Профилирование ДНК - это определение профиля ДНК для юридических и следственных целей. Методы анализа ДНК менялись много раз за прошедшие годы по мере того, как технологии совершенствовались и позволяют определять больше информации с меньшим количеством исходного материала. Современный анализ ДНК основан на статистическом расчете редкости полученного профиля в популяции.
Профилирование ДНК, наиболее известное как инструмент судебно-медицинских расследований, также может использоваться не для криминалистических целей. Тестирование на отцовство и исследование генеалогии человека - это лишь два из несудебных видов использования профилирования ДНК.
История
Методы создания профиля ДНК были разработаны Алеком Джеффрисом и его командой в 1984 году [1].
Методы
Устаревшие методы
RFLP анализ
Первым истинным методом профилирования ДНК был анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Первое использование RFLP-анализа в судебно-медицинской экспертизе произошло в 1985 году в Соединенном Королевстве. [2] В этом типе анализа использовались тандемные повторы с переменным числом тандемных повторов (VNTR), чтобы различать людей. VNTR распространены по всему геному и состоят из одной и той же последовательности ДНК, повторяющейся снова и снова. [3] У разных людей может быть разное количество повторов в определенном месте генома. [2] Например, у человека A может быть четыре, а у человека B - 5 повторов. Различия были визуализированы с помощью процесса, называемого гель-электрофорезом . Более мелкие фрагменты пройдут через гель дальше, чем более крупные фрагменты, разделяющие их. [4] Эти различия использовались, чтобы различать людей, и когда несколько сайтов VNTR работали вместе, анализ RFLP имеет высокую степень индивидуализирующей способности. [5]
Процесс анализа RFLP был чрезвычайно трудоемким и из-за длины используемых повторов, от 9 до 100 пар оснований, [3] [6] методы амплификации, такие как полимеразная цепная реакция, не могли быть использованы. Это ограничивало ПДРФ образцами, в которых для начала уже было доступно большее количество ДНК, и которые плохо работали с деградировавшими образцами. [7] ПДРФ-анализ был основным типом анализа, выполнявшимся в большинстве лабораторий судебной экспертизы, прежде чем он был окончательно отменен и заменен более новыми методами. ФБР полностью отказалось от него в 2000 году и заменило его анализом STR. [8]
Альфа-тестирование DQ
Разработанный в 1991 году [8] альфа-тест DQ был первым методом судебной экспертизы ДНК, в котором использовалась полимеразная цепная реакция. [9] Этот метод позволил использовать гораздо меньше клеток, чем анализ ПДРФ, что сделало его более полезным для мест преступлений, где не было большого количества материала ДНК, которое требовалось ранее. [10] Локус (или местоположение) DQ альфа 1 также был полиморфным и имел несколько различных аллелей, которые можно было использовать для ограничения круга лиц, которые могли дать такой результат, и увеличения вероятности исключения. [11]
Альфа-локус DQ был объединен с другими локусами в коммерчески доступном наборе под названием Polymarker в 1993 году. [12] Полимаркер был предшественником современных мультиплексирующих наборов и позволял исследовать несколько разных локусов с помощью одного продукта. Будучи более чувствительным, чем анализ RFLP, Polymarker не обладал такой же дискриминирующей способностью, как предыдущий анализ RFLP. [12] К 1995 году ученые попытались вернуться к анализу на основе VNTR в сочетании с технологией ПЦР, названной полиморфизмом длины амплифицированного фрагмента (AmpFLP). [8]
AmpFLP
AmpFLP был первой попыткой связать анализ VNTR с ПЦР для судебной экспертизы. Этот метод использовал более короткие VNTR, чем анализ RFLP, от 8 до 16 пар оснований. Более короткие размеры пары оснований AmpFLP были разработаны, чтобы лучше работать с процессом амплификации ПЦР. [6] Была надежда, что этот метод позволит реализовать различительную способность анализа RFLP с возможностью обработки образцов, которые имеют меньшее количество матричной ДНК для работы или которые были иным образом деградированы. Тем не менее, только несколько локусов были проверены для криминалистических приложений для работы с анализом AmpFLP, поскольку судебно-медицинские лаборатории быстро перешли к другим методам, ограничив его способность распознавания для криминалистических образцов. [13]
