уникальный среди растений, у Physcomitrella patens , нокаут гена посредством гомологичной рекомбинации для создания нокаутного мха (см. Рисунок) почти так же эффективен, как и у дрожжей. [3] В случае модели дрожжей, направленные делеции были созданы в каждом несущественном гене в геноме дрожжей. [4] В случае заводамодельная система огромные библиотеки мутантов были созданы на основе конструкций разрушения генов. [5] При включении гена эндогенный экзон заменяется измененной представляющей интерес последовательностью. [6]

В некоторых случаях можно использовать условные аллели, чтобы ген функционировал нормально до тех пор, пока условный аллель не будет активирован. Это может повлечь за собой «выбивание» сайтов рекомбиназы (таких как сайты lox или frt), что вызовет делецию в интересующем гене, когда индуцируется специфическая рекомбиназа (такая как CRE, FLP). Рекомбиназы Cre или Flp можно индуцировать с помощью химических обработок, обработок тепловым шоком или ограничить их определенным набором тканей. [ необходима цитата ]

Еще одна техника, которую можно использовать, - это обработка почвы . Это метод, который сочетает в себе стандартный и эффективный метод мутагенеза с химическим мутагеном, таким как этилметансульфонат (EMS), с чувствительной техникой ДНК-скрининга, которая определяет точечные мутации в целевом гене. [ необходима цитата ]

Подавление гена [ править ]

Обнаружение молчания генов с помощью двухцепочечной РНК, также известный как РНК - интерференции (RNAi), а также развитие гена нокдауна с использованием морфолино олигонуклеотидов, сделали нарушения экспрессии генов доступный метод для многих других исследователей. Этот метод часто называют « нокдауном» гена, поскольку действие этих реагентов обычно носит временный характер, в отличие от « нокаута» генов, которое является постоянным. [ необходима цитата ]

РНКи создает специфический нокаутный эффект без фактической мутации интересующей ДНК. У C. elegans РНКи использовались для систематического вмешательства в экспрессию большинства генов в геноме. РНКи действует, направляя клеточные системы на разрушение информационной РНК-мишени (мРНК). [ необходима цитата ]

РНКи-интерференция, особенно подавление гена, стала полезным инструментом для подавления экспрессии генов и выявления и анализа их фенотипа с потерей функции. Когда мутации происходят в аллелях, функция, которую он представляет и кодирует, также мутирует и теряется; это обычно называется мутацией потери функции. [7] Способность анализировать фенотип потери функции позволяет анализировать функцию гена, когда нет доступа к мутантным аллелям. [8]

В то время как РНК - интерференция зависит от клеточных компонентов на эффективность (например , белки Dicer, комплекс RISC) простая альтернативой для гена нокдауна является морфолино антисмысловыми олигонуклеотидами. Морфолино связываются и блокируют доступ к целевой мРНК, не требуя активности клеточных белков и не обязательно ускоряя деградацию мРНК. Морфолино эффективны в системах различной сложности - от бесклеточной трансляции в пробирке до исследований in vivo на крупных моделях животных. [ необходима цитата ]

Вмешательство с использованием трансгенов [ править ]

Молекулярно - генетический подход является создание трансгенных организмов , которые сверхэкспрессируют нормальный интерес ген. Полученный фенотип может отражать нормальную функцию гена.

В качестве альтернативы можно сверхэкспрессировать мутантные формы гена, которые мешают нормальной функции гена ( дикого типа ). Например, чрезмерная экспрессия мутантного гена может привести к высоким уровням нефункционального белка, что приведет к доминантному отрицательному взаимодействию с белком дикого типа. В этом случае мутантная версия будет конкурировать за белки-партнеры дикого типа, что приведет к мутантному фенотипу.

Другие мутантные формы могут привести к образованию белка, который ненормально регулируется и является конститутивно активным (постоянно активным). Это может быть связано с удалением регуляторного домена или мутацией определенного аминокислотного остатка, который обратимо модифицируется (путем фосфорилирования , метилирования или убиквитинирования ). Любое изменение имеет решающее значение для модуляции функции белка и часто приводит к информативным фенотипам.

Синтез вакцины [ править ]

Обратная генетика играет большую роль в синтезе вакцин . Вакцины могут быть созданы путем конструирования новых генотипов инфекционных вирусных штаммов, которые уменьшают их патогенную активность в достаточной степени, чтобы усилить иммунитет у хозяина. Обратный генетический подход к синтезу вакцины использует известные вирусные генетические последовательности для создания желаемого фенотипа: вирус с ослабленной патологической активностью и сходством с текущим циркулирующим штаммом вируса. Обратная генетика обеспечивает удобный подход к традиционному методу создания инактивированных вакцин , вирусов, убитых нагреванием или другими химическими методами.

