Из Википедии, свободной энциклопедии
  (Перенаправлено с резольвазы Tn3 )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Транспозон Tn3 является 4957 пар оснований мобильный генетический элемент , найденный в прокариот . Он кодирует три белка:

Первоначально обнаруженная как репрессор транспозазы, резольваза также играет роль в облегчении репликации Tn3 (Sherratt 1989).

Транспозон фланкирован парой инвертированных повторов размером 38 п.н.

Механизм репликации [ править ]

Репликативная интеграция. Синяя стрелка = транспозон, зеленый треугольник = сайт узнавания эндонуклеазы

Шаг 1. Репликативная интеграция [ править ]

Эта первая стадия катализируется транспозазой.

Плазмида, содержащая транспозон (донорская плазмида), сливается с плазмидой-хозяином (целевой плазмидой). При этом реплицируются транспозон и короткий участок ДНК хозяина. Конечный продукт представляет собой «коинтегрируемую» плазмиду, содержащую две копии транспозона.

Шапиро (1978) [1] предложил следующий механизм этого процесса:

  1. Происходит четыре одноцепочечных расщепления - по одному на каждой цепи донорной плазмиды и по одному на каждой цепи целевой плазмиды.
  2. Донорская и целевая плазмиды лигируются вместе, но есть две одноцепочечные области из-за расположения исходных расщеплений.
  3. Репликация ДНК делает одноцепочечные области двухцепочечными, используя существующую цепь в качестве матрицы. Именно на этой стадии реплицируется транспозон.
    NB Схема не предназначена для точного представления трехмерной структуры.

На диаграммах справа показано, как положения расщеплений приводят к репликации определенных областей после слияния плазмид.

Шаг 2 - Разрешение [ править ]

Реакция, катализируемая резольвазой Tn3

Чтобы разделить молекулы-хозяева и молекулы-мишени, резольваза Tn3 выполняет сайт-специфическую рекомбинацию между старой и новой копиями транспозона в определенном сайте, называемом res , который присутствует в каждой копии транспозона. Res имеет длину 114 п.н. и состоит из 3 субсайтов, а именно сайтов I, II и III. Каждый из этих сайтов имеет разную длину (28, 34 и 25 п.н. соответственно), и они неравномерно распределены между сайтами I и II 22 п.н. и только 5 п.н. между сайтами II и III. Сайты состоят из инвертированных повторяющихся мотивов, фланкирующих центральную последовательность переменной длины. Эти мотивы действуют как сайты связывания для резольвазы, так что каждый сайт связывает димер резольвазы, но с разным сродством и, вероятно, с немного другой архитектурой комплекса белок-ДНК. [2] [3] Все три субсайта необходимы для рекомбинации.

При рекомбинации два непосредственно повторяющихся сайта res с димерами резольвазы, связанными с каждым участком, объединяются, образуя большую сложную структуру, называемую синаптосомой. Резолваза, связанная с сайтами II и III, инициирует сборку этого комплекса. В этой структуре, точная архитектура которой до сих пор неясна, два сайта res переплетены таким образом, что сопоставляются две копии сайта I, позволяя димерам резольвазы связываться с каждым сайтом с образованием тетрамера. Опять же, это взаимодействие между димерами резольвазы, связанными в дополнительных сайтах (сайты II и III), и резольвазой в сайте I, которое заставляет два димера синапсировать и формировать тетрамер. После образования тетрамера он активируется, и верхняя и нижняя цепи ДНК одновременно расщепляются в середине сайта I с выступом в 2 п.н.Обмен цепями происходит по еще неизвестному механизму, в результате чего получается вращение на 180 °. Затем за обменом цепей следует религия (Stark et al., 1992). Рекомбинация между двумя непосредственно повторяющимися сайтами res разделяет или разрешает «коинтеграцию» на две исходные молекулы, каждая из которых теперь содержит копию транспозона Tn3. После разделения эти две молекулы остаются связанными в виде простой двухузловой катенаны, которую можно легко разделить.После разделения эти две молекулы остаются связанными в виде простой двухузловой катенаны, которую можно легко разделить.После разделения эти две молекулы остаются связанными в виде простой двухузловой катенаны, которую можно легко разделить.in vivo с помощью топоизомеразы типа II (Grindley 2002). Система резольвазы дикого типа абсолютно требует суперспирального субстрата и того, чтобы сайты рекомбинации были ориентированы в прямом повторе на одной и той же молекуле ДНК. Однако был выделен ряд «дерегулированных» или «гиперактивных» мутантов, которые утратили потребность в дополнительных сайтах. Эти мутанты способны катализировать рекомбинацию только между двумя копиями сайта I, что в основном уменьшает размер сайта рекомбинации с 114 до 28 пар оснований. [4] [5] Более того, эти мутанты не имеют требований к суперспирализации или связности (Arnold et al., 1999) и, как было показано, работают в клетках млекопитающих. [6]Гиперактивные мутанты резольвазы до сих пор доказали свою полезность в создании резольваз с измененной специфичностью последовательности [7], но также и в структурных исследованиях. [8]