В конечном итоге этот метод так и не получил широкого распространения, хотя он все еще используется в небольших странах из-за его более низкой стоимости и более простой установки по сравнению с более новыми методами. [14] [15] К концу 1990-х лаборатории начали переходить на новые методы, включая STR-анализ. В них использовались даже более короткие фрагменты ДНК, и их можно было более надежно амплифицировать с помощью ПЦР, при этом сохраняя и улучшая дискриминационную силу старых методов. [8]
Текущие методы
STR анализ
Анализ коротких тандемных повторов (STR) - это основной вид судебно-медицинского анализа ДНК, выполняемый в современных лабораториях ДНК. STR-анализ основан на RFLP и AmpFLP, используемых в прошлом, путем уменьшения размера повторяющихся единиц до 2–6 пар оснований и объединения нескольких разных локусов в одну реакцию ПЦР. Эти наборы для мультиплексного анализа могут производить значения аллелей для десятков различных локусов по всему геному, одновременно ограничивая количество времени, необходимое для получения полного индивидуального профиля. STR-анализ стал золотым стандартом для профилирования ДНК и широко используется в криминалистических приложениях.
STR-анализ также может быть ограничен только Y-хромосомой . Анализ Y-STR может использоваться в случаях, связанных с отцовством, или в семейном поиске, поскольку Y-хромосома идентична по отцовской линии (за исключением случаев, когда произошла мутация ). Некоторые наборы для мультиплексирования объединяют как аутосомные, так и Y-STR локусы в один набор, что дополнительно сокращает время, необходимое для получения большого количества данных.
секвенирование мтДНК
Секвенирование митохондриальной ДНК - это специализированный метод, в котором используется отдельная митохондриальная ДНК, присутствующая в большинстве клеток. Эта ДНК передается по материальной линии и не уникальна между людьми. Однако из-за количества митохондрий, присутствующих в клетках, анализ мтДНК можно использовать для сильно деградированных образцов или образцов, для которых STR-анализ не дает достаточно данных, чтобы быть полезными. мтДНК также присутствует в местах, где аутосомная ДНК может отсутствовать, например, в стержнях волос.
Из-за повышенной вероятности заражения при работе с мтДНК немногие лаборатории обрабатывают образцы митохондрий. Те, у кого есть специальные протоколы, которые дополнительно отделяют разные образцы друг от друга, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Быстрая ДНК
Rapid DNA - это технология «мазок в профиль», которая полностью автоматизирует весь процесс выделения, амплификации и анализа ДНК. Инструменты Rapid DNA могут перейти от мазка к профилю ДНК всего за 90 минут и устраняют необходимость в обученных ученых для выполнения этого процесса. Эти инструменты изучаются для использования в процессе регистрации правонарушителей, что позволит полицейским получить профиль ДНК арестованного.
Недавно в США был принят Закон о Rapid DNA от 2017 года , который предписывает ФБР создавать протоколы для внедрения этой технологии по всей стране. В настоящее время ДНК, полученная с помощью этих инструментов, не может быть загружена в национальные базы данных ДНК, поскольку они не анализируют достаточное количество локусов, чтобы соответствовать стандартному порогу. Однако несколько полицейских агентств уже используют инструменты Rapid DNA для сбора образцов у людей, арестованных в их районе. Эти местные базы данных ДНК не подчиняются федеральным или государственным постановлениям.
Массивно параллельное секвенирование
Массово-параллельное секвенирование (MPS), также известное как секвенирование следующего поколения, основано на STR-анализе путем введения прямого секвенирования локусов. Вместо количества повторов, присутствующих в каждом месте, MPS даст ученому фактическую последовательность пары оснований. Теоретически MPS обладает способностью различать однояйцевых близнецов, поскольку случайные точечные мутации будут обнаруживаться в повторяющихся сегментах, которые не будут обнаружены традиционным STR-анализом.