Вакцины, созданные с помощью методов обратной генетики, известны как аттенуированные вакцины , названные потому, что они содержат ослабленные (аттенуированные) живые вирусы. Аттенуированные вакцины создаются путем объединения генов нового или существующего штамма вируса с ранее ослабленными вирусами того же вида. [9] Аттенуированные вирусы создаются путем размножения живого вируса в новых условиях, таких как куриное яйцо. В результате получается вирусный штамм, который все еще жив, но не патоген для человека [10], поскольку эти вирусы оказываются дефектными в том смысле, что они не могут реплицировать свой геном в достаточной степени, чтобы размножаться и в достаточной степени заразить хозяина. Однако вирусные гены все еще экспрессируются в клетке-хозяине в течение одного цикла репликации, что позволяет развить иммунитет.[11]

Вакцина против гриппа [ править ]

Распространенный способ создания вакцины с использованием обратных генетических методов - использование плазмид для синтеза ослабленных вирусов. Этот метод чаще всего используется при ежегодном производстве вакцин против гриппа , когда система из восьми плазмид может быстро произвести эффективную вакцину. Весь геном вируса гриппа А состоит из восьми РНК. сегментов, поэтому комбинация шести аттенуированных плазмид вирусной кДНК с двумя плазмидами дикого типа позволяет сконструировать аттенуированный вакцинный штамм. Для разработки противогриппозных вакцин четвертый и шестой сегменты РНК, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу.белки, соответственно, взяты из циркулирующего вируса, в то время как остальные шесть сегментов получены из предварительно ослабленного основного штамма. Белки HA и NA обладают большим разнообразием антигенов и, следовательно, взяты из текущего штамма, для которого производится вакцина, для создания хорошо соответствующей вакцины. [9]

Последовательности кДНК вирусной РНК синтезируют из ослабленных основных штаммов с помощью ОТ-ПЦР . [9] Эта кДНК затем может быть вставлена ​​между промотором РНК-полимеразы I (Pol I) и последовательностью терминатора. Последовательность кДНК и pol I затем, в свою очередь, окружается промотором РНК-полимеразы II (Pol II) и сайтом полиаденилирования . [12]Затем всю эту последовательность вставляют в плазмиду. Шесть плазмид, полученных из кДНК аттенуированного основного штамма, котрансфицируют в клетку-мишень, часто в куриное яйцо, вместе с двумя плазмидами циркулирующего в настоящее время штамма гриппа дикого типа. Внутри клетки-мишени два «уложенных друг на друга» фермента Pol I и Pol II транскрибируют вирусную кДНК для синтеза как вирусной РНК с отрицательным смыслом, так и мРНК с положительным смыслом, эффективно создавая аттенуированный вирус. [9] Результатом является дефектный штамм вакцины, который похож на текущий штамм вируса, что позволяет хозяину вырабатывать иммунитет. Этот синтезированный вакцинный штамм можно затем использовать в качестве посевного вируса для создания дополнительных вакцин.

Преимущества и недостатки [ править ]

Вакцины, созданные на основе обратной генетики, обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами. В первую очередь это скорость производства. Из-за высокой антигенной изменчивости гликопротеинов НА и NA обратный генетический подход позволяет быстро сформулировать необходимый генотип (то есть тот, который содержит белки HA и NA, взятые из циркулирующих в настоящее время штаммов вирусов). [9] Кроме того, поскольку конечным продуктом производства ослабленной вакцины с использованием обратной генетики является живой вирус, проявляется более высокая иммуногенность, чем у традиционных инактивированных вакцин [13], которые должны быть уничтожены с помощью химических процедур перед переносом в качестве вакцины. Однако из-за живой природы аттенуированных вирусов могут возникнуть осложнения.пациенты с иммунодефицитом . [14] Также существует вероятность того, что мутация вируса может привести к тому, что вакцина снова превратится в живой незатухающий вирус. [15]

См. Также [ править ]

  • Прогрессивная генетика

Ссылки [ править ]

