Система клонирования Gateway , изобретенная и коммерциализированная Invitrogen с конца 1990-х годов, представляет собой метод молекулярной биологии, который позволяет исследователям эффективно переносить ДНК-фрагменты между плазмидами, используя собственный набор рекомбинационных последовательностей, сайты Gateway att и два патентованных фермента. смеси, называемые «LR Clonase» и «BP Clonase». Технология клонирования шлюза позволяет переносить фрагменты ДНК между разными векторами клонирования при сохранении рамки считывания . Используя шлюз, можно клонировать субклонСегменты ДНК для функционального анализа. Система требует первоначальной вставки фрагмента ДНК в плазмиду с двумя фланкирующими последовательностями рекомбинации, называемыми «att L 1» и «att L 2», для разработки «клона входа в шлюз» (специальная номенклатура Invitrogen).
Большие архивы клонов Gateway Entry, содержащие подавляющее большинство ORF ( открытые рамки считывания ) человека, мыши и крысы , были клонированы из библиотек кДНК человека или химически синтезированы для поддержки исследовательского сообщества с использованием финансирования NIH (Национальные институты здравоохранения) (например, Коллекция генов млекопитающих, http://mgc.nci.nih.gov/ ). Наличие этих генных кассет в стандартной плазмиде для клонирования Gateway помогает исследователям быстро переносить эти кассеты в плазмиды, которые облегчают анализ функции генов. Клонирование шлюза требует больше времени для начальной настройки и дороже, чем традиционные методы клонирования с помощью ферментов рестрикции и лигазы, но оно экономит время и предлагает более простое и высокоэффективное клонирование для последующих приложений.
Эта технология была широко принята сообществом исследователей наук о жизни, особенно для приложений, требующих переноса тысяч фрагментов ДНК в плазмиду одного типа (например, содержащую промотор CMV для экспрессии белка в клетках млекопитающих) или для переноса один фрагмент ДНК во множество различных типов плазмид (например, для экспрессии белков бактерий, насекомых и млекопитающих).
Основные шаги
Первым шагом клонирования шлюза является подготовка клона входа шлюза. Входные клоны часто делаются в два этапа:
1) Последовательности Gateway attB1 и attB2 добавляются к 5'- и 3'-концу фрагмента гена, соответственно, с использованием специфичных для генов праймеров ПЦР и ПЦР- амплификации;
2) продукты ПЦР-амплификации затем смешивают со специальными плазмидами, называемыми Gateway «Донорные векторы» (номенклатура Invitrogen), и запатентованной смесью ферментов «BP Clonase». Смесь ферментов катализирует рекомбинацию и вставку продукта ПЦР, содержащего att-B-последовательность, в сайты рекомбинации att P в векторе-доноре шлюза. Как только кассета является частью целевой плазмиды, она называется «входным клоном» в номенклатуре шлюза, а рекомбинационные последовательности упоминаются как шлюз типа «att L».
Кассета гена в клоне Gateway Entry затем может быть просто и эффективно перенесена в любой вектор-адресат шлюза (номенклатура Invitrogen для любой плазмиды Gateway, которая содержит последовательности рекомбинации Gateway «att R» и такие элементы, как промоторы и метки эпитопа, но не открытые рамки считывания ), используя запатентованная смесь ферментов «LR Clonase». Созданы тысячи плазмид Gateway Destination, которые бесплатно распространяются среди исследователей по всему миру. Векторы-адресаты шлюза аналогичны классическим векторам экспрессии, содержащим несколько сайтов клонирования, перед вставкой интересующего гена с использованием переваривания рестриктазами и лигирования. Векторы- адресаты шлюза коммерчески доступны от Invitrogen, EMD ( Novagen ) и Covalys.
Поскольку при клонировании Gateway используются запатентованные последовательности рекомбинации и патентованные смеси ферментов, доступные только от Invitrogen, эта технология не позволяет исследователям менять поставщиков и способствует эффекту блокировки всех таких запатентованных процедур.
Подводя итог различным этапам клонирования шлюза:
- Реакция шлюзового ВР: продукт ПЦР с фланкирующими сайтами att B (на этом этапе также могут использоваться другие методы выделения ДНК, такие как рестрикционное расщепление) + донорный вектор, содержащий сайты att P + клоназа ВР => входной клон шлюза, содержащий сайты att L , фланкирующий интересующий ген
- Реакция шлюзового LR: входной клон, содержащий сайты att L + целевой вектор, содержащий сайты att R, а также промоторы и теги + клоназа LR => клон экспрессии, содержащий сайты att B, фланкирующий интересующий ген, готовый для экспрессии гена.
Смотрите также
- Клонирование
- Кассета шлюза
- Субклонирование
Рекомендации
- [1]
- Хартли Дж. Л., Темпл Г. Ф., Браш Массачусетс (ноябрь 2000 г.). «Клонирование ДНК с использованием сайт-специфической рекомбинации in vitro» . Genome Res . 10 (11): 1788–95. DOI : 10.1101 / gr.143000 . PMC 310948 . PMID 11076863 .
- Катцен Ф (апрель 2007 г.). "Gateway (®) рекомбинационное клонирование: биологическая операционная система". Экспертное мнение Drug Discov . 2 (4): 571–89. DOI : 10.1517 / 17460441.2.4.571 . PMID 23484762 .
- Фрейлер Ф., Стеттлер Т., Мейерхофер М., Ледер Л., Майр Л. М. (июнь 2008 г.). «Разработка новой векторной системы на основе шлюза для эффективной мультипараллельной экспрессии белков в Escherichia coli». Protein Expr. Purif . 59 (2): 232–41. DOI : 10.1016 / j.pep.2008.02.003 . PMID 18375142 .