Редкость профиля
Когда профиль ДНК используется в качестве доказательств, предоставляется статистика совпадений, которая объясняет, насколько редок профиль в популяции. В частности, эта статистика представляет собой вероятность того, что человек, случайно выбранный из популяции, будет иметь этот конкретный профиль ДНК. Это не вероятность того, что профиль "соответствует" кому-то . Существует несколько различных методов определения этой статистики, и каждый из них используется различными лабораториями в зависимости от их опыта и предпочтений. Однако расчет отношения правдоподобия становится предпочтительным методом по сравнению с двумя другими наиболее часто используемыми методами: случайный человек не исключен и комбинированная вероятность включения. Статистика совпадений особенно важна при интерпретации смеси, когда в профиль ДНК участвует более одного участника. Когда эти статистические данные приводятся в зале суда или в лабораторных отчетах, они обычно приводятся для трех наиболее распространенных рас в этой конкретной области. Это связано с тем, что частоты аллелей в разных локусах меняются в зависимости от происхождения человека. https://strbase.nist.gov/training/6_Mixture-Statistics.pdf
Случайный мужчина не исключен
Вероятность, полученная с помощью этого метода, - это вероятность того, что человек, случайно выбранный из совокупности, не может быть исключен из анализируемых данных. Этот тип статистики совпадений легко объяснить в зале суда лицам, не имеющим научного опыта, но он также теряет много различительной способности, поскольку не принимает во внимание генотип подозреваемого. Этот подход обычно используется, когда образец деградирован или содержит так много участников, что единый профиль не может быть определен. Это также полезно для объяснения непрофессионалам, поскольку метод получения статистики прост. Однако из-за своей ограниченной способности распознавания RMNE обычно не выполняется, если не может быть использован другой метод. RMNE не рекомендуется использовать в данных, указывающих на наличие смеси.
Комбинированная вероятность включения / исключения
Комбинированная вероятность включения или исключения вычисляет вероятность того, что случайный, неродственный человек будет вносить вклад в профиль ДНК или смесь ДНК. В этом методе статистика для каждого отдельного локуса определяется с использованием статистики населения, а затем объединяется для получения общего CPI или CPE. Эти вычисления повторяются для всех доступных локусов со всеми доступными данными, а затем каждое значение умножается, чтобы получить общую комбинированную вероятность включения или исключения. Поскольку значения перемножаются, с помощью CPI можно получить очень маленькие числа. CPI или CPE считается приемлемым статистическим расчетом, когда указана смесь. https://www.promega.com/-/media/files/resources/conference-proceedings/ishi-15/parentage-and-mixture-statistics-workshop/generalpopulationstats.pdf?la=en
Пример расчета для профиля с одним источником
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 16 при vWA = .10204
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 17 при vWA = 0,26276
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 14 и 17 (P) = 0,10204 + 0,26276 = 0,3648
Вероятность присутствия всех других аллелей (Q) = 1 - P или 1 - 0,3648 = 0,6352
Вероятность исключения для vWA = Q 2 + 2Q (1-Q) или .6352 2 + 2 (.6352) (1 - .6352) = 0,86692096 ≈ 86,69%
Вероятность включения для vWA = 1 - CPE или 1 - .86692096 = .13307904 ≈ 13,31%
Пример расчета профиля смеси
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 14 при vWA = .10204
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 15 при vWA = 0,11224
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 16 при vWA = .20153
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 19 при vWA = 0,08418
Вероятность того, что европеоид имеет аллель 14, 15, 16 или 19 (P) = .10204 + .11224 + .20153 + .08418 = .49999
Вероятность присутствия всех других аллелей (Q) = 1 - P или 1 - .49999 = .50001
Вероятность исключения для vWA = Q 2 + 2Q (1-Q) или 0,50001 2 + 2 (.50001) (1 - .50001) = 0,7500099999 ≈ 75%
Вероятность включения для vWA = 1 - CPE или 1 - .7500099999 = .2499900001 ≈ 25%
Отношение правдоподобия
Отношения правдоподобия (LR) - это сравнение двух разных вероятностей, чтобы определить, какая из них более вероятна. Когда речь идет о судебном разбирательстве, LR представляет собой вероятность аргумента обвинения по сравнению с вероятностью аргумента защиты с учетом их исходных предположений. В этом сценарии вероятность обвинения часто равна 1, поскольку предполагается, что обвинение не будет преследовать подозреваемого, если они не будут абсолютно уверены (100%) в том, что у них есть нужное лицо. Отношения правдоподобия становятся все более распространенными в лабораториях из-за их полезности при представлении статистики для данных, указывающих на нескольких участников, а также их использования в программном обеспечении вероятностного генотипирования, которое предсказывает наиболее вероятные комбинации аллелей с учетом набора данных.