  1. ^ Чалфи, Мартин. Жирар, Лиза. (2007?] -). WormBook - онлайн-обзор биологии C. elegans . sn OCLC  1067052025 . Проверить значения даты в: |date=( помощь )CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  2. ^ Egener T (2002). «Высокая частота фенотипических отклонений у растений Physcomitrella patens, трансформированных библиотекой нарушения генов» . BMC Plant Biology . 2 : 6. DOI : 10,1186 / 1471-2229-2-6 . PMC 117800 . PMID 12123528 .  
  3. ^ РЭСКВ R (1998). «Физкомитрелла и арабидопсис: Давид и Голиаф обратной генетики». Trends Plant Sci . 3 (6): 209–210. DOI : 10.1016 / S1360-1385 (98) 01257-6 .
  4. ^ Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H, Anderson K, Andre B и др. (Август 1999 г.). «Функциональная характеристика генома S. cerevisiae путем делеции гена и параллельного анализа». Наука . 285 (5429): 901–6. DOI : 10.1126 / science.285.5429.901 . PMID 10436161 . 
  5. ^ Schween G, Egener T, Fritzowsky D, Granado J, Guitton MC, Hartmann N, Hohe A, Holtorf H, Lang D, Lucht JM, Reinhard C, Rensing SA, Schlink K, Schulte J, Reski R (май 2005 г.). «Крупномасштабный анализ 73 329 растений Physcomitrella, трансформированных различными библиотеками нарушения генов: параметры продукции и мутантные фенотипы». Биология растений . 7 (3): 228–37. DOI : 10,1055 / с-2005-837692 . PMID 15912442 . 
  6. ^ Manis JP (декабрь 2007). «Нокаутируй, сбивай, сбивай - генетически модифицированные мыши и Нобелевская премия». Медицинский журнал Новой Англии . Массачусетское медицинское общество . 357 (24): 2426–9. DOI : 10.1056 / NEJMp0707712 . OCLC 34945333 . PMID 18077807 .  
  7. ^ Макклин, Филипп. «Типы мутаций» . Гены и мутации . Государственный университет Северной Дакоты . Проверено 27 апреля 2015 года .
  8. ^ Ламур, Курт; Тирни, Мелинда. «Введение в обратные генетические инструменты для исследования функции генов» . APSnet . Американское фитопатологическое общество.
  9. ^ a b c d e Хоффманн, Эрих; Краусс, Скотт; Перес, Даниэль; Уэбби, Ричард; Вебстер, Роберт (2002). «Восьми плазмидная система для быстрого создания вакцин против вируса гриппа» (PDF) . Вакцина . 20 (25–26): 3165–3170. DOI : 10.1016 / s0264-410x (02) 00268-2 . PMID 12163268 - через Elsevier.  
  10. ^ Badgett MR, Auer A, Carmichael LE, Пэрриш CR, Bull JJ (октябрь 2002). «Эволюционная динамика ослабления вирусов» . Журнал вирусологии . 76 (20): 10524–9. DOI : 10.1128 / JVI.76.20.10524-10529.2002 . PMC 136581 . PMID 12239331 .  
  11. ^ Lauring А.С., Jones JO, Andino R (июнь 2010). «Рационализация разработки живых аттенуированных вирусных вакцин» . Природа Биотехнологии . 28 (6): 573–9. DOI : 10.1038 / nbt.1635 . PMC 2883798 . PMID 20531338 .  
  12. ^ Мостафа А, Kanrai Р, Петерсен Н, Ибрагим S, S Rautenschlein, Pleschka S (2015-01-23). «Эффективное создание рекомбинантных вирусов гриппа A с использованием нового подхода к преодолению генетической нестабильности сегментов HA» . PLOS ONE . 10 (1): e0116917. DOI : 10.1371 / journal.pone.0116917 . PMC 4304806 . PMID 25615576 .  
  13. ^ Stobart CC Мур ML (июнь 2014). «Обратная генетика РНК-вируса и дизайн вакцины» . Вирусы . 6 (7): 2531–50. DOI : 10,3390 / v6072531 . PMC 4113782 . PMID 24967693 .  
  14. ^ «Общие рекомендации по иммунизации» . www.cdc.gov . Проверено 1 апреля 2017 .
  15. ^ Симидзу Н, Торли В, Паладин FJ, Brussen К.А., Stambos В, Юн л, Утама А, Тано Y, Арита М, Yoshida Н, Йониама Т, Бенегас А, Roesel S, Pallansch М, Кью О, Miyamura Т (декабрь 2004 г.). «Циркуляция полиовируса вакцинного происхождения типа 1 на Филиппинах в 2001 г.» . Журнал вирусологии . 78 (24): 13512–21. DOI : 10,1128 / JVI.78.24.13512-13521.2004 . PMC 533948 . PMID 15564462 .  

Внешние ссылки [ править ]

Библиотечные ресурсы по
обратной генетике
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • От Сайт Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID):
    • Реассортировка против обратной генетики
    • Обратная генетика: создание вакцины от гриппа по частям
  • От Сайт Национального центра биотехнологической информации (NCBI):
    • Нойманн Г., Хатта М., Каваока Ю. (2003). «Обратная генетика для борьбы с птичьим гриппом». Болезни птиц . 47 (3 Suppl): 882–7. DOI : 10.1637 / 0005-2086-47.s3.882 . PMID  14575081 .
    • Нойманн Г., Фуджи К., Кино Ю., Каваока Ю. (ноябрь 2005 г.). «Усовершенствованная система обратной генетики для поколения вируса гриппа А и его значение для производства вакцин» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (46): 16825–9. DOI : 10.1073 / pnas.0505587102 . PMC  1283806 . PMID  16267134 .
    • Одзаки Х., Говоркова Е.А., Ли К., Сюн Х, Вебстер Р.Г., Уэбби Р.Дж. (февраль 2004 г.). «Генерация высокоурожайных вирусов гриппа А в клетках почек африканских зеленых мартышек (Vero) с помощью обратной генетики» . Журнал вирусологии . 78 (4): 1851–7. DOI : 10,1128 / JVI.78.4.1851-1857.2004 . PMC  369478 . PMID  14747549 .