Полная реакция рекомбинации резольвазы может быть воспроизведена in vitro , требуя только резольвазы, субстратной ДНК и поливалентных катионов, используя либо белок дикого типа, либо гиперактивные мутанты. [4] [9]

Гиперактивные мутанты резольвазы, в случае их дальнейшего развития, могут стать альтернативой Cre и FLP , наиболее часто используемым системам рекомбинации в молекулярной биологии на сегодняшний день.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Шапиро, Джеймс (апрель 1979 г.). «Молекулярная модель транспозиции и репликации бактериофага Mu и других мобильных элементов» . PNAS . 76 (4): 1933–1937. Bibcode : 1979PNAS ... 76.1933S . DOI : 10.1073 / pnas.76.4.1933 . PMC  383507 . PMID  287033 .
  2. ↑ Abdel-Meguid SS, Grindley ND, Templeton NS, Steitz TA (апрель 1984). «Расщепление сайт-специфической рекомбинации белка гамма-дельта-резольвазой: меньший из двух фрагментов специфически связывает ДНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 81 (7): 2001–5. Bibcode : 1984PNAS ... 81.2001A . DOI : 10.1073 / pnas.81.7.2001 . PMC 345424 . PMID 6326096 .  
  3. ^ Blake DG, Boocock MR, Sherratt DJ, Старк WM (сентябрь 1995). «Совместное связывание мономеров резольвазы Tn3 с функционально асимметричным сайтом связывания». Curr. Биол . 5 (9): 1036–46. DOI : 10.1016 / S0960-9822 (95) 00208-9 . PMID 8542280 . 
  4. ^ a b Арнольд PH, Блейк Д.Г., Гриндли Н.Д., Букок М.Р., Старк В.М. (март 1999 г.). «Мутанты резольвазы Tn3, которым не требуются дополнительные сайты связывания для активности рекомбинации» . EMBO J . 18 (5): 1407–14. DOI : 10.1093 / emboj / 18.5.1407 . PMC 1171230 . PMID 10064606 .  
  5. ^ Берк ME, Арнольд PH, He J и др. (Февраль 2004 г.). «Активирующие мутации маркеров Tn3-резольвазы, важные для рекомбинационного катализа и его регуляции» . Мол. Microbiol . 51 (4): 937–48. DOI : 10.1046 / j.1365-2958.2003.03831.x . PMID 14763971 . 
  6. ^ Schwikardi M, Droge P (апрель 2000). «Сайт-специфическая рекомбинация в клетках млекопитающих, катализируемая мутантами гаммадельта-резольвазы: последствия для топологии эписомальной ДНК». FEBS Lett . 471 (2–3): 147–50. DOI : 10.1016 / S0014-5793 (00) 01394-6 . PMID 10767411 . 
  7. ^ Akopian A, Он J, Boocock MR, Старк WM (июль 2003). «Химерные рекомбиназы с продуманным распознаванием последовательности ДНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 100 (15): 8688–91. Bibcode : 2003PNAS..100.8688A . DOI : 10.1073 / pnas.1533177100 . PMC 166373 . PMID 12837939 .  
  8. ^ Li W, S Kamtekar, Сюн Y, Саркис GJ, Grindley ND, Steitz TA (август 2005). «Структура тетрамера синаптической гаммадельта-резольвазы, ковалентно связанного с двумя расщепленными ДНК». Наука . 309 (5738): 1210–5. Bibcode : 2005Sci ... 309.1210L . DOI : 10.1126 / science.1112064 . PMID 15994378 . 
  9. ^ Рид Р., Grindley ND (сентябрь 1981). «Опосредованная транспозоном сайт-специфическая рекомбинация in vitro: расщепление ДНК и связывание белок-ДНК в сайте рекомбинации». Cell . 25 (3): 721–8. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (81) 90179-3 . PMID 6269756 . 
  • Шерратт, DJ (1989). Tn3 и родственные мобильные элементы: сайт-специфическая рекомбинация и транспозиция. In Berg, DE, Howe, M. (eds) Mobile DNA. Американское общество микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 163–184.
  • Гриндли, NDF (2002). Движение Tn3-подобных элементов: транспонирование и разрешение коинтеграции. In Mobile DNA II, Craig, N., Craigie, R., Gellert, M. и Lambowitz, A. (ed.), Стр. 272–302. ASM Press, Вашингтон, округ Колумбия, США