Недостатки использования отношений правдоподобия заключаются в том, что они очень трудно понять, как аналитики пришли к определенному значению, а математика становится очень сложной по мере того, как в уравнения вводится больше данных. Чтобы бороться с этими проблемами в зале суда, некоторые лаборатории установили «вербальную шкалу», которая заменяет действительное числовое значение отношения правдоподобия.
Рекомендации
- ^ Макки, Робин (23 мая 2009). «Момент эврики, который привел к открытию дактилоскопии ДНК» . Хранитель . Проверено 29 октября 2017 года .
- ^ а б «Типирование ДНК с помощью анализа RFLP» . Национальный центр судебных технологий. 2005. Архивировано 3 января 2015 года . Проверено 10 ноября 2017 года .
- ^ а б Гриффитс, Энтони Дж. Ф.; Левонтин, Ричард С .; Гелбарт, Уильям М .; Миллер, Джеффри Х. Современный генетический анализ: объединение генов и геномов (второе изд.). WH Freeman and Company. п. 274 . Проверено 10 ноября 2017 года .
- ^ Фишер, Барри AJ (2005). Методы исследования места преступления (седьмое изд.). CRC Press. п. 240 . Проверено 11 ноября 2017 года .
- ^ Рудин, Нора; Инман, Кейт (2002). Введение в судебно-медицинский анализ ДНК (второе изд.). CRC Press. п. 41 . Проверено 11 ноября 2017 года .
- ^ а б Джеймс, Стюарт Х .; Нордби, Джон Дж., Ред. (2005). Судебная медицина: Введение в научные и следственные методы (второе изд.). Тейлор и Фрэнсис. п. 286 . Проверено 10 ноября 2017 года .
- ^ «Недостатки» . Национальный центр судебных технологий. 2005. Архивировано 2 января 2015 года . Проверено 10 ноября 2017 года .
- ^ а б в г Тилстон, Уильям Дж .; Сэвидж, Кэтлин А .; Кларк, Ли А. (2006). Судебная медицина: энциклопедия истории, методов и приемов . ABC CLIO. п. 49 . Проверено 30 октября 2017 года .
- ^ Райли, Дональд Э. (6 апреля 2005 г.). «ДНК-тестирование: введение для не-ученых - иллюстрированное объяснение» . Проверено 29 октября 2017 года .
- ^ Макклинток, Дж. Томас (2008). Судебно-медицинский анализ ДНК: лабораторное руководство . CRC Press. п. 64 . Проверено 29 октября 2017 года .
- ^ Блейк, E; Михалович, Дж; Hiquchi, R; Уолш, П.С.; Эрлих, Х (май 1992 г.). «Амплификация полимеразной цепной реакции (ПЦР) и типирование альфа-олигонуклеотидов человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) -DQ в образцах биологических доказательств: опыт работы». Журнал судебной медицины . 37 (3): 700–726. PMID 1629670 .
- ^ а б «ДК-Альфа» . Национальный центр судебных технологий. 2005. Архивировано 10 ноября 2014 года . Проверено 30 октября 2017 года .
- ^ Bär, W .; Fiori, A .; Росси, У., ред. (Октябрь 1993 г.). Достижения судебной гемогенетики . 15-й Конгресс Международного общества судебной гемогенетики. п. 255 . Проверено 10 ноября 2017 года .
- ^ "AmpFLPs" . Национальный центр судебных технологий. 2005. Архивировано 21 ноября 2014 года . Проверено 5 ноября 2017 года .
- ^ «Методы дактилоскопии ДНК» . Fingerprinting.com . Проверено 5 ноября 2017 года .