В молекулярной биологии , субклонирование является методом , используемым для перемещения определенной последовательности ДНК из родительского вектора к вектору назначения .
Субклонирование не следует путать с молекулярным клонированием , родственным методом.
Процедура [ править ]
Рестрикционные ферменты используются для вырезания интересующего гена ( вставки ) из родительского. Вставка очищается, чтобы изолировать ее от других молекул ДНК. Распространенным методом очистки является выделение из геля . Затем количество копий гена амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Одновременно те же рестрикционные ферменты используются для переваривания (разрезания) целевого продукта. Идея использования тех же рестрикционных ферментов заключается в создании дополнительных липких концов , которые впоследствии облегчат лигирование . Фосфатазы , обычно телячьей кишечной щелочной фосфатазы (CIAP), также добавляется , чтобы предотвратить самолигирование вектора назначения. Переваренный вектор-адресат выделяют / очищают.
Затем вставку и целевой вектор смешивают вместе с ДНК-лигазой. Типичное молярное соотношение вставляемых генов к векторам назначения составляет 3: 1; [1] за счет увеличения концентрации вставки самолигирование еще больше снижается. После выдерживания реакционной смеси в течение заданного количества времени при определенной температуре (в зависимости от размера лигируемых цепей; для получения дополнительной информации см. ДНК-лигаза ) вставка должна быть успешно включена в целевую плазмиду .
Амплификация плазмиды продукта [ править ]
Плазмида часто трансформируется в бактерию, подобную E. coli . В идеале, когда бактерия делит, плазмида также должна реплицироваться. В лучшем случае каждая бактериальная клетка должна иметь несколько копий плазмиды. После того, как большое количество бактериальных колоний вырастет, их можно мини-препарировать для сбора плазмидной ДНК.
Выбор [ править ]
Чтобы гарантировать рост только трансформированных бактерий (которые несут желаемые плазмиды для сбора), в векторе назначения для отбора используют маркерный ген . Типичные гены-маркеры предназначены для устойчивости к антибиотикам или биосинтеза питательных веществ.. Так, например, «маркерный ген» может быть для устойчивости к антибиотику ампициллину. Если бы бактерии, которые должны были улавливать желаемую плазмиду, уловили желаемый ген, они также содержали бы «маркерный ген». Теперь бактерии, которые захватили плазмиду, смогут расти в ампициллине, тогда как бактерии, которые не уловили желаемую плазмиду, все еще будут уязвимы для разрушения ампициллином. Следовательно, будут «отобраны» успешно трансформированные бактерии.
Пример: субклонирование бактериальной плазмиды [ править ]
В этом примере ген из библиотеки генов млекопитающих будет субклонирован в бактериальную плазмиду (целевую платформу). Бактериальная плазмида - это часть кольцевой ДНК, которая содержит регуляторные элементы, позволяющие бактериям производить генный продукт ( экспрессию гена ), если он помещен в правильное место в плазмиде. Сайт продукции фланкирован двумя сайтами разрезания рестрикционного фермента «А» и «В» с несовместимыми липкими концами.
ДНК млекопитающих не имеет этих сайтов рестрикции, поэтому они встраиваются с помощью ПЦР с перекрывающимся расширением . Праймеры предназначены для аккуратного размещения сайтов рестрикции, так что кодирование белка происходит в рамке считывания, и минимум дополнительных аминокислот имплантируется по обе стороны от белка.
И продукт ПЦР, содержащий ген млекопитающего с новыми сайтами рестрикции, и целевую плазмиду подвергают рестрикционному расщеплению, а продукты расщепления очищают гель-электрофорезом .
Продукты переваривания, которые теперь содержат совместимые липкие концы друг с другом (но несовместимые липкие концы сами с собой), подвергаются лигированию, создавая новую плазмиду, которая содержит фоновые элементы исходной плазмиды с другой вставкой.
Плазмида трансформируется в бактерии, и идентичность вставки подтверждается секвенированием ДНК .
См. Также [ править ]
- Клонирование
- Молекулярное клонирование
- Полимеразной цепной реакции
- Клонирование ТА
Ссылки [ править ]
- ^ Уильямс, Стивен А .; и другие. (2006). Лабораторные исследования молекулярной биологии . п. 213. ISBN 9780763733